王海瑞 莫文艷 趙紅霞 黃 文 鄭春田 曹俊明

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣州 510640)

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)俗稱黃姑子、黃骨魚等，隸屬于硬骨魚綱、鲿科、黃顙魚屬。黃顙魚含肉率高、肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，深受消費者的喜愛，在國內(nèi)外水產(chǎn)市場中需求量大，是我國近年來發(fā)展較快的淡水經(jīng)濟(jì)型養(yǎng)殖品種。但是隨著黃顙魚高密度以及集約化養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大，高密度養(yǎng)殖對黃顙魚的生長性能和健康產(chǎn)生負(fù)面影響[1]。因此，開發(fā)天然和友好的抗生素替代品和生長促進(jìn)劑對于水生動物的健康養(yǎng)殖尤為重要和急迫[2]。研究表明，飼料中添加益生菌有助于提高水產(chǎn)動物的生長性能、減少疾病和增強(qiáng)免疫功能[3-6]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

丁酸梭菌采購于某生物科技股份有限公司，其中活菌數(shù)6.1×1012CFU/kg。

1.2 試驗飼料

基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。參照水產(chǎn)動物飼料中丁酸梭菌適宜添加水平的相關(guān)文獻(xiàn)[8-12]，在基礎(chǔ)飼料中分別添加0、2、20、200、2 000 mg/kg丁酸梭菌原粉，配制成5種試驗飼料，試驗飼料中丁酸梭菌數(shù)量分別為0、1.2×107、1.2×108、1.2×109、1.2×1010CFU/kg，分別記作G0、G1、G2、G3、G4。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平

原料經(jīng)粉碎通過60目篩，準(zhǔn)確稱取各個原料，加入魚油、豆油，丁酸梭菌溶于水中，加水?dāng)嚢杈鶆颍褂秒p螺桿擠壓機(jī)(SLX-80型，華南理工大學(xué)科技實業(yè)總廠生產(chǎn))將原料擠壓成條，通過制粒機(jī)(G-500，華南理工大學(xué)科技實業(yè)總廠生產(chǎn))破碎條狀飼料，制成1.5 mm的顆粒飼料，在55 ℃下烘干，自然冷卻后放入密封袋中，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｔ囼烇暳螱1、G2、G3、G4中丁酸梭菌活菌數(shù)實測值分別為4.8×106、4.5×107、5.1×108、3.6×109CFU/kg。

1.3 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理

試驗所用黃顙魚苗購自廣州市白云錦龍漁業(yè)有限公司，在室外水泥池中暫養(yǎng)2周，期間投喂試驗所用基礎(chǔ)飼料，每天采取表觀飽食投喂2次。正式試驗在室內(nèi)循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)進(jìn)行，由15個玻璃纖維桶構(gòu)成。水容積達(dá)到300 L左右，挑選出原始體重在(5.55±0.05)g、健康、規(guī)格均等的黃顙魚450尾，隨機(jī)分成5組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)30尾。

試驗期間，每天08:30和18:30各投喂1次，按照體重5%的投飼率進(jìn)行投喂，后期采用表觀飽食投喂，每周換水3次，換水量為養(yǎng)殖用水的1/3。光照為自然光源，水溫27～32 ℃，氨氮含量<0.2 mg/L，溶氧含量>6.0 mg/L，pH 7.0～7.8。觀察并記錄黃顙魚攝食、健康及死亡情況，試驗周期為8周。

1.4 樣品收集

養(yǎng)殖結(jié)束后，試驗魚禁食24 h，每缸魚稱總重并計數(shù)，每缸隨機(jī)選取10尾魚放入濃度為120 mg/L的MS-222溶液進(jìn)行麻醉，尾靜脈采血，4 ℃下靜置6 h，4 000 r/min離心15 min，取上清液分裝在2 mL Eppendorf管中，保存在-80 ℃超低溫冰箱中。采血后的魚解剖，采取肝臟和內(nèi)臟，測定體長、體重、肝臟重和內(nèi)臟團(tuán)重。每缸隨機(jī)選取3尾魚，剝離全腸的內(nèi)容物，保存于-80 ℃冰箱，用于短鏈脂肪酸含量的檢測。

1.5 指標(biāo)測定

1.5.1 生長性能及形體指標(biāo)

增重率(WGR，%)=100×(試驗魚終末體重-試驗魚初始體重)/試驗魚初始體重;飼料系數(shù)(FCR)=攝食飼料總干重/(試驗魚終末總體重-試驗魚初始總體重)；肥滿度(CF，g/cm3)=100×試驗魚體重(g)/試驗魚體長(cm3)；肝體比(HSI，%)=100×肝臟總重(g)/試驗魚體重(g)；臟體比(VSI，%)=100×內(nèi)臟團(tuán)重(g)/試驗魚體重(g)。

1.5.2 血清生化指標(biāo)

試驗魚血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、甘油三酯(TG)、尿素(UR)、葡萄糖(GLU)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性由廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗中心采用日立7600全自動生化分析儀檢測。

1.5.3 血清免疫和抗氧化指標(biāo)

采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定血清溶菌酶(LZM)、堿性磷酸酶(AKP)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性，谷胱甘肽(GSH)、補(bǔ)體3(C3)、免疫球蛋白M(IgM)、丙二醛(MDA)含量及總抗氧化能力(T-AOC)。

1.5.4 腸道短鏈脂肪酸含量

腸道短鏈脂肪酸含量采用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，送生工生物工程(上海)股份有限公司檢測。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan氏多重比較，P<0.05表示差異顯著。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD，n=3)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料添加丁酸梭菌對黃顙魚生長性能和形體指標(biāo)的影響

由表2可知，與G0組相比，隨著丁酸梭菌添加水平的增加，WGR先升高后降低，F(xiàn)CR先降低后升高。與G0組相比，G1、G2、G3組黃顙魚的WGR顯著升高(P<0.05)，而FCR卻顯著降低(P<0.05)。與G0組相比，G2和G3組黃顙魚的CF顯著升高(P<0.05)，G1、G2、G3和G4組黃顙魚的臟體比均顯著降低(P<0.05)。各組黃顙魚肝體比有下降趨勢，但差異未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。

表2 飼料添加丁酸梭菌對黃顙魚生長性能和形體指標(biāo)的影響

2.2 飼料添加丁酸梭菌對黃顙魚血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知，G3、G4組黃顙魚血清AST活性顯著低于G0組(P<0.05)。G3組黃顙魚血清ALT活性顯著低于G0組(P<0.05)。G1、G2、G3組黃顙魚血清GLU含量顯著高于G0組(P<0.05)。飼料中添加丁酸梭菌對黃顙魚幼魚血清LDL-C、TG、HDL-C、ALB、TP含量無顯著影響(P>0.05)。

表3 飼料添加丁酸梭菌對黃顙魚血清生化指標(biāo)的影響

2.3 飼料添加丁酸梭菌對黃顙魚血清免疫指標(biāo)的影響

由表4可知，與G0組比較，G3組黃顙魚血清的LZM活性顯著升高(P<0.05)，G4組黃顙魚血清中C3含量和AKP活性顯著增加(P<0.05)，G3、G4組黃顙魚血清IgM含量顯著提高(P<0.05)。

表4 飼料添加丁酸梭菌對黃顙魚血清免疫指標(biāo)的影響

2.4 飼料添加丁酸梭菌對黃顙魚血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表5可知，隨著丁酸梭菌添加水平升高，黃顙魚血清CAT和GSH-Px活性逐漸升高，MDA含量降低，但各組間黃顙魚血清CAT、GSH-Px活性和MDA含量無顯著差異(P>0.05)。各丁酸梭菌添加組黃顙魚血清T-AOC均顯著高于G0組(P<0.05)。與G0組比較，G3組黃顙魚血清中GSH含量和SOD活性顯著增加(P<0.05)。

表5 飼料添加丁酸梭菌對黃顙魚血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.5 飼料添加丁酸梭菌對黃顙魚腸道短鏈脂肪酸含量的影響

由圖1可知，與G0組相比，G2、G3和G4組黃顙魚腸道短鏈脂肪酸含量均顯著高于G0組(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

3.1 飼料添加丁酸梭菌對黃顙魚生長性能和形體指標(biāo)的影響

丁酸梭菌作為一種益生菌已廣泛應(yīng)用于畜禽動物[13-14]。近年來，丁酸梭菌的研究在水生動物上逐步開展。研究表明，適當(dāng)劑量的丁酸梭菌能提高羅非魚[8]、凡納濱對蝦[10]、斑節(jié)對蝦[11]、卵形鯧鲹[12]和鯉[15]的生長性能。與上述研究結(jié)果相一致，本試驗在飼料中添加丁酸梭菌能夠提高黃顙魚的WGR和降低FCR。丁酸梭菌對動物生長性能和飼料利用率的積極作用可能與丁酸梭菌在腸道內(nèi)代謝產(chǎn)生的丁酸有關(guān)，丁酸是上皮細(xì)胞的主要能量來源，可以促進(jìn)腸道絨毛發(fā)育和提高消化能力[16]。短鏈脂肪酸主要包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸等，能夠促進(jìn)動物生長和腸道健康。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼料添加200和2 000 mg/kg丁酸梭菌提高了腸道短鏈脂肪酸含量，這與WGR的上升趨勢相一致，表明丁酸梭菌代謝產(chǎn)生短鏈脂肪酸促進(jìn)腸道發(fā)育，從而提高黃顙魚的生長性能。CF可用于衡量魚體的營養(yǎng)水平，CF越高則表明其生理和營養(yǎng)狀況越好[17]。本研究中，飼料添加200 mg/kg丁酸梭菌時，黃顙魚的CF顯著增加，臟體比顯著降低，表明適宜水平的丁酸梭菌能夠改善黃顙魚的體形和增加魚體的可食部分。

3.2 飼料添加丁酸梭菌對黃顙魚血清生化指標(biāo)的影響

魚類的血液指標(biāo)與機(jī)體代謝、健康狀況以及疾病關(guān)系密切，因此，血清生化指標(biāo)通常作為衡量魚體營養(yǎng)狀況、健康狀況和對環(huán)境適應(yīng)狀況的關(guān)鍵指數(shù)[18]。TP和ALB與機(jī)體的營養(yǎng)狀況呈正相關(guān)，同時是評價肝臟健康的重要指標(biāo)，肝臟受損會使血清中的TP和ALB含量降低[19]。在本試驗中，隨著飼料中丁酸梭菌添加水平的升高，血清TP和ALB含量均無顯著變化，表明飼料中添加丁酸梭菌不會對黃顙魚幼魚肝臟產(chǎn)生負(fù)面影響，這與朱振祥[15]在鯉上的研究結(jié)果一致。血糖能夠反映機(jī)體能量狀況，若血液中的GLU含量升高則表明機(jī)體能量水平較高，生長速度越快[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加一定水平的丁酸梭菌能夠顯著提高黃顙魚血清GLU含量。血清GLU含量的升高可能與丁酸梭菌刺激產(chǎn)生的短鏈脂肪酸特別是丁酸有關(guān)，研究表明丁酸是上皮細(xì)胞的主要能量來源[16]。因此，飼料中添加丁酸梭菌可能通過刺激腸道產(chǎn)生丁酸促進(jìn)黃顙魚的能量代謝。血清中AST和ALT是魚體中2種重要的轉(zhuǎn)氨酶。這2種酶可作為評價肝臟功能和肝臟受損的重要指標(biāo)，肝細(xì)胞受損會使血清中AST和ALT活性升高，低活性的AST和ALT對魚類的生長有著積極影響[21-22]。本研究顯示，丁酸梭菌添加組血清AST和ALT活性顯著降低，由此推測飼料添加丁酸梭菌有助于保護(hù)黃顙魚肝臟功能和促進(jìn)生長。

3.3 飼料添加丁酸梭菌對黃顙魚血清免疫功能的影響

魚類具有非特異免疫和特異性免疫，C3和LZM可作為評價魚類非特異性免疫的重要指標(biāo)，LZM是可引起細(xì)菌的裂解和作為調(diào)理素激活補(bǔ)體系統(tǒng)，IgM能在魚類非特異免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要作用，維持高水平的IgM能增加魚類的抗病力[23-25]。本研究結(jié)果顯示，丁酸梭菌能夠提高黃顙魚血清LZM活性，在凡納濱對蝦[10]、珍珠龍膽石斑魚[26]和銀鯧[27]也出現(xiàn)了相似的結(jié)果，說明丁酸梭菌對黃顙魚有較好的抗菌作用。作為補(bǔ)體系統(tǒng)中的主要成分，C3是體內(nèi)具有酶原活性的球蛋白，本試驗中飼料添加丁酸梭菌顯著提高黃顙魚血清C3含量。魚類能進(jìn)行體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，而免疫球蛋白是魚類特異性體液免疫應(yīng)答的主要介質(zhì)，本試驗發(fā)現(xiàn)飼料添加丁酸梭菌顯著提高黃顙魚血清IgM含量，表明丁酸梭菌對黃顙魚特異性免疫功能產(chǎn)生積極影響，在銀鯧中也出現(xiàn)了相似的報道[27]。AKP是魚類生理活動及疾病診斷的重要指標(biāo)之一，可以作為衡量機(jī)體免疫狀態(tài)的指標(biāo)[28-29]。本試驗中，與對照組相比，丁酸梭菌試驗組黃顙魚血清AKP活性顯著提高，表明飼料添加丁酸梭菌能夠增強(qiáng)黃顙魚的免疫功能，該結(jié)果與楊曉偉[30]在仔豬上的研究結(jié)果一致。

3.4 飼料添加丁酸梭菌對黃顙魚血清抗氧化能力的影響

魚類在正常生命活動代謝中會產(chǎn)生氧自由基，SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶可構(gòu)成抗氧化防御系統(tǒng)。SOD能夠?qū)C(jī)體內(nèi)多余的活性氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫，而CAT能協(xié)同SOD將過氧化氫轉(zhuǎn)化為水，當(dāng)機(jī)體長期處在不良條件下會產(chǎn)生大量的氧自由基，大量氧自由基攻擊細(xì)胞膜，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為MDA，造成機(jī)體氧化損傷[31]。因此，MDA可作為評價脂質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)[32]。過氧化氫和脂質(zhì)過氧化物也可被GSH-Px清除，而GSH可以協(xié)同GSH-Px清除自由基[31]。因此，抗氧化酶活性的提高可以提高魚類的抗病力。丁酸梭菌在機(jī)體內(nèi)可產(chǎn)氫氣、丁酸，三者皆具有抗氧化功能[13]。楊曉偉[30]發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加丁酸梭菌可以提高仔豬血清中T-AOC和總SOD活性，顯著降低了MDA含量，且隨劑量增加仔豬抗氧化效果越好。本研究表明，丁酸梭菌可以提高黃顙魚血清中的T-AOC，GSH含量和T-SOD活性，這與羅非魚的研究結(jié)果[8]相一致。飼料中添加丁酸梭菌能夠提高黃顙魚抗氧化能力，可能是由于丁酸梭菌能夠清除動物體內(nèi)的活性氧自由基，降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[33]。

4 結(jié) 論

飼料中適宜的丁酸梭菌添加水平顯著增加黃顙魚WGR和CF，降低FCR和臟體比，提高血清LZM、AKP、SOD活性，C3、IgM含量和T-AOC，提高腸道短鏈脂肪酸含量。綜上所述，以生長性能、免疫功能和抗氧化能力為評價標(biāo)準(zhǔn)，建議黃顙魚飼料中丁酸梭菌的添加水平為200 mg/kg(5.1×108CFU/kg)。