楊霽虹，周漢琛，劉亞芹，王 輝，黃建琴，雷攀登

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，安徽 黃山 245000）

紅茶起源于中國，國內(nèi)紅茶主要有祁紅、閩紅、滇紅、寧紅和英德紅茶等。紅茶經(jīng)過萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥等工序制成，具有香高味甜、“紅湯紅葉”的特點。紅茶對人類疾病預(yù)防有一定作用，具有抗氧化、預(yù)防心血管疾病、慢性炎癥、肥胖、神經(jīng)退行性疾病等功效，受到廣大消費(fèi)者的青睞。

紅茶根據(jù)色澤、香氣和滋味的差異劃分不同等級，其中香氣是影響消費(fèi)者對茶葉喜好的直觀判斷，它對茶葉感官品質(zhì)的貢獻(xiàn)率達(dá)25%～40%。從化學(xué)成分角度看，紅茶特征性香氣化合物主要有香葉醇、芳樟醇及其氧化物、苯甲醇、2-苯乙醇、水楊酸甲酯、二氫獼猴桃醇酸內(nèi)酯等。祁門紅茶以獨特的“似花似果似蜜”的“祁門香”，位列“世界三大高香紅茶”，主要以國家級茶樹良種-祁門櫧葉種的鮮葉為原料，特征性香氣成分以香葉醇、苯乙醛、芳樟醇、芳樟醇氧化物、2-己烯醛、己醛、苯甲醇、水楊酸甲酯等為主。

茶樹品種是決定香氣物質(zhì)差異性和成茶香型的根本原因。銀飛燕等對湖南省栽種較多的5 個良種茶樹品種的內(nèi)含物質(zhì)等進(jìn)行檢測，結(jié)合香氣和感官品質(zhì)，探討了5 個品種制作紅茶，特別是高檔優(yōu)質(zhì)紅茶的可行性。朱蔭等分析了6 個茶樹良種制成龍井茶香氣成分的差異。羅學(xué)平等對5 個四川主栽品種紅茶香氣組分進(jìn)行分析，結(jié)合萜烯指數(shù)與感官審評結(jié)果，鑒定出主體香氣成分對香型的分類。馬林龍等對湖北省6 個茶樹品系所制綠茶的香氣成分進(jìn)行鑒定分析，鑒定出19 個香氣成分是所測樣品間的關(guān)鍵差異香氣成分。大多數(shù)研究圍繞品種適制性和不同品種制茶的香氣成分差異，然而，至今鮮見有研究表明黃山地區(qū)主要栽培茶樹品種差異對紅茶香氣成分的影響，以及與審評相結(jié)合，對不同茶樹品種制成的紅茶香型進(jìn)行分類。

本實驗以黃山地區(qū)主要栽培的9 個茶樹品種鮮葉為原料，按祁門紅茶的加工工藝制備樣品，采用感官審評結(jié)合氣頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspacesolid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)分析紅茶樣品的感官特征與香氣化合物的組成及含量，同時計算氣味活度值（odor activity value，OAV），利用正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）和變量投影重要性（variable importance projection，VIP）分析紅茶樣品中的主要呈香化合物和關(guān)鍵差異香氣成分，以香氣為主導(dǎo)，討論不同茶樹品種鮮葉加工紅茶香氣的差異與香型分類，旨在為后續(xù)適制祁門紅茶茶樹品種的篩選和品質(zhì)差異研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同品種紅茶樣品所用鮮葉為2020年4月采摘的‘翠綠1號’、‘鳧早2號’、‘皖茶4號’、‘舒茶早’、‘皖茶91’、‘中茶108’、‘祁門櫧葉種’、‘浙農(nóng)117’、‘浙農(nóng)139’，共9 個茶樹品種的新梢，采摘標(biāo)準(zhǔn)以一芽一葉初展為主，每個品種鮮葉約14～15 kg。除‘祁門櫧葉種’來自安徽祁門縣歷口鎮(zhèn)，其余品種均來自安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗基地的5 年生茶樹。

癸酸乙酯（純度99%） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭、萃取手柄 美國色譜科公司；7890-5975 GC-MS聯(lián)用儀、DB-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×250 μm，0.25 μm） 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 茶樣制作

紅茶加工在安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所加工車間完成。紅茶加工工藝流程與技術(shù)參數(shù)如下：鮮葉依次經(jīng)過室內(nèi)自然攤放（14～15 h、溫度13～15 ℃）、熱風(fēng)萎凋（攤?cè)~厚度8～10 cm、4～5 h、溫度35 ℃）、揉捻（空揉35 min、輕壓10 min、加壓15 min、重壓10 min）、解塊、發(fā)酵（溫度23～25 ℃、相對濕度95%、2.5～3 h）、毛火（120 ℃約7 min，烘至水分20%～30%）、攤涼（45 min）、足火（80 ℃約30 min，烘至水分4%～5%）制得紅茶樣品。樣品密封后貯存在－20 ℃冰箱待用。

1.3.2 感官審評方法

茶葉審評方法按照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》中紅茶審評方法進(jìn)行感官審評。準(zhǔn)確稱取茶樣3.00 g，置于150 mL審評杯中，沸水沖泡5 min后出湯，由3 位專業(yè)審評人員對香氣進(jìn)行描述與評分，評分標(biāo)準(zhǔn)為百分制。

1.3.3 香氣組分的萃取

采用HS-SPME萃取香氣組分。準(zhǔn)確稱取1.00 g研磨的紅茶樣置于固相微萃取瓶中，加入1.00 g NaCl和20.00 mL沸水，立即密封瓶口，60 ℃平衡5 min，加入20.00 μL 0.04%癸酸乙酯溶液，將萃取頭立即插入萃取瓶，與液面維持一定高度后，于50 ℃恒溫水浴鍋中萃取30 min，萃取結(jié)束后，將萃取頭插入GC-MS進(jìn)樣口（230 ℃）解吸附5 min后進(jìn)行香氣組分分析。每個樣品重復(fù)3 次。

1.3.4 香氣組分的解析

GC儀進(jìn)樣口溫度為250 ℃，不分流進(jìn)樣，載氣為高純氦氣，純度為99.99%；柱溫程序：40 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升至85 ℃，保持2 min；以2 ℃/min升至110 ℃，保持1 min；以3 ℃/min升至128 ℃，保持1 min；以2 ℃/min升至145 ℃，保持2 min；以12 ℃/min升至260 ℃，保持6 min；總程序時間為59.583 min。

1.3.5 香氣成分?jǐn)?shù)據(jù)處理及質(zhì)譜檢索

茶葉香氣經(jīng)GC-MS分析，各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)輸入計算機(jī)庫進(jìn)行檢索匹配，對基峰、質(zhì)荷比和相對峰度等方面進(jìn)行分析。以癸酸乙酯作為內(nèi)標(biāo)物，計算香氣化合物的含量。

1.3.6 OAV計算

對各種揮發(fā)性化合物定量后，依據(jù)參考文獻(xiàn)中各揮發(fā)性物質(zhì)在水中的氣味閾值，OAV計算公式如下：

式中：OAV為物質(zhì)的香氣活性值；C為化合物在茶樣中的含量/（μg/kg）；OT為組分在水中的氣味閾值/（μg/kg）。當(dāng)OAV大于1時，則認(rèn)定該組分對茶葉呈香具有重要貢獻(xiàn)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同茶樹品種紅茶香氣的感官審評分析

茶樹是高度雜合物種，品種間遺傳背景差異較大，導(dǎo)致不同茶樹品種間代謝物積累存在差異。有研究表明，紅茶香氣與茶樹品種有密切的關(guān)系，品種不同，紅茶的香氣特征明顯不同。本研究以栽種于黃山地區(qū)的9 個茶樹品種為原料制備成紅茶樣品并進(jìn)行相關(guān)分析，其中‘祁門櫧葉種’為有性系茶樹品種，是祁門紅茶加工原料的主要來源；‘皖茶4號’和‘鳧早2號’2 個茶樹品種由祁門本地群體種選育；‘翠綠1號’由黃山本地群體種選育；‘皖茶91’和‘舒茶早’為安徽省內(nèi)選育品種；‘浙農(nóng)139’、‘中茶108’和‘浙農(nóng)117’ 3 個茶樹品種為外省選育品種引種至黃山地區(qū)。

通過對供試茶樹品種鮮葉制成的紅茶樣品的香氣感官審評（表1），9 個紅茶樣品主導(dǎo)香氣類型均為甜香型，其中‘祁門櫧葉種’紅茶具有典型的“祁門香”，香氣馥郁高昂、花香明顯，得分最高；‘皖茶4號’紅茶甜香高爽且略帶花香，但花香強(qiáng)度低于‘祁門櫧葉種’紅茶；其余7 個品種紅茶甜香明顯，而花香顯著低于‘祁門櫧葉種’紅茶和‘皖茶4號’紅茶?！渚G1號’紅茶雖以甜香為主導(dǎo)，但該紅茶具有其特殊香氣，略帶有品種香，似紅糖香氣，但香氣鮮爽度不高，故而評分較低?！D早2號’紅茶甜香較為馥郁，與‘舒茶早’、‘皖茶91’、‘中茶108’、‘浙農(nóng)139’4 類紅茶雖甜香類型略有差異，但香氣鮮爽度差異不大，所以評分相同。

表1 不同茶樹品種紅茶香氣感官審評Table 1 Sensory evaluation of aroma in black tea samples

2.2 不同茶樹品種紅茶香氣成分分析

為研究9 個茶樹品種制成紅茶的香氣差異，利用GC-MS儀對紅茶樣品的揮發(fā)性化合物成分及相對含量進(jìn)行分析鑒定。由表2可知，共檢測到46 個主要揮發(fā)性成分，其中33 個成分為共有成分，共檢測到醇類化合物14 種、酯類化合物8 種、醛類化合物11 種、烯類化合物7 種、酮類化合物2 種、芳香族化合物3 種和其他類1 種。其中‘祁門櫧葉種’（23 586.68 μg/kg）的香氣總量最高，其次是‘皖茶4號’（10 444.20 μg/kg）和‘翠綠1號’（7 302.01 μg/kg）。芳樟醇及其氧化物、水楊酸甲酯、香葉醇在樣品中含量較高，品種間差異較大。已有研究表明，芳樟醇及其氧化物、香葉醇、苯甲醇、苯乙醇、水楊酸甲酯等是紅茶特征性香氣物質(zhì)，與本研究結(jié)果相符。

不同茶樹品種鮮葉制成的茶葉因其香氣化合物及其含量的不同，表現(xiàn)出不同的香型。有研究報道祁門紅茶中香葉醇含量較高，因而祁紅具有濃郁的“玫瑰花香”；芳樟醇及其氧化物也具有玫瑰花香和果香。供試的9 個紅茶樣品主要香氣化合物含量差異較大，如香葉醇在‘祁門櫧葉種’（（2 280.93±646.02）μg/kg）和‘皖茶4號’（（2 823.23±333.83）μg/kg）品種中的含量較高，與含量最低的‘浙農(nóng)139’（（57.60±5.13）μg/kg）相差約40 倍；芳樟醇在‘祁門櫧葉種’（（5 161.20±1 922.66）μg/kg）、‘翠綠1號’（（2 174.85±322.06）μg/kg）、‘皖茶4號’（（1 711.49±128.50）μg/kg）和‘浙農(nóng)117’（（1 332.35±477.33）μg/kg）品種中含量較高，與其他品種相差約2～44 倍；水楊酸甲酯在‘祁門櫧葉種’（（3 239.56±342.29）μg/kg）、‘翠綠1號’（（1 781.69±159.69）μg/kg）和‘皖茶4號’（（1 719.06±111.90）μg/kg）品種中的含量顯著高于其他品種，特別是‘皖茶91’、 ‘中茶108’和‘浙農(nóng)139’。含量較低的()--紫羅酮對紅茶香氣的形成也有較大的貢獻(xiàn)，各品種間的含量相差較小。

2.3 不同茶樹品種紅茶香氣化合物種類及含量分析

9 個茶樹品種紅茶樣品中共分析出46 種揮發(fā)性香氣化合物，由圖1可知，醇類、酯類和醛類占香氣成分總量的75.76%～89.59%。

醇類化合物占香氣成分總量的36.79%～55.19%，主要為糖苷類的水解、氨基酸和脂肪酸代謝產(chǎn)物，其中相對含量較高的醇類化合物為芳樟醇及其氧化物和香葉醇。芳樟醇似花香、似檸檬香，芳樟醇氧化物似甜花香、檸檬香、果香，香葉醇似花香、似玫瑰香。從比例可明顯看出，‘浙農(nóng)117’中的醇類化合物占比較高，含量最高的為芳樟醇。

酯類化合物占香氣成分總量的19.00%～29.65%，主要來源于氨基酸和脂肪酸的代謝。含量最高的水楊酸甲酯具有明顯的冬青油味、薄荷香，‘皖茶91’和‘浙農(nóng)139’中酯類化合物含量較高于其他品種。

醛類化合物占香氣成分總量的9.39%～24.95%，主要來自于脂肪酸、氨基酸等代謝途徑，以己醛、2-己烯醛、庚醛、苯甲醛、苯乙醛、壬醛、檸檬醛為主。己醛具有青氣、青草氣，2-己烯醛具有青氣、果香，庚醛具有柑橘香、脂香，苯甲醛具有苦杏仁、櫻桃及堅果香，苯乙醛具有果香和甜香，壬醛具有玫瑰香和柑橘香，檸檬醛具有檸檬香?！戕r(nóng)139’、‘中茶108’、‘舒茶早’和‘皖茶4號’中醛類化合物占比較高。

酮類化合物占香氣成分總量的比例較小，以類胡蘿卜素降解產(chǎn)物最多。共檢測到兩種酮類化合物，6-甲基-5-庚烯-2-酮和()--紫羅酮。()--紫羅酮具有木香、似紫羅蘭香，對紅茶的香氣貢獻(xiàn)較大。

烯類化合物主要以-月桂烯、檸檬烯和()--羅勒烯為主。-月桂烯具有花香、果香，檸檬烯具有檸檬香、草香，()--羅勒烯具有草香、花香。芳香烴化合物主要以對二甲苯為主，其具有堅果味，油脂味。‘祁門櫧葉種’中的芳香烴類含量高達(dá)14.62%，與其他品種差異顯著。不同茶樹品種鮮葉制成的紅茶中各香氣物質(zhì)種類和比例的差異，構(gòu)成了不同的干茶香氣。

圖1 不同茶樹品種紅茶香氣化合物的類型及比例Fig. 1 Types and proportions of aroma compounds in black tea samples

2.4 不同品種紅茶香氣成分的OAV分析

OAV代表單一的香氣成分對整體香氣的貢獻(xiàn)程度，因此在風(fēng)味研究中得到廣泛應(yīng)用。一般認(rèn)為OAV大于1的成分可能對總體風(fēng)味有直接影響。根據(jù)HS-SPME-GCMS的定性、定量結(jié)果，通過文獻(xiàn)查找對應(yīng)香氣化合物在水中的閾值，并計算其OAV，計算出9 個紅茶樣品中共

21 個OAV大于1的香氣化合物，分別為己醛、()-2-己烯醛、()-3-己烯醇、庚醛、庚醇、1-辛烯-3-醇、月桂烯、檸檬烯、()--羅勒烯、苯乙醛、芳樟醇氧化物I、芳樟醇氧化物II、芳樟醇、壬醛、壬醇、水楊酸甲酯、癸醛、-環(huán)檸檬醛、香葉醇、檸檬醛、()--紫羅酮，結(jié)果如表3所示。紅茶樣品中關(guān)鍵香氣化合物的OAV雖有差異，但所有樣本中芳樟醇和()--紫羅酮的OAV均遠(yuǎn)高于其他香氣化合物。芳樟醇在所樣本中含量較高，而它的香氣閾值低，所以在樣本中表現(xiàn)出較高的OAV。()--紫羅酮被認(rèn)為是決定紅茶特性的關(guān)鍵香氣，在所有樣本中含量雖然很低，但由于其香氣閾值也非常低，所以在樣本中表現(xiàn)出較高的OAV。

表2 不同茶樹品種紅茶香氣成分及含量Table 2 Types and contents of volatile compounds in black tea samples

由表3可知，除芳樟醇和()--紫羅酮為關(guān)鍵呈香物質(zhì)，己醛、()-3-己烯醇、庚醛、1-辛烯-3-醇、月桂烯、壬醛、水楊酸甲酯和香葉醇在所有樣本中OAV均大于1，特別是在‘皖茶4號’、‘翠綠1號’和‘舒茶早’紅茶中多個化合物的OAV大于100，推測這些揮發(fā)性化合物對紅茶香氣的形成具有重要貢獻(xiàn)。

表3 不同茶樹品種紅茶主要香氣化合物OAVTable 3 OAVs of major volatile compounds in different black tea samples

2.5 不同茶樹品種紅茶香氣成分的OPLS-DA及VIP分析

OPLS-DA屬于有監(jiān)督分析，可通過預(yù)設(shè)分類，盡可能去除未控制變量對數(shù)據(jù)造成的影響，可進(jìn)一步挖掘數(shù)據(jù)信息，同時可以量化特征風(fēng)味物質(zhì)造成樣品之間差異的程度，減少結(jié)果誤差。將紅茶香氣成分的OAV作為變量進(jìn)行OPLS-DA（圖2），結(jié)果顯示，‘翠綠1號’、‘鳧早2號’、‘舒茶早’、‘皖茶91’、‘中茶108’、‘浙農(nóng)117’、‘浙農(nóng)139’聚為一類，表明這7 個紅茶樣品中的香氣化合物對香氣的總體貢獻(xiàn)有一定的相似性，而‘皖茶4號’和‘祁門櫧葉種’分別單獨聚為一類，表明這2 個紅茶樣品中的香氣化合物對香氣的總體貢獻(xiàn)互有差異，也有別于其他7 個樣品。

圖2 不同茶樹品種紅茶香氣化合物的OPLS-DAFig. 2 OPLS-DA plot of aroma compounds in black tea samples

利用OPLS-DA形成的VIP值的大小進(jìn)行關(guān)鍵變量分析，一般來說，VIP值大于1的變量被認(rèn)為是導(dǎo)致組間差異的代謝物，紅茶香氣品質(zhì)取決于多個香氣化合物共同作用的結(jié)果。因其他7 類紅茶PCA聚為一類，本研究選取‘皖茶91’為對照，分別與‘祁門櫧葉種’和‘皖茶4號’進(jìn)行比較，篩選VIP值大于1的化合物（表4）。結(jié)合感官審評結(jié)果，發(fā)現(xiàn)可能導(dǎo)致‘祁門櫧葉種’紅茶“祁門香”和‘皖茶91’紅茶甜香香氣差異的化合物主要是()--紫羅酮、芳樟醇、-月桂烯、香葉醇、己醛、壬醛和庚醛；可能導(dǎo)致‘皖茶4號’紅茶花香和‘皖茶91’紅茶甜香香氣差異的化合物主要是()--紫羅酮、香葉醇、-月桂烯、芳樟醇和己醛。

表4 不同茶樹品種紅茶香氣化合物VIP值分析Table 4 VIP values of aroma compounds in black tea samples

3 結(jié) 論

從感官審評結(jié)果看，9 個茶樹品種鮮葉制成的紅茶樣品香氣香型均為甜香型，其中‘祁門櫧葉種’具有典型的“祁門香”，花香明顯；‘皖茶4號’香氣近似‘祁門櫧葉種’，其余品種紅茶甜香明顯，而花香顯著低于‘祁門櫧葉種’。9 個紅茶樣品香氣化合物以醇類、醛類和酯類為主，‘翠綠1號’、‘皖茶4號’、‘祁門櫧葉種’紅茶樣香氣總量遠(yuǎn)高于其他品種，芳樟醇及其氧化物、水楊酸甲酯、香葉醇為所有紅茶樣中含量較高的香氣化合物。共有21 種香氣化合物對紅茶風(fēng)味有一定貢獻(xiàn)，其中芳樟醇和()--紫羅酮貢獻(xiàn)較大。

多數(shù)研究以揮發(fā)性化合物的含量為評價指標(biāo)進(jìn)行OPLS-DA，但有些揮發(fā)性化合物雖然含量高，但閾值也高，不易被人的嗅覺感知，本研究以O(shè)AV作為評價指標(biāo)進(jìn)行分析更加有說服力?！畈?號’和‘祁門櫧葉種’對紅茶香氣的總體貢獻(xiàn)互有差異也有別于其余7 個紅茶樣，分析結(jié)果與審評結(jié)果相似，造成‘祁門櫧葉種’紅茶有別于其他品種紅茶的主要香氣化合物可能是()--紫羅酮、芳樟醇、-月桂烯、香葉醇、己醛、壬醛和庚醛，這些香氣化合物閾值低，且具有花果香，這些成分含量和比例的差異，可能是‘祁門櫧葉種’紅茶特殊甜花香有別于其他品種紅茶甜香的主要因素。有研究對歷口地區(qū)群體種紅茶香氣進(jìn)行檢測，指出香氣主要成分為香葉醇、苯乙醛、芳樟醇、芳樟醇氧化物、2-己烯醛、己醛、苯甲醇和水楊酸甲酯，與本研究結(jié)果相似，但也有研究結(jié)果指出祁紅特征性香氣成分為香葉醇、芳樟醇及其氧化物、苯甲醇、植醇、苯乙醛、2-己烯醛、十六酸等，與本實驗結(jié)果略有差別，這可能與原料、加工工藝、香氣提取方法以及檢測手段有關(guān)。

‘皖茶4號’是由祁門櫧葉種選育出的無性系良種，制成紅茶的香氣以甜香為主，稍帶花香。與其余7 個品種紅茶樣的主要差異香氣化合物可能是()--紫羅酮、香葉醇、-月桂烯、芳樟醇和己醛。