楊肖杰，黃 卉，李來好，楊賢慶，岑劍偉，潘 創(chuàng)，魏 涯，趙永強(qiáng)，郝淑賢，林 織

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；3.廣東順欣海洋漁業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東 陽江 529800）

南美白對(duì)蝦肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含蛋白質(zhì)和多種對(duì)人體有益的氨基酸，且脂肪含量低，深受消費(fèi)者喜愛。去殼是蝦仁生產(chǎn)的關(guān)鍵工序，但外殼通過附著纖維（表皮內(nèi)纖維）緊密地附著在表皮上，表皮內(nèi)纖維通過微管相互交叉從而牢固地連接在肌肉上，這種殼-肉連接結(jié)構(gòu)使鮮蝦殼難以剝離，因此剝殼前需進(jìn)行預(yù)處理使殼-肉間的緊密連接松動(dòng)以輔助后續(xù)剝殼。實(shí)現(xiàn)高效率去殼的同時(shí)保證蝦仁的品質(zhì)是當(dāng)前對(duì)蝦機(jī)械化生產(chǎn)的一個(gè)重要研究方向。

外源蛋白酶可以水解相應(yīng)的蛋白質(zhì)，近年來外源蛋白酶已被應(yīng)用于輔助快速脫殼去皮的加工領(lǐng)域。Dang等報(bào)道了使用Endocut-03L和Exocut-A0復(fù)合蛋白酶預(yù)處理可促進(jìn)北極蝦（）凍蝦殼-肉連接松動(dòng)、提高去殼率、減少工作量，且經(jīng)酶促處理后蝦仁在質(zhì)構(gòu)和色澤上優(yōu)于工業(yè)鹽水法處理蝦仁。楊肖杰等以南美白對(duì)蝦為原料，優(yōu)化了酶輔助剝殼的工藝參數(shù)，優(yōu)化條件下處理時(shí)間短且剝殼效果良好，剝殼后蝦肉pH值和肌纖維組織均無顯著變化，且色澤與鮮蝦較為接近。Dang等用蛋白質(zhì)組學(xué)和掃描電子顯微鏡進(jìn)行分析和觀察，解釋了蛋白酶誘導(dǎo)蝦脫殼的機(jī)制，即酶處理引起蝦殼、表皮、殼-肉連接部位的大分子蛋白被水解，從而松動(dòng)殼-肉連接。低溫處理是目前常用的剝殼預(yù)處理方法，包括速凍之后進(jìn)行解凍、冰鹽水處理后再剝殼，但速凍之后解凍易造成蝦肉汁液流失率增加，影響蝦肉的感官品質(zhì)；研究表明，一定質(zhì)量濃度的冰鹽處理能明顯降低剝殼難度的同時(shí)保持產(chǎn)品品質(zhì)。但目前鮮有系統(tǒng)比較冷凍、冰鹽、酶處理對(duì)南美白對(duì)蝦剝殼效果及脫殼后蝦肉肌原纖維蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)變化影響的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以南美白對(duì)蝦為研究對(duì)象，比較酶預(yù)處理、冷凍和冰鹽預(yù)處理南美白對(duì)蝦的剝殼用功、完全剝殼率，并探究不同預(yù)處理對(duì)剝殼后蝦仁質(zhì)構(gòu)、肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度、表面疏水性、Ca-ATPase活性、總巰基和活性巰基含量以及羰基含量的影響，同時(shí)通過傅里葉變換紅外光譜、圓二色光譜等分析不同預(yù)處理南美白對(duì)蝦蛋白結(jié)構(gòu)變化，為預(yù)處理輔助剝殼在對(duì)蝦機(jī)械剝殼的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

活南美白對(duì)蝦長(zhǎng)度約11～13 cm、40～45 只/kg，于2020年8月購自廣州當(dāng)?shù)爻校óa(chǎn)自廣東湛江），20 min內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室、清洗，置于碎冰中冷休克20 min。

中性蛋白酶（≥200 U/mg、4 ℃保存） 中國合肥博美生物技術(shù)有限公司；BeyoColor彩色預(yù)染蛋白（6.5～270.0 kDa）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（5×）、考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒（常規(guī)法） 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Nu PAGE12% Bis-Tris預(yù)制膠、Nu PAGEMOPS SDS電泳緩沖液（20×） 賽默飛科技（上海）有限公司；所使用的蛋白理化性質(zhì)測(cè)定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。NaCl為食品級(jí)，其他化學(xué)藥品和試劑均為分析級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

T25組織勻漿機(jī) 德國IKA公司；3K30臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；QTS-25質(zhì)構(gòu)儀 英國CNS FARNEL有限公司；Alpha1-4冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；Sunrise-basic吸光度酶標(biāo)儀 德國TECAN公司；Chirscan圓二色光譜儀 英國應(yīng)用光物理學(xué)有限公司；IRAffinity-1傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司；Cary Eclipse熒光分光光度計(jì) 美國VARIAN公司；Mini Gel Tank PAGE電泳系統(tǒng) 美國賽默飛科技公司。

1.3 方法

1.3.1 剝殼預(yù)處理

原料蝦隨機(jī)分為9 份，每份12 只，3 份一組，進(jìn)行3 種預(yù)處理實(shí)驗(yàn)。冷凍處理（-21 ℃、24 h）和冰鹽處理（4%質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl、冰-水質(zhì)量比7∶3浸泡處理8 h）參考Yang Xiaojie等的方法，酶處理（（5±2）℃、0.7 mg/mL中性蛋白酶處理3.5 h）同楊肖杰等的方法。

1.3.2 可剝性分析

不同預(yù)處理后的蝦體可剝性以剝殼效果（剝殼用功和完全剝殼率）進(jìn)行表征。仔細(xì)地切下對(duì)蝦前三腹節(jié)蝦身，稱質(zhì)量并記錄，參考Yang Xiaojie等的方法利用質(zhì)構(gòu)儀分析剝殼過程。剝殼后，蝦分為“完全剝殼”和“未完全剝殼”兩類，統(tǒng)計(jì)完全去殼蝦的剝殼用功/（mJ/g）和完全剝殼率/%。

1.3.3 肌原纖維蛋白的提取

根據(jù)崔燕等的方法提取肌原纖維蛋白并略作修改。取前三腹節(jié)蝦肉3 g，剪碎加入10 倍體積預(yù)冷的Tris-馬來酸緩沖溶液（0.05 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-馬來酸，pH 7.0），充分勻漿60 s，將勻漿液10 000 r/min離心15 min，棄上清液。沉淀中加入10 倍體積預(yù)冷的Tris-馬來酸緩沖溶液（0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-馬來酸，pH 7.0），勻漿60 s后放置1 h，10 000 r/min離心15 min，上清液即為肌原纖維蛋白溶液，收集備用。整個(gè)提取過程均在4 ℃下進(jìn)行，利用Bradford法測(cè)定肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.4 肌原纖維蛋白理化性質(zhì)測(cè)定

參考Chelh和Lv Mingchun等的方法測(cè)定肌原纖維蛋白的表面疏水性。取1 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液加入200 μL溴酚藍(lán)溶液（1 mg/mL），以肌原纖維蛋白溶解液（0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-馬來酸，pH 7.0）加入200 μL溴酚藍(lán)溶液（1 mg/mL）作空白。樣品混合均勻后在25 ℃條件下振蕩反應(yīng)15 min，10 000 r/min離心15 min，取0.5 mL上清液，用4.5 mL蒸餾水稀釋，利用酶標(biāo)儀測(cè)定其在595 nm波長(zhǎng)處的吸光度。按下式計(jì)算溴酚藍(lán)結(jié)合量。根據(jù)每毫克肌原纖維蛋白結(jié)合的溴酚藍(lán)質(zhì)量確定其表面疏水性，單位μg/mg。

式中：為空白組吸光度；為樣品吸光度。

肌原纖維蛋白的Ca-ATPase活力、總巰基含量和活性巰基含量、羰基含量分別使用Ca-ATPase活力測(cè)定試劑盒（A070-4）、總巰基含量測(cè)定試劑盒（A063-2-1）、分型巰基含量測(cè)定試劑盒（A063-4-1）和羰基含量測(cè)定試劑盒（A087-1-2）測(cè)定。

1.3.5 圓二色光譜分析

參考李可等的方法并進(jìn)行修改，使用圓二色光譜儀在室溫下對(duì)遠(yuǎn)紫外線區(qū)域（200～250 nm）進(jìn)行圓二色光譜分析。雙蒸水調(diào)節(jié)肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度至0.05 mg/mL，注入狹縫寬度0.5 mm石英比色皿中進(jìn)行分析。響應(yīng)時(shí)間0.5 s、掃描范圍190～260 nm、縫寬1.0 nm、掃描步階1 nm。通過自帶的CDNN軟件計(jì)算-螺旋相對(duì)含量的變化。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

肌原纖維蛋白溶液置于-80 ℃冷凍4 h后，真空冷凍干燥72 h，得到肌原纖維蛋白凍干粉末。參考劉芳芳等的方法進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析，使用Peakfit v 4.12軟件進(jìn)行曲線擬合并分析數(shù)據(jù)。

1.3.7 內(nèi)源熒光光譜分析

內(nèi)源熒光強(qiáng)度的測(cè)定參照Shi Jing等的方法并稍作修改，用Tris-馬來酸緩沖溶液（0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-馬來酸，pH 7.0）將肌原纖維蛋白溶液稀釋至質(zhì)量濃度為1 mg/mL，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其內(nèi)源熒光光譜。測(cè)定條件：室溫下，激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為300～400 nm，掃描速率1 000 nm/min，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5.0 nm。以Tris-馬來酸緩沖溶液作空白。

1.3.8 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

按照Pan Chuang等的方法進(jìn)行SDS-PAGE分析。將30 μL的肌原纖維蛋白（1 mg/mL）溶液與10 μL的上樣緩沖液（5×）混合，沸水加熱5 min，上樣量10 μL。電泳結(jié)束后取下凝膠，考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒進(jìn)行染色和脫色。條帶的分子質(zhì)量通過與蛋白分子質(zhì)量Marker（6.5～270.0 kDa）進(jìn)行比較來確定。

1.3.9 質(zhì)構(gòu)特性分析

參考楊肖杰等的方法對(duì)南美白對(duì)蝦蝦仁進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，使用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析分析（以＜0.05表示差異顯著），采用Origin Pro 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同預(yù)處理對(duì)蝦體剝殼效果的影響

新鮮的南美白對(duì)蝦殼肉緊密相連，難以剝離，預(yù)處理有助于輔助南美白對(duì)蝦去殼，不同方式處理后南美白對(duì)蝦的剝殼效果如表1所示，完全剝殼率體現(xiàn)了蝦仁剝殼后的完整程度，成功剝殼的蝦仁應(yīng)保持蝦肉完整、蝦尾不斷裂，冷凍、冰鹽及酶預(yù)處理完全剝殼率分別是97.22%、88.89%和94.45%，3 個(gè)處理組間無顯著差異（＞0.05）。剝殼用功反映了殼-肉連接之間的松動(dòng)程度，剝殼用功越小，蝦越容易剝離，不同處理后剝殼用功差異顯著（＜0.05），-21 ℃冷凍24 h后對(duì)蝦剝殼用功為7.99 mJ/g，冰鹽浸泡8 h后對(duì)蝦剝殼用功為9.50 mJ/g，酶低溫處理3.5 h后為5.96 mJ/g。綜合考慮，酶處理3.5 h對(duì)蝦殼的松動(dòng)效果顯著，有助于剝殼。

表1 不同預(yù)處理對(duì)于蝦體剝殼效果的影響Table 1 Effect of different pretreatments on shrimp peeling

2.2 不同預(yù)處理對(duì)蝦肉肌原纖維蛋白理化性質(zhì)的影響

肌原纖維蛋白是肌肉組織的主要結(jié)構(gòu)蛋白，約占蛋白質(zhì)總量的40%～60%，與肌肉的持水性、嫩度等密切相關(guān)。不同預(yù)處理對(duì)肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度的影響如表2所示，與鮮蝦相比，3 種輔助去殼對(duì)蝦仁肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度無顯著影響（＞0.05），可能是處理時(shí)間短，且蝦仁處于低溫狀態(tài)所致。鮮蝦中肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度并不是最高的，可能是鮮蝦剛死后蝦肉尚處于僵直前期，其肌肉內(nèi)ATP的作用使得肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白分子結(jié)合，相互聚合形成分子質(zhì)量較大的分子，離心時(shí)沉淀在底部，所以提取的肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度偏低，造成新鮮蝦肌原纖維蛋白的含量略低于處理組。

表2 不同預(yù)處理對(duì)蝦肉肌原纖維蛋白理化性質(zhì)的影響Table 2 Effects of pretreatments on the physicochemical properties of shrimp myofibrillar proteins

蛋白質(zhì)表面疏水性是表征蛋白質(zhì)分子表面疏水性氨基酸殘基分布數(shù)量的一個(gè)重要指標(biāo)，可以用它來反映蛋白質(zhì)的變性程度，表面疏水性越高說明蛋白變性程度越大。與鮮蝦相比，冷凍和冰鹽處理表面疏水性顯著增加（＜0.05），可能是冷凍-解凍引起肌原纖維蛋白構(gòu)象的輕微變性伸展，表現(xiàn)為蛋白羰基化、肽主鏈斷裂以及分子間二硫鍵形成，埋藏在蛋白空間構(gòu)象內(nèi)部的疏水性脂肪族與芳香族氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)暴露，從而引起表面疏水性的增加。酶處理組的表面疏水性略有上升，但與鮮蝦無顯著差異（＞0.05），主要是因?yàn)椋?±2）℃的低溫短時(shí)處理緩解了蛋白質(zhì)的變性，且沒有涉及到凍融過程。

巰基包括暴露在蛋白質(zhì)表面的（活性巰基）和埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的。從表2中可以看出，新鮮樣品的總巰基和活性巰基含量顯著高于其他3 個(gè)處理組，研究表明肌原纖維蛋白中含有大量易受氧自由基影響的巰基基團(tuán)，且易轉(zhuǎn)化為分子內(nèi)和分子間二硫鍵，引起蛋白質(zhì)分子間發(fā)生聚合、交聯(lián)，導(dǎo)致巰基含量降低，蛋白的氧化程度與巰基含量成反比。在預(yù)處理過程中，冷凍或中性蛋白酶的酶解作用使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，埋藏在分子內(nèi)部的巰基暴露并被氧化生成二硫鍵，從而引起巰基含量的下降。酶處理組的巰基含量顯著高于冷凍和冰鹽組，更接近于鮮蝦，說明其蛋白氧化程度較低。此外，解凍過程中會(huì)產(chǎn)生熱量并發(fā)生擠壓，這也可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)解折疊并影響巰基的含量。

蛋白側(cè)鏈含—NH—或—NH的氨基酸非常容易受到活性氧（reactive oxygen species，ROS）的攻擊而氧化為羰基或者羰基衍生物，所以羰基含量常被用來衡量蛋白氧化的程度，含量越高表明蛋白氧化程度越高。如表1所示，冷凍處理肌原纖維蛋白的羰基含量為3.95 nmol/mg，與鮮蝦相比略微增加（＞0.05），而酶和冰鹽處理后肌原纖維蛋白羰基含量分別為5.58、6.18 nmol/mg，與鮮蝦相比分別增加了50.00%和66.13%，主要是因?yàn)槁然c的存在使蛋白質(zhì)表面賴氨酸殘基的-NH更易受到攻擊，導(dǎo)致蛋白質(zhì)羰基含量的上升，趙亞南等研究表明，在氯化鈉添加量為0%～4.5%時(shí)，羰基含量隨氯化鈉添加量的增加而顯著增加。

Ca-ATPase活力是表征肌球蛋白分子結(jié)構(gòu)完整性的一個(gè)良好指標(biāo)，其變化能較好地反映肌原纖維蛋白的變性程度。肌球蛋白變性，特別是頭部區(qū)域變性，會(huì)引起Ca-ATPase活力下降，其原因可能是肌球蛋白頭部構(gòu)象改變及蛋白質(zhì)聚集。從表2中可以看出，Ca-ATPase活力的變化并不一定造成肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度的顯著變化。與鮮蝦相比，處理組對(duì)蝦肌原纖維蛋白的Ca-ATPase活力都顯著下降（＜0.05），冷凍處理組下降至0.49 U/mg，下降了33.78%，冷凍-解凍過程中冰結(jié)晶的形成及由此引起的體系離子強(qiáng)度的增大都會(huì)造成肌球蛋白頭部結(jié)構(gòu)變化；此外，巰基的氧化作用也造成了Ca-ATPase活力的下降，兩者共同作用使冷凍處理組的Ca-ATPase活力最低。酶處理組Ca-ATPase活力下降至0.58 U/g，下降21.62%，主要是外源蛋白酶的酶解作用引起的，與儀淑敏等的研究結(jié)果相似。冰鹽處理組Ca-ATPase活力下降至0.66 U/g，下降了10.81%，這與秦求思等研究鷹爪蝦在冰溫貯藏下Ca-ATPase活力下降的結(jié)論一致。綜上，3 種預(yù)處理輔助剝殼對(duì)于Ca-ATPase活性影響程度由大到小依次是冷凍處理＞酶處理＞冰鹽處理。

2.3 不同預(yù)處理剝殼后蝦肉肌原纖維蛋白傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

蛋白質(zhì)在紅外區(qū)域有若干特征吸收帶，圖1為鮮蝦和各處理組肌原纖維蛋白的紅外光譜，酰胺II帶（1 500～1 600 cm）、酰胺I帶（1 600～1 700 cm）、2 929 cm處的特征吸收峰和3 296 cm處的單強(qiáng)峰分別是由C—N伸縮和N—H彎曲振動(dòng)、羰基C＝O和雙鍵伸縮振動(dòng)、C—H伸縮振動(dòng)和O—H伸縮振動(dòng)引起。其中，位于1 600～1 700 cm的酰胺I帶吸收峰強(qiáng)度最強(qiáng)，可反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。對(duì)比新鮮南美白對(duì)蝦肌原纖維蛋白紅外譜圖，經(jīng)不同預(yù)處理蝦肉蛋白各組分的峰位沒有明顯變化，但其特征峰強(qiáng)度有不同程度的減弱，表明預(yù)處理導(dǎo)致肌肉肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的破壞以及二級(jí)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化和改變。

圖1 不同預(yù)處理剝殼后蝦肉肌原纖維蛋白紅外光譜Fig. 1 Fourier transform infrared spectra of myofibrillar proteins in shrimp muscle subjected to different pretreatments

通過對(duì)1 600～1 700 cm處的酰胺I帶進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)處理和高斯曲線擬合，可放大一些細(xì)小峰變化，得到各子峰，由圖2可知，處理組的峰強(qiáng)度發(fā)生不同程度的減弱。圖2中各子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)關(guān)系為：1 615～1 637 cm和1 682～1 700 cm對(duì)應(yīng)-折疊；1 646～1 664 cm對(duì)應(yīng)-螺旋；1 637～1 645 cm對(duì)應(yīng)無規(guī)卷曲；1 664～1 681 cm對(duì)應(yīng)-轉(zhuǎn)角。根據(jù)擬合后的峰面積計(jì)算出各二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量，如表3所示，-螺旋和-折疊是新鮮蝦肉中主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)，-螺旋通過肽鏈內(nèi)部的氫鍵穩(wěn)定，-折疊依賴于肽鏈之間的氫鍵，維持著肌原纖維蛋白的有序和穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。與新鮮蝦肉肌原纖維蛋白相比，冷凍處理、酶處理和冰鹽處理后肌原纖維蛋白-螺旋的相對(duì)含量分別下降了5.93%、6.01%和3.85%，并無顯著變化，-螺旋相對(duì)含量的降低可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水性的增加，這與上述預(yù)處理引起表面疏水性的增加結(jié)果相印證，但變化趨勢(shì)并不完全吻合。冷凍處理后肌原纖維蛋白-折疊相對(duì)含量減少2.89%，無規(guī)卷曲相對(duì)含量增加2.44%，變化不顯著（＞0.05）；酶和冰鹽處理后-折疊相對(duì)含量分別減少13.43%和14.26%，無規(guī)卷曲相對(duì)含量分別增加93.58%和87.55%，變化顯著（＜0.05），-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量無顯著變化。說明酶處理和冰鹽處理引起-折疊肽鏈之間的氫鍵斷裂，向無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，是一種有序到無序的變化。

圖2 不同預(yù)處理剝殼后蝦肉肌原纖維蛋白酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）高斯擬合紅外光譜Fig. 2 Gaussian fitting infrared spectra of amide I band (1 600-1 700 cm-1) of shrimp muscle myofibrillar proteins subjected to different pretreatments

表3 不同預(yù)處理對(duì)剝殼后蝦肉肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 3 Effects of different pretreatments on secondary structures of myofibrillar proteins in peeled shrimps

2.4 不同預(yù)處理剝殼后蝦肉肌原纖維蛋白圓二色光譜分析結(jié)果

圓二色光譜遠(yuǎn)紫外區(qū)（190～240 nm）的圓二色性主要由肽鍵的電子躍遷引起，能夠反映肽鏈主鏈的構(gòu)象，常用于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。肌原纖維蛋白的圓二色光譜通常在208 nm和222 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)兩個(gè)負(fù)峰，這兩個(gè)峰即代表-螺旋結(jié)構(gòu)的特征吸收峰。圖3所示為典型的以-螺旋為主的二級(jí)結(jié)構(gòu)，與鮮蝦相比，3 種預(yù)處理剝殼后肌原纖維蛋白的圓二色光譜特征峰強(qiáng)度略微發(fā)生改變，但肩峰的位置和形狀都沒有發(fā)生明顯變化，-螺旋相對(duì)含量發(fā)生變化，這與紅外光譜的結(jié)果不一致，可能是由于羰基化影響了蛋白的結(jié)構(gòu)特性，有研究表明羰基含量與-螺旋含量呈正相關(guān)，本研究中，處理后的肌原纖維蛋白氧化產(chǎn)生的羰基可能促進(jìn)了-螺旋相對(duì)含量的增加。圓二色光譜對(duì)于-螺旋構(gòu)象的分析效果較好，而傅里葉變換紅外光譜分析-折疊、-轉(zhuǎn)角等其他結(jié)構(gòu)的結(jié)果更可靠，但具體原因需詳細(xì)探究。

圖3 不同預(yù)處理剝殼后蝦肉肌原纖維蛋白圓二色光譜Fig. 3 CD spectra of myofibrillar proteins in shrimp muscle subjected to different pretreatments

2.5 不同預(yù)處理剝殼后蝦肉肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光光譜分析結(jié)果

內(nèi)源性色氨酸熒光光譜能夠反映蛋白質(zhì)中氨基酸殘基及其微環(huán)境的變化，進(jìn)而常被用于監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于折疊狀態(tài)時(shí)，色氨酸殘基主要位于蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水環(huán)境中，此時(shí)被激發(fā)的色氨酸具有相對(duì)較高的熒光強(qiáng)度。如圖4所示，在295 nm波長(zhǎng)處激發(fā)的新鮮蝦肉肌原纖維蛋白在發(fā)射波長(zhǎng)335 nm處具有最高的熒光強(qiáng)度，預(yù)處理剝殼后蝦肉肌原纖維蛋白的內(nèi)源熒光強(qiáng)度出現(xiàn)不同程度的降低，酶處理組降低4.78%，冷凍處理和冰鹽處理組分別降低10.18%和9.52%。蝦肉在處理過程中冰晶的生成、外源蛋白酶和內(nèi)源蛋白酶引起的蛋白質(zhì)變性和氧化作用使肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)逐漸展開，色氨酸側(cè)鏈吲哚等熒光物質(zhì)的氧化和暴露引起內(nèi)源熒光強(qiáng)度降低，且最大熒光峰位置發(fā)生輕微的紅移，說明經(jīng)過處理后部分埋藏在肌原纖維蛋白內(nèi)部的氨基酸殘基處于極性程度更高的環(huán)境中，蛋白內(nèi)部的疏水性氨基酸暴露在蛋白分子表面引起蛋白的表面疏水性增加。本實(shí)驗(yàn)中，3 種預(yù)處理都會(huì)引起肌原纖維蛋白的內(nèi)源熒光強(qiáng)度減小，但酶處理組的變化較小，與上述肌原纖維蛋白的表面疏水性分析結(jié)果相印證。

圖4 不同預(yù)處理剝殼后蝦肉肌原纖維蛋白的熒光光譜Fig. 4 Fluorescence spectra of myofibrillar proteins in shrimp muscle subjected to different pretreatments

2.6 不同預(yù)處理剝殼后蝦肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果

從圖5可以看到清晰的肌球蛋白重鏈和輕鏈、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白以及尚不明確的結(jié)構(gòu)性調(diào)節(jié)蛋白條帶。蛋白質(zhì)分子發(fā)生降解主要表現(xiàn)為分子質(zhì)量較高處的條帶出現(xiàn)模糊、弱化和擴(kuò)展，較低分子質(zhì)量區(qū)域則出現(xiàn)新的條帶或條帶顏色加深。與新鮮蝦肉相比，冷凍處理組和冰鹽處理組的泳道條帶無明顯變化，可能是由于處理時(shí)間較短且有溫度控制。酶處理組肌球蛋白重鏈（＞200 kDa）條帶、肌動(dòng)蛋白（48 kDa）條帶顏色變淺，即肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白發(fā)生了輕微降解，95～130 kDa之間的條帶和45 kDa條帶變粗且顏色加深，可能是由于外源蛋白酶將大分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)降解形成了較小分子質(zhì)量的片段。結(jié)合電泳分析結(jié)果可知，短時(shí)冷凍和冰鹽處理雖然在一定程度上影響了蛋白的某些理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，但沒有引起蛋白質(zhì)電泳圖譜中主要蛋白分子條帶變化；酶輔助剝殼會(huì)引起肌原纖維蛋白中大分子蛋白的輕微降解。

圖5 不同預(yù)處理剝殼后蝦肉肌原纖維蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig. 5 SDS-PAGE patterns of myofibrillar proteins in shrimp muscle subjected to different pretreatments

2.7 不同預(yù)處理對(duì)蝦仁質(zhì)構(gòu)特性的影響

如表4所示，酶處理后的蝦仁硬度大于鮮蝦、冷凍和冰鹽處理蝦仁，可能是鮮蝦死后30 min正處于僵直前期，此時(shí)肌肉柔軟有彈性；而低溫解凍造成肌肉細(xì)胞的汁液流失，肉質(zhì)變軟。酶處理后彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性和膠著性都顯著降低，其彈性和冰鹽處理組無顯著差異，內(nèi)聚性、膠著性與冷凍處理組無顯著差異，咀嚼性和鮮蝦無顯著差異。電泳分析結(jié)果顯示酶處理輔助剝殼后蝦肉肌動(dòng)蛋白雖發(fā)生了輕微降解，但總體上蝦仁的質(zhì)構(gòu)特性略優(yōu)于冷凍、冰鹽處理組。本課題組之前的研究結(jié)果也顯示，與鮮蝦相比，酶輔助剝殼后蝦仁pH值無顯著變化，蝦仁能保持原有色澤，蝦肉肌纖維較為完整，排列較為緊密，沒有出現(xiàn)肌纖維束和肌內(nèi)膜破裂的情況。Dang等也報(bào)道了與工業(yè)鹽水前處理相比，酶處理使蝦的質(zhì)地和顏色方面品質(zhì)得到提升。

表4 不同預(yù)處理對(duì)蝦仁質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 4 Effects of pretreatments on the texture of peeled shrimps

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)探究了3 種不同預(yù)處理輔助剝殼對(duì)蝦體剝殼效果及蝦肉肌原纖維蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響。與冷凍和冰鹽處理相比，酶處理所需的剝殼用功最小且完全剝殼率較高。與鮮蝦相比，不同預(yù)處理組的肌原纖維蛋白均發(fā)生了不同程度的氧化，酶處理組表面疏水性增加但不顯著（＞0.05），總巰基含量、活性巰基含量和Ca-ATPase活力顯著下降（＜0.05），但下降程度總體小于冷凍和冰鹽處理組，羰基含量與冰鹽處理組無顯著差異。傅里葉變換紅外光譜結(jié)果顯示，3 個(gè)處理組肌原纖維蛋白的-螺旋、-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量都無顯著變化，酶和冰鹽處理組出現(xiàn)了-折疊向無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)，但圓二色光譜分析結(jié)果顯示酶和冰鹽處理組肌原纖維蛋白的-螺旋相對(duì)含量增加；通過色氨酸熒光強(qiáng)度分析發(fā)現(xiàn)，酶處理組熒光強(qiáng)度明顯降低，色氨酸所處的微環(huán)境發(fā)生改變，但降低程度小于其他兩個(gè)處理組。SDS-PAGE圖譜顯示酶處理引起了部分大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的降解，但蝦仁的質(zhì)構(gòu)特性總體略優(yōu)于冷凍/冰鹽處理，冷凍和冰鹽處理引起了蛋白的某些理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的變化，而對(duì)蛋白電泳圖譜無明顯影響。綜上所述，酶處理過程省時(shí)（3.5 h）、所需剝殼用功較小且完全剝殼率達(dá)94.45%，同時(shí)對(duì)蛋白的理化特性和構(gòu)象的影響小于冷凍和冰鹽處理，可作為一種新型的預(yù)處理方法輔助對(duì)蝦去殼。但目前該方法仍處于探索階段，其對(duì)蝦仁風(fēng)味和貯存期品質(zhì)的影響有待進(jìn)一步研究。