亞秀秀，楊東旭，周桂梅，陳 健，劉振興

（唐山市農(nóng)業(yè)科學研究院，河北 唐山 063000）

土壤鹽堿化不同程度抑制植物的生長，甚至寸草不生，鹽堿地是制約我國農(nóng)業(yè)的發(fā)展的主要因素。我國鹽堿地面積約有9.913×107hm2，河北省鹽堿耕地總面積為7.8×105hm2，占總耕地面積的10.4%，河北省鹽堿地有很大的利用潛力[1]。濱海鹽堿地是河北省鹽堿地的主要類型，2010年河北省委省政府提出了以秦皇島、唐山和滄州沿海487 km海岸線為研究區(qū)域發(fā)展沿海經(jīng)濟，開展適生植物選擇的科技攻關研究，為河北省沿海地區(qū)生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展提供科技支撐[2-3]。

豌豆（Pisum sativumL.），是世界第四大食用豆類作物[4]。一年生草本，屬糧食（干豌豆）、蔬菜（鮮食豌豆）和飼料兼用型作物[5]，具有環(huán)境適應力強，耐寒冷、耐干旱以及耐貧瘠能力強等特性，且具有一定的抗鹽堿性[6]，豌豆對重金屬Pb脅迫也具有一定的耐性，可用于輕度Pb污染環(huán)境的修復[7]。河北省是我國主要的豌豆生產(chǎn)區(qū)[8]，篩選耐鹽豌豆種質(zhì)，對實現(xiàn)河北濱海鹽堿地的改良和利用，變鹽堿地為鹽堿耕地，推動我國鹽堿農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有十分重要的意義。

國內(nèi)耐鹽作物品種選育的研究報道，主要集中在水稻[9-11]、小麥[12-13]、大豆[14]、花生[15-17]和油菜[18-22]等作物，豌豆耐鹽篩選評價的研究報道很少。有研究采用梯度濃度NaCl溶液脅迫甘肅大豌豆，結果顯示100～120 mmol/L的是豌豆生長最適鹽濃度，濃度繼續(xù)升高會抑制豌豆的生長[23]。前人[24-25]對菜用豌豆、蕓豆萌發(fā)期進行NaCl溶液和NaHCO3溶液脅迫對比試驗，結果均顯示堿性鹽NaHCO3比中性鹽NaCl對種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制作用更為明顯。濱海鹽堿地土壤主要中主要陽離子是Na+，主要陰離子是Cl-，還有少量的SO42-和HCO3-，土壤pH在7.9～8.7之間[26]。本試驗為模擬天然的沿海地區(qū)土壤類型和PH值，采用NaCl、Na2S04和NaHCO3按照比例混合配置不同梯度的鹽溶液，以32個豌豆品種（品系）為材料，對豌豆萌發(fā)期進行混合鹽脅迫實驗，研究混合鹽脅迫對豌豆萌發(fā)期的影響，初步篩選一批耐鹽豌豆種質(zhì)，為后期河北沿海地區(qū)鹽堿耕地的改良利用與豌豆耐鹽堿生理研究提供基礎種質(zhì)資源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

唐山市農(nóng)業(yè)科學研究院油料雜糧研究所自育豌豆材料和國家食用豆體系豌豆新品種聯(lián)合鑒定材料32個（表1）。

表1 本試驗使用的32個豌豆材料Table 1 32 pea materials used in this test

1.2 種子處理

每個材料選籽粒飽滿、均勻的適量豌豆種子，10%NaClO浸泡消毒10 min，蒸餾水清洗3遍，吸干水分備用。

1.3 混合液配制與培養(yǎng)

根據(jù)濱海地區(qū)鹽堿地鹽分組成[26]，分別選定3種鹽NaCl、Na2SO4和NaHCO3按照摩爾比1∶2∶1混合配置鹽堿液，配置成濃度 50、100、150、200和250 mmol/L的處理液。玻璃培養(yǎng)皿（直徑大小120 mm）中放濾紙2層，每個材料分別選取已消毒豌豆種子100粒均勻放在濾紙上，設置3個重復。每個培養(yǎng)皿分別加入供試處理液40 mL，對照組（CK）加入等量的40 mL蒸餾水。光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，溫度（20±1）℃，光照12 h光照/12 h黑暗，相對濕度60%。

1.4 記錄標準

記錄萌發(fā)的種子數(shù)（芽長超過種子一半即為萌發(fā)），第3天統(tǒng)計種子發(fā)芽勢（germination potential，GP），第7天統(tǒng)計種子發(fā)芽率（germination rate，GR），每個處理隨機取10株幼苗，測芽長（shoot length，SL）、根長（root length，RL）、芽鮮重（shoot fresh weight，SFW）和根鮮重（root fresh weight，RFW）。

分別計算各個指標的相對值，各項指標相對值的計算方法參照畢新華等[27]的計算方法，各指標的相對值英文縮寫分別在前面加上“R”。

指標相對值=處理指標值/對照指標值×100%

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2007、DPS v.9.01和SPSS統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進行整理，統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度的混合鹽對豌豆種子萌發(fā)的影響

為確定篩選耐鹽豌豆種質(zhì)的混合鹽濃度，選取8個遺傳距離較遠的豌豆品種（系），分別為 QW03A、RC09、S3009、TW201630、G05429、woq（2q）-2-2-1-1、QW20和0309，5個濃度梯度混合鹽溶液進行脅迫處理試驗。結果顯示如下（圖1），與對照組相比，隨著混合鹽堿液濃度的升高，8份豌豆材料種子萌發(fā)表現(xiàn)為發(fā)芽率降低，發(fā)芽勢減慢，種子萌發(fā)芽長漸短、根長漸短、嫩芽逐漸褪綠，高濃度混合鹽對豌豆的種子萌發(fā)與生長造成嚴重迫害。8個豌豆品種（系）萌發(fā)期形態(tài)指標的測定，圖2顯示，不同濃度的混合鹽脅迫下，豌豆的相對芽長、相對根長、相對芽鮮重以及相對根鮮重均產(chǎn)生很大影響，隨著混合鹽溶液濃度的不斷升高，所測指標均不斷降低，其中相對芽鮮重與相對芽長下降更明顯，對于混合鹽溶液的敏感度相對芽鮮重>相對芽長>相對根長>相對根鮮重，混合鹽溶液濃度升高至250 mmol/L時，種子成苗數(shù)太低，不足以測量形態(tài)指標，因此未有數(shù)據(jù)。

圖1 萌發(fā)期鹽脅迫豌豆品系0309的耐鹽性表現(xiàn)Figure 1 Salt tolerance of pea strain 0309 under salt stress at germination stage

圖2 不同濃度混合鹽溶液對豌豆種子萌發(fā)期形態(tài)指標的影響Figure 2 Effects of mixed salt solution of different concentration on morphological indexes of pea germination

圖3顯示，隨著混合鹽溶液濃度的升高，種子的相對發(fā)芽率和相對發(fā)芽勢呈不斷降低的趨勢。濃度為50 mmol/L時相對發(fā)芽勢與相對發(fā)芽率降低不明顯，分別為97.34%和99.48%；濃度100 mmol/L時相對發(fā)芽勢顯著降低，相對發(fā)芽率降低不明顯，分別為72.53%和98.33%；濃度150 mmol/L時，相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽率均呈現(xiàn)迅速降低，分別下降到28.27%和69.04%，此濃度下各品種間相對發(fā)芽率的標準差也達到最大（圖4），濃度200 mmol/L種子萌發(fā)受到嚴重抑制，相對發(fā)芽勢降到8.64%，74.76%的種子完全不能萌發(fā)，濃度升高至250 mmol/L時，相對發(fā)芽勢降到3.57%，84.14%的種子完全不能萌發(fā)。綜合8個豌豆品種（系）相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽率數(shù)據(jù)顯示（圖4），150 mmol/L濃度下相對發(fā)芽率標準差達到最大，表明150 mmol/L下各個豌豆品種（系）間的發(fā)芽率差異達到最大，因此可確定為本試驗耐鹽豌豆篩選的最適宜混合鹽溶液濃度。

圖3 不同濃度混合鹽溶液對相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率的影響Figure 3 Effects of different concentration of mixed salt solution on RGP and RGR

圖4 鹽脅迫下不同品種間相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率的標準差比較Figure 4 Comparison of the SD of RGP and RGR among different varieties under salt stress

2.2 豌豆品種（系）耐鹽性主成分分析及綜合評價

混合鹽溶液濃度為150 mmol/L時，各個豌豆材料的相對發(fā)芽率差異最大，同時可保證各個豌豆材料的幼苗數(shù)，是本試驗篩選和評價豌豆耐鹽性的最適混合鹽溶液脅迫濃度。因此，利用150 mmol/L混合鹽溶液對其他24個豌豆品種（系）的萌發(fā)期進行脅迫，對測定的所有豌豆品種（系）的萌發(fā)期指標值進行統(tǒng)計學分析，每個豌豆品種（系）3次重復數(shù)據(jù)取平均值，DPS軟件對32個豌豆品種（系）指標的平均值進行方差分析結果如下（表2）。

表2 150 mmol/L鹽液濃度下各豌豆材料指標值Table 2 Index values of each pea material at the 150 mmol/L salt solution

每個豌豆品種（系）的萌發(fā)期的6個測定指標在鹽脅迫下的表現(xiàn)各不相同，通過主成分分析可以將多個指標信息降維為3個綜合指標，構建豌豆耐鹽性的綜合評價指標體系。利用DPS軟件對32個豌豆品種（系）的6個萌發(fā)期指標的平均值進行主成分分析結果如下（表3），第三個主成分的累計貢獻率達到了80.18%，能夠代表大部分的豌豆耐鹽性信息。表3中指標的貢獻率、累計貢獻率和特征向量值表明，第一主成分相對發(fā)芽率所占比率最大；第二主成分中相對芽鮮重占比例最大；第三個主成分與相對發(fā)芽勢、相對芽長和相對根長呈強正相關，其中相對發(fā)芽勢所占比率最大。因此，相對發(fā)芽率、相對芽鮮重以及相對發(fā)芽勢3個指標可以構成豌豆耐鹽性及豌豆耐鹽種質(zhì)資源篩選的評價指標。

表3 豌豆萌發(fā)期主成分分析的綜合指標及其貢獻率和特征值Table 3 Comprehensive index，contribution rate and eigenvalues of PCA of pea germination

2.3 耐鹽豌豆種質(zhì)資源初步篩選

利用SPSS統(tǒng)計軟件的WARD法對豌豆品種（系）的主成分指標數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)聚類分析（圖4），結合表2豌豆品種（系）在0.01顯著水平下的方差分析結果，將品種依照耐鹽性進行歸類。結果顯示，32個豌豆品種（系）根據(jù)耐鹽性可以分為4個等級，分別為QW27、法國618、G05429、TW201619、0309、TW201630、2014-W-503和QW28共8個萌發(fā)期高度耐鹽豌豆品種（系），QW03A、9618-2、G05428共3個耐鹽豌豆品種（系），中豌6號、G05634、QW10 TW201608、TW201616、TW201620和TW201605共7個中耐鹽豌豆品種（系），S3009、QW9、G05645、加拿大青豌豆、9017、QW20、G05638、成豌 1號、Woq（2q）-2-2-1-1以及2011-65共10個鹽敏感豌豆品種（系）。

圖5 32份豌豆材料萌發(fā)期耐鹽性聚類分析Figure 5 Cluster analysis of salt tolerance of 32 pea materials at germination stage

3 討論與結論

前人對豌豆鹽脅迫試驗研究多采用單一的中性鹽NaCl[28-30]或單一的堿性鹽NaHCO3[6]。檢測濱海鹽堿地土壤酸堿度及土壤離子成分發(fā)現(xiàn)，土壤中除了氯化鹽（NaCl）害之外，還存在硫酸鹽（Na2SO4）和堿性鹽（NaHCO3）害[26]，混合鹽溶液的配置更好模擬了濱海鹽堿地土壤成分，提高了篩選耐鹽豌豆品種（系）的準確性。豌豆萌發(fā)期鹽堿脅迫預試驗中，隨著混合鹽溶液濃度的不斷增高，豌豆種子的萌發(fā)與生長受到不同程度的抑制，不同豌豆品種（系）響應混合鹽溶液脅迫的表現(xiàn)呈現(xiàn)顯著不同，證明豌豆萌發(fā)期混合鹽脅迫法是評價豌豆種質(zhì)耐鹽性和篩選耐鹽豌豆種質(zhì)的有效方法，萌發(fā)期是耐鹽豌豆種質(zhì)篩選試驗的有效生理期。本研究結果表明了混合鹽堿液濃度150 mmol/L（pH=8.6）為篩選耐鹽豌豆的最適濃度，可作為耐鹽豌豆篩選與評價試驗的有效混合鹽濃度。前人對豌豆脅迫試驗研究中，溶液組成主要是單一NaCL、單一Na2CO3或單一NaHCO3，最適生長濃度 NaCL<100 mmol/L[28,31-32]，Na2CO3<25 mmol/L[32-33]，NaHCO3<25 mmol/L[24]。 因此不同品種間遺傳基因差異或者溶液離子組成不同，會造成脅迫試驗最適濃度各不相同，本試驗150 mmol/L為耐鹽豌豆篩選的最適混合鈉鹽（NaCL、NaHCO3、Na2SO4）脅迫濃度，可為今后豌豆耐鹽研究提供參考依據(jù)。

目前，豌豆萌發(fā)期耐鹽性指標篩選及耐鹽性評價還缺乏系統(tǒng)性的研究。植物耐鹽性的評價是一個復雜的過程，需要對多個指標進行綜合評價。本試驗利用主成分分析法對多個萌發(fā)期測量指標進行降維，結果顯示了相對發(fā)芽率、相對芽鮮重以及相對發(fā)芽勢分別在三個主成分中占的比重最大。因此相對發(fā)芽率、相對芽鮮重以及相對發(fā)芽勢等指標構成了豌豆耐鹽性及耐鹽豌豆初步篩選的評價指標體系，同張國偉[34]、王軍[35]和藺吉祥等[36]研究表明種子萌發(fā)時期的發(fā)芽率是植物耐鹽篩選的理想指標的研究結果相符。楊柯等[31]發(fā)現(xiàn)豌豆品種隴豌1號和S4008萌發(fā)時胚根對鹽脅迫更為敏感，與本試驗中相對芽長對混合鹽脅迫的敏感度大于相對根長的結果不同，可能與品種間遺傳基因的差異或鹽溶液成分相關，在今后耐鹽豌豆篩選試驗中，可以作為參考。

聚類分析根據(jù)豌豆萌發(fā)期的耐鹽能力將32個豌豆品種（系）分為了4類，高度耐鹽堿的豌豆品種（系）8個，鹽脅迫敏感豌豆品種（系）10個，根據(jù)實際需要將作為耐鹽豌豆種質(zhì)資源進行鹽堿地引種試驗。前人研究表明，豌豆受鹽分迫害嚴重主要在萌發(fā)期和苗期，篩選萌發(fā)期和苗期的耐鹽豌豆品種是鹽堿地種植及豌豆耐鹽性育種的關鍵[37]。下一步的工作，將基于萌發(fā)期初步篩選的耐鹽豌豆品種（系），苗期進行耐鹽種質(zhì)資源的進一步篩選鑒定及豌豆耐鹽育種研究，選育高耐鹽的優(yōu)良豌豆品種，為濱海鹽堿地的改良利用及豌豆耐鹽機制研究提供種質(zhì)基礎和理論依據(jù)。