羅 君 楊二軍 付偉杰 黃建盛,2 謝瑞濤 陳 剛,2*

(1.廣東海洋大學水產學院，湛江 524088；2.南方海洋科學與工程廣東省實驗室(湛江)，湛江 524025；3.廣東恒興飼料實業(yè)股份有限公司，湛江 524022)

槲皮素(3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮，C15H10O7)是一種在植物中廣泛存在的黃酮類化合物，具有抗炎、抗癌、抗細胞凋亡和免疫保護等生物學功能[7-9]。研究表明，飼料中添加黃酮類化合物可提高水產動物的生長性能、抗氧化和免疫能力，調節(jié)腸道微生物群落的組成[10-11]。槲皮素作為飼料添加劑對魚類生長和免疫的作用已在虹鱒魚(Oncorhynchusmykiss)[12]、斑馬魚(Daniorerio)[13]、克琳雷氏鯰(Rhamdiaquelen)[14]、金頭鯛(SparusaurataL.)[15]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[16]和草魚(Ctenopharyngodonidella)[17]上進行了研究。但由于槲皮素的水溶性差、體內代謝快、生物利用度低，限制了其在食品和醫(yī)藥領域的應用[9]。為改善槲皮素的腸道吸收和生物活性，研究人員對其進行了各種化學修飾[7-9,18]。磺化反應可提高黃酮類化合物的水溶性和生物活性[19]，1914年Watson等[20]通過在槲皮素中引入磺酸基，合成了槲皮素-5′-磺酸及槲皮素-5′-磺酸鈉(QS)?；谔囟ǖ姆肿咏Y構，QS可能是一種具有臨床應用潛力的有機金屬化合物。體外研究表明，QS可通過抑制人結腸癌細胞系HT-29增殖、誘導細胞凋亡和細胞周期停滯，發(fā)揮抗癌作用[21]。

QS具有抗氧化、抗菌和抗腫瘤活性[22-24]。動物模型研究表明，QS對重金屬中毒小鼠的器官具有一定的保護作用[25-26]。但飼料中添加QS對石斑魚生長和免疫的影響尚未見研究。為促進QS在水產動物飼料中的應用，本研究通過在飼料中添加QS，探究QS對雜交石斑魚生長性能、抗氧化能力和腸道健康的影響。

1 材料與方法

1.1 QS的化學合成及表征

試驗用所有化學品均為分析純，無需進一步純化即可使用。槲皮素(質量分數為97%，結構如圖1-A所示)購買自上海麥克林生化有限公司。

參考Czerwonka等[21]的方法制備QS，具體如下：將濃硫酸(40.0 mL)和槲皮素(10.0 g)于80 ℃水浴中加熱攪拌反應2 h。冷卻后，在連續(xù)攪拌狀態(tài)下加入適量蒸餾水，過濾得到橙紅色槲皮素-5′-磺酸沉淀，在飽和水溶液中重結晶。使用NaOH中和所得的槲皮素-5′-磺酸，過濾得到黃色沉淀并在飽和水溶液重結晶。經風干和研磨，得到黃色微晶QS產物。QS的結構如圖1-B所示。

圖1 槲皮素(3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮)(A)和槲皮素-5′-磺酸鈉(3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮-5′-磺酸鈉)結構(B)

1H NMR和13C NMR光譜在BRUKE AVANCE Ⅲ 400 MHz上測量。四甲基硅烷(TMS)作為內標。

1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ: 12.47(1H, s, 5-OH), 10.98(1H, s, 4′-OH), 10.78(1H, s, 7-OH), 9.46(1H, s, 3-OH), 9.26(1H, s, 3′-OH), 7.87(1H, d, H-2′), 7.62(1H, d, H-6′), 6.40(1H, d, H-8), 6.19(1H, d, H-6)。

13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ: 175.84(C-4), 163.99(C-7), 160.76(C-5), 156.12(C-9), 145.96(C-2), 145.46(C-3′), 144.20(C-4′), 136.10(C-3), 131.19(C-5′), 120.81(C-1′), 117.76(C-2′), 115.37(C-6′), 103.04(C-10), 98.22(C-6), 93.26(C-8)。

1.2 試驗設計

參考石斑魚的研究成果[27-28]配制基礎飼料，其組成及營養(yǎng)水平見表1。參考槲皮素的研究結果[29-30]，分別在基礎飼料中添加0、0.80、1.60、3.20 mmol/kg QS，換算為質量分數分別為0、0.381、0.762、1.524 g/kg，以槲皮素等量替代基礎飼料中的微晶纖維素。飼料制備前將所有原料粉碎過60目篩，并按照配方精確稱重。按照含量從小到大的原則逐級將QS與各飼料成分混勻，然后再將油和水分別混入，揉搓；混合物用螺桿機濕法擠出4.0 mm粒徑的顆粒飼料并于陰涼處風干。干燥后，飼料顆粒分裝于密封袋中，在-20 ℃保存直至使用。

表1 基礎飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)

1.3 試驗用魚與飼養(yǎng)管理

試驗魚取自廣東海洋大學湛江海洋高新科技園養(yǎng)殖所培育的雜交子一代幼魚。選取健康的雜交石斑魚運至廣東恒興飼料實業(yè)股份有限公司863養(yǎng)殖基地，飼喂基礎飼料暫養(yǎng)2周，禁食24 h后，取體重為(10.10±0.02)g的幼魚300尾，隨機放入12個玻璃鋼養(yǎng)殖桶(500 L，25尾/桶)。將12個玻璃鋼養(yǎng)殖桶隨機分為4組，每組3個養(yǎng)殖桶(重復)。4組試驗魚分別投喂在基礎飼料中添加0(FM組)、0.80(QSL組)、1.60(QSM組)、3.20 mmol/kg QS(QSH組)的試驗飼料，每日投喂2次(08:00和17:00)，按照體重的5%～8%飽食投喂。各組試驗魚飼養(yǎng)管理條件相同。在8周的飼養(yǎng)試驗期間，每日記錄死亡魚的數量、重量及飼料投喂量。試驗期間試驗魚在一個連續(xù)24 h通風的流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中飼養(yǎng)，水溫25～29 ℃、pH 7.5～8.0、鹽度28.0～32.0 g/L、溶氧濃度6～8 mg/L、氨氮濃度(0.03±0.01)mg/L。

1.4 樣品采集

飼養(yǎng)試驗結束后停食24 h，記錄每個養(yǎng)殖桶中試驗魚的數量和重量。每個養(yǎng)殖桶中隨機取9尾試驗魚，MS-222麻醉，其中3尾魚采集長度1 cm的后腸用于腸道核因子-κB(NF-κB)信號通路相關基因表達測定，取肝臟用于抗氧化指標測定；剩余的6尾魚在無菌狀態(tài)下剖取整腸，剝離腸道外脂肪組織后，3尾魚的整腸用于腸道菌群分析，3尾魚的整腸用于抗氧化指標測定。所取組織采用液氮速凍后在-80 ℃保存直至使用。

1.5 生長指標測定

飼養(yǎng)8周后，根據記錄的采食量、體重以及死亡魚的數量計算增重率(weight gain rate，WGR)、特定生長率(specific growth rate，SGR)、存活率(survival rate，SR)和飼料系數(feed coefficient rate，FCR)，計算公式如下：

WGR(%)=100×(終末總重-初始總重)/初始總重；SGR(%/d)=100×(ln終末總重-ln初始總重)/飼養(yǎng)天數；SR(%)=100×終末尾數/初始尾數；FCR=攝食飼料干重/(終末總重+死亡個體總重-初始總重)。

1.6 肝臟及腸道抗氧化指標測定

肝臟或腸道樣品用預冷的生理鹽水漂洗和濾紙拭干后，稱取0.4 g，加入9倍體積預冷的0.9%生理鹽水勻漿；勻漿液在4 ℃條件下以2 500 r/min離心10 min；取上清液保存在-80 ℃下直至進一步分析。使用商業(yè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutamate peroxidase，GPx)、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.7 實時熒光定量PCR檢測

將雜交石斑魚后腸樣品置于裝有液氮的研缽中研磨至粉末狀，采用TransZol UP Plus RNA Kit試劑盒(北京全式金生物技術股份有限公司)從中提取總RNA。提取的RNA溶解在120 μL不含RNase的水中，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗提取的RNA條帶，超微量核酸蛋白檢測儀檢驗RNA的純度及濃度。使用TranScript cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術股份有限公司)合成第1鏈cDNA。使用Primer 5.0軟件設計各個基因的上、下游引物序列并由上海生工生物股份有限公司合成，所有引物經過驗證后用于后續(xù)正式試驗。NF-κB信號通路相關基因主要包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、TNF受體相關因子-2(TRAF-2)、TNF受體超家族成員1A(TNFRSF1A)、干擾素-γ(IFN-γ)、絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶7(MAP3K7)、MAP3K7結合蛋白3(TAB3)、NF-κBp65亞單位(NF-κBp65)、NF-κB抑制劑-α(IκB-α)，以β-肌動蛋白(β-actin)為內參基因。本試驗使用的所有引物序列如表2所示。

表2 實時熒光定量PCR引物序列

使用PerfectStart Green qPCR Su-perMix(北京全式金生物技術股份有限公司)熒光定量試劑盒在實時熒光定量PCR擴增儀(Roche LightCycler?96 SW1.1)上進行擴增。10 μL反應體系包括5 μL SYBR Green Supermix，上、下游引物各0.5 μL，3.5 μL ddH2O和0.5 μL cDNA。熔解曲線驗證引物特異性。PCR擴增程序如下：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，循環(huán)40次。每個樣本重復3次驗證。按照2-ΔΔCt的方法[31]計算目的基因相對表達量。

1.8 腸道菌群

使用DNA提取試劑盒(MN NucleoSpin 96 Soi)提取微生物DNA；利用通用引物對(正向引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCGCAGCA-3′；反向引物806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)PCR擴增各樣品16S rRNA基因的V3～V4區(qū)序列。使用北京百邁客生物科技有限公司的Illumina HiSeq 2500平臺對純化的樣品進行高通量測序分析。

原始圖像數據文件經堿基識別分析轉化為原始測序序列，結果以FASTQ文件格式存儲。使用FLASH軟件(version 1.2.11)對原始數據進行拼接，Trimmomatic軟件(version 0.33)將拼接得到的序列進行質量過濾，UCHIME軟件(version 8.1)鑒定并去除嵌合體，生成tags。使用USEARCH軟件(version 10.0)在相似性97%的水平上對tags進行聚類，獲得操作分類單元(OTU)。基于百邁客云平臺進行微生物多樣性分析，得到α多樣性指數(Ace、Chao1、Shannon、Simpson指數)、β多樣性、物種注釋及分類學分析。

1.9 統(tǒng)計分析

使用SPSS 22.0軟件對試驗數據進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差分析顯著時采用Duncan氏法進行組間多重比較。試驗結果以“平均值±標準誤”(mean±SE)表示，P<0.05時具有顯著差異。

2 結 果

2.1 QS對雜交石斑魚生長性能的影響

由表3可知，與FM組相比，添加不同水平QS對雜交石斑魚的終末體重、WGR、SGR、SR和FCR均無顯著影響(P>0.05)，其中，QSL組的WGR和SGR相比FM組有所上升；4組的SR均大于96%。

表3 QS對雜交石斑魚生長性能的影響

2.2 QS對雜交石斑魚肝臟和腸道抗氧化指標的影響

通過測定肝臟和腸道中SOD、GPx、CAT活性和MDA含量來評估雜交石斑魚的抗氧化狀態(tài)，肝臟和腸道檢測結果分別見表4和表5。與FM組相比，QSL和QSM組的肝臟SOD、GPx和CAT活性顯著增加(P<0.05)；QSH組的肝臟CAT活性顯著高于FM組(P<0.05)，SOD和GPx活性與FM組無顯著差異(P>0.05)；各組肝臟MDA含量無顯著差異(P>0.05)。各組腸道SOD活性無顯著差異(P>0.05)；與FM組相比，3個添加QS組腸道GPx活性顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著增加(P<0.05)；QSH組腸道CAT活性顯著低于FM組(P<0.05)。

表4 QS對雜交石斑魚肝臟抗氧化指標的影響

表5 QS對雜交石斑魚腸道抗氧化指標的影響

2.3 QS對雜交石斑魚腸道NF-κB信號通路相關基因表達的影響

圖2顯示了各組雜交石斑魚腸道NF-κB信號通路相關基因的相對表達量。與FM組相比，QSL組TNF-α、TRAF-2、TNFRSF1A、IFN-γ、TAB3和MAP3K7的相對表達量顯著上調(P<0.05)，NF-κBp65和IκB-α的相對表達量無顯著變化(P>0.05)；QSM和QSH組NF-κBp65、IκB-α、TAB3和MAP3K7的相對表達量顯著下調(P<0.05)，TNF-α和IFN-γ的相對表達量顯著上調(P<0.05)，TRAF-2和TNFRSF1A的相對表達量無顯著變化(P>0.05)。

TNF-α：腫瘤壞死因子-α tumor necrosis factor-α；TRAF-2：TNF受體相關因子-2 TNF receptor-associated factor-2；TNFRSF1A：TNF受體超家族成員1A TNF receptor superfamily member 1A；IFN-γ：干擾素-γ interferon-γ；NF-κBp65：NF-κBp65亞單位 nuclear factor-κB p65 subunit；IκB-α：NF-κB抑制劑-α NF-κB inhibitor-α；MAP3K7：絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶7 mitogen-activated protein kinase kinase kinase 7；TAB3：MAP3K7結合蛋白3 MAP3K7-binding protein 3。

2.4 飼料中添加QS對雜交石斑魚腸道菌群的影響

2.4.1 腸道菌群多樣性分析

通過對雜交石斑魚腸道菌群進行16S rRNA高通量測序，樣品的平均干凈讀數為79 409，平均有效讀數為74 985?；贠TU數據的韋恩圖(圖3)顯示，4組共享的OTU數目為619個；FM組中特有OTU數目最多，為134個；QSH組中特有OTU數目最少，為75個。OTU分析表明，QS使雜交石斑魚腸道微生物群落數量降低。

FM：FM組 FM group；QSL：QSL組 QSL group；QSM：QSM組 QSM group；QSH：QSH組 QSH group。

使用QIIME2軟件，進行α多樣性指數分析。所有樣本的Good’s覆蓋率均高于99.6%，表明數據涵蓋了大多數細菌物種。α多樣性指數結果如表6所示，與FM組相比，各添加QS組OTU數目，ACE和Chao1指數無顯著差異(P>0.05)，QSL組的Simpson和Shannon指數顯著增加(P<0.05)，QSM和QSH組無顯著差異(P>0.05)。

表6 QS對雜交石斑魚腸道菌群α多樣性指數的影響

通過偏最小二乘判別分析(PLS-DA)法對雜交石斑魚腸道菌群的β多樣性進行分析，結果顯示，成分(component)1和2的主要貢獻率分別為11.75%、9.26%，4組樣本有明顯聚類趨勢，QSL和QSM組遠離FM組(圖4)，這說明QS可引起雜交石斑魚腸道菌群結構改變。

圖4 偏最小二乘判別分析

2.4.2 腸道菌群組成分析

根據物種注釋結果，4組雜交石斑魚腸道菌群在門水平上的組成見圖5-A，在屬水平上的組成見圖5-B。

由圖5-A可知，4組樣本中相對豐度大于5%的菌門共有5個，分別為厚壁菌門(Firmicutes，31.24%)、變形菌門(Proteobacteria，26.50%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，13.37%)、放線菌門(Actinobacteria，9.68%)和疣微菌門(Verrucomicrobia，5.09%)。方差分析結果(表7)顯示，與FM組相比，QSM組Firmicutes相對豐度顯著降低(P<0.05)；QSL組Bacteroidetes相對豐度顯著降低(P<0.05)，Actinobacteria相對豐度顯著增加(P<0.05)。

表7 雜交石斑魚腸道菌群門水平上的相對豐度

由圖5-B可知，除屬水平上未命名的菌群外，4組樣本中相對豐度大于2%的菌屬共有10個，分別為艾克曼菌屬(Akkermansia，4.86%)、擬桿菌屬(Bacteroides，4.77%)、不可培養(yǎng)細菌_o_Chloroplast(uncultured_bacterium_o_Chloroplast，3.33%)、暫定種_Vidania(Candidatus_Vidania，3.22%)、乳桿菌屬(Lactobacillus，2.88%)、不可培養(yǎng)細菌_f_毛螺菌科(uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae，2.86%)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium，2.80%)、瘤胃球菌科_UCG-005(Ruminococcaceae_UCG-005，2.62%)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio，2.43%)、不可培養(yǎng)細菌_f_Muribaculaceae(uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae，2.26%)。方差分析結果(表8)顯示，與FM組相比，QSL組Bifidobacterium相對豐度顯著增加(P<0.05)、Akkermansia相對豐度顯著降低(P<0.05)；QSM組Ruminococcaceae_UCG-005相對豐度顯著降低(P<0.05)。

表8 雜交石斑魚腸道菌群屬水平上的相對豐度

3 討 論

3.1 QS對雜交石斑魚生長性能的影響

黃酮類化合物是藥用植物最有效的成分之一，可提高魚類的生長速度，增強機體免疫能力[32-33]。研究發(fā)現，飼料中添加0.4 g/kg槲皮素可顯著提高草魚的WGR并降低FCR[29]。Zhai等[30]報道，飼料中添加不同水平(200、400、800和1 600 mg/kg)槲皮素后羅非魚(Oreochromisniloticus)的SGR有所提高，且高劑量更有效。在肉雞的研究中發(fā)現，飼糧中添加0、0.02%、0.04%、0.06%的槲皮素對生長指標無顯著影響[34]。槲皮素被機體吸收后主要以苷元形式存在，這種存在形式在促進生長中可能發(fā)揮重要作用[35]。但由于研究對象、飼養(yǎng)條件和使用劑量不同，目前關于槲皮素的促生長機制尚不清楚。本試驗中，QS對雜交石斑魚的生長性能無顯著影響；相比于FM組，QSL組的終末體重和WGR有上升趨勢，但隨著添加量的增加而降低?；腔磻@著提高了槲皮素的水溶性，但也可能導致QS在魚體內的吸收與代謝發(fā)生改變。此外，植物提取物對生長的促進作用呈劑量依賴性，超出最佳劑量時，可能會降低促生長作用。在草魚的研究中發(fā)現，隨著槲皮素添加量的增加，WGR有降低的趨勢[29]。Santos-Buelga等[36]發(fā)現，飼喂3.3 g/kg槲皮素可使小鼠的WGR降低29%。高劑量添加黃酮類化合物可能會抑制營養(yǎng)物質的吸收，導致促生長作用降低[29]。由于缺乏QS相關文獻，其飼用最佳添加量仍需進一步研究。

3.2 QS對雜交石斑魚抗氧化能力的影響

機體通過產生少量活性氧(ROS)增強對病原體的抵抗能力，而過量的ROS可對組織和細胞造成氧化損傷[37]。槲皮素可能通過上調抗氧化酶(如SOD、CAT和GPx)的活性抑制過量ROS的形成，從而減少細胞氧化應激[38-39]。據Cui等[40]報道，槲皮素和槲皮素-5′,8-二磺酸鹽增強了小鼠肝臟GPx和SOD活性并抑制氧化應激。本試驗中，3個添加QS組雜交石斑魚肝臟中SOD、GPx和CAT活性均顯著提高，其中QSL和QSM組增強效果更顯著，表明QS增強了雜交石斑魚肝臟的抗氧化能力，且較低劑量更有效。根據Czerwonka等[21]的研究結果，槲皮素和QS均具有高自由基清除能力，且二者清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)的能力相當。綜上所述，本試驗進一步證明了QS的抗氧化能力。

當機體ROS產生和清除之間的平衡遭到破壞時，會發(fā)生脂質過氧化，導致MDA和其他過氧化脂的積累，因此MDA含量通常用于評估細胞氧化損傷程度[41]。GPx是一種重要的抗氧化酶，可通過谷胱甘肽(GSH)還原過氧化氫(H2O2)清除氧自由基；機體中H2O2含量增加，可引起組織氧化應激[42-43]。本試驗結果顯示，QS的添加使雜交石斑魚腸道中GPx活性顯著降低，MDA含量顯著增加。Kaindl等[44]發(fā)現，槲皮素可有效抵抗結腸上皮中脂肪酸氫過氧化物(LOOH)等營養(yǎng)因素誘導的氧化應激損傷，但在無外源壓力的情況下，槲皮素可引起組織損傷。槲皮素的毒性作用可能與槲皮素清除ROS的過程中氧化形成的有毒產物有關。槲皮素能夠與人體自由基反應生成有毒的氧化產物，即槲皮素-奎寧(quercetin-quinine)，這種物質幾乎立即與GSH反應，或者在沒有GSH的情況下與蛋白質巰基反應[45-48]。此類反應一旦發(fā)生，可能會導致毒性作用，例如，通過破壞細胞膜和蛋白質的完整性而導致細胞損傷，或破壞含有巰基結構的酶的功能[49-51]。此外，在離體小鼠肝核模型系統(tǒng)中，槲皮素以劑量依賴性方式降低核GSH含量，并可能導致DNA損傷[52]。本研究中，隨著QS添加量的增加，雜交石斑魚肝臟SOD和GPx活性出現下降趨勢，腸道MDA含量顯著增加。雜交石斑魚攝入高劑量QS后，可能產生了有毒的代謝產物，這些代謝產物降低了肝臟和腸道的抗氧化能力。

3.3 QS對雜交石斑魚腸道NF-κB信號通路相關基因表達的影響

適量的炎癥因子參與損傷組織再生，可修復和愈合傷口；嚴重的炎癥會破壞正常組織和細胞，引起各種炎癥性疾病[53]。NF-κB信號通路被認為在促炎基因的表達中起主要作用[54]。TNF-α是早期炎癥發(fā)生過程中的重要成分[55]。根據Yang等[34]對肉雞的研究結果，槲皮素通過上調脾臟中TNF-α、TRAF-2、TNFRSF1B、NF-κBp65和IFN-γ和下調IκB-α的表達激活NF-κB信號通路。與Yang等[34]的研究結果一致，本試驗中，添加QS組雜交石斑魚腸道NF-κB信號通路被激活，TNF-α的相對表達量在各添加QS組中顯著上調。研究顯示，植物成分飼料添加劑對魚類炎癥基因的表達有促進作用，能夠上調TNF-α在魚腸道中的表達[56-57]。隨著QS添加量的增加，NF-κBp65的相對表達量下調，NF-κB信號通路被抑制，結合抗氧化指標測定結果，表明腸道抗氧化能力降低，這可能導致了ROS的蓄積。研究發(fā)現，ROS少量存在時，有利于NF-κB信號通路的激活，發(fā)揮抗細胞凋亡作用；當ROS大量存在時，可通過抑制NF-κB信號通路促進細胞凋亡[58-59]。

體外試驗證明QS顯著降低了HT-29結腸癌細胞系的活力，表明QS可能是潛在的抗結腸癌藥物[21]。研究發(fā)現，抗結腸癌藥物在高度增殖的正常組織(如胃腸道黏膜)中表現出了細胞毒性：通過增強細胞氧化應激、增加ROS生成并促發(fā)一系列炎癥通路，破壞腸道黏膜，引發(fā)黏膜炎[60-61]。NF-κB在此過程中起關鍵作用，可誘導炎癥基因表達和促炎細胞因子的產生，導致組織損傷和細胞凋亡[61]。這可能進一步解釋了腸道MDA含量的增加。此外，NF-κB還會導致黏附分子和環(huán)氧合酶-2(COX-2)基因表達上調[62]。COX-2是一種參與炎癥的誘導型酶，在血管內皮細胞、炎性細胞、癌性上皮和成纖維細胞中受到刺激后表達[62]。研究發(fā)現，槲皮素及其代謝物在體外和體內都表現出對COX-2的激活作用[63-64]。根據上述研究結果推測QS具有促炎活性，長期補充可能會導致腸道發(fā)生炎癥反應。然而，仍需要更多的研究來明確QS與魚類腸道炎癥反應間的聯系。

3.4 QS對雜交石斑魚腸道菌群的影響

腸道是魚類的消化和免疫器官，腸道菌群在維持宿主腸道結構功能，促進營養(yǎng)物質吸收、代謝以及調節(jié)機體免疫功能等方面具有重要作用[65]。研究表明，膳食多酚可調節(jié)腸道微生物群落的組成和活性[66]。在人類腸道中發(fā)現，腸道微生物參與黃酮類化合物在體內的轉化，發(fā)揮更強的生理功能[67]。本試驗中，菌群結構分析結果表明雜交石斑魚腸道菌群在門水平主要富集在Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria和Verrucomicrobia。這一結果與He等[68]對雜交石斑魚腸道優(yōu)勢菌群的研究結果一致。這些菌門通常構成了雜交石斑魚的腸道核心菌群，而與飲食類型無關。研究發(fā)現，Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes占各種海洋和淡水魚類腸道微生物群的90%[69-71]。這些細菌在宿主腸道的營養(yǎng)吸收和免疫反應中發(fā)揮重要作用。

通常，腸道菌群的多樣性越高，微生態(tài)系統(tǒng)越穩(wěn)定，腸道菌群多樣性降低可能導致細菌群落功能穩(wěn)定性降低，增加機體患病風險[72]。分析菌群α多樣性變化有助于從宏觀上評估QS對雜交石斑魚腸道菌群的影響。本試驗中，QS添加不影響雜交石斑魚腸道菌群的種類和豐富度。與FM組相比，QSL組的物種多樣性和均勻度變化最顯著。Xiong等[73]研究發(fā)現，幼蝦發(fā)生疾病后腸道菌群組成會發(fā)生顯著變化。

腸道中的微生物具有塑造炎癥微環(huán)境的潛力，相反，炎癥也可能會影響微生物的組成[74]。Jiang等[75]發(fā)現益生菌補充劑可通過抑制NF-κB信號通路的激活改善腸道微生物紊亂。這意味著腸道微生物失衡可能激活NF-κB信號通路導致腸炎。在本試驗中，與FM組相比，QSL組Bacteroidetes相對豐度顯著降低。譚蓉等[76]研究結果中腸道炎癥伴隨著Bacteroidetes相對豐度的下降。Lactobacillus、Bifidobacterium和Akkermansia是水產養(yǎng)殖領域最常用的益生菌種類，它們的減少會導致體內炎癥和代謝紊亂[77]。進一步從屬水平上發(fā)現，QSL組Akkermansia相對豐度顯著降低。Wang等[78]發(fā)現固腸止瀉丸可以降低與結腸炎呈正相關的Turicibacter的相對豐度，顯著增加有益菌Ruminococcaceae_UCG-005的相對豐度。在本試驗中，與FM組相比，QSM組Ruminococcaceae_UCG-005相對豐度顯著降低。因此，QS可能通過直接或間接影響腸道炎癥相關微生物的豐度調控NF-κB信號通路的激活。

4 結 論

① 飼料中添加QS不影響雜交石斑魚的生長。

② 飼料中添加QS可以提高雜交石斑魚的肝臟抗氧化能力。

③ QS通過增強腸道氧化應激、降低腸道Bacteroidetes和Akkermansia的相對豐度、激活腸道NF-κB信號通路，誘導雜交石斑魚的腸道炎癥反應。