鄭 倩，童一涵，孔慶博，馮士令，周莉君，丁春邦，陳 濤

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)命科學(xué)學(xué)院，四川 雅安 625014）

葉綠體是一種可以半自主遺傳的有色質(zhì)體，它參與光合作用，對地球上的所有生命都有重要意義[1]。葉綠體基因組相比較于核基因組與線粒體基因組，具有結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速率適中等優(yōu)點(diǎn)，更適合進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[2]。通過對葉綠體全基因組分析，能夠?yàn)橛H緣關(guān)系相近的物種提供有用的區(qū)分信息，如Gu C.H.等[3]利用對葉綠體基因組分析，揭示了千屈菜科22個(gè)物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，Cai C.N.等[4]認(rèn)為葉綠體全基因組在肉豆蔻科系統(tǒng)發(fā)育和一些保護(hù)遺傳學(xué)中都具有很大的潛力。葉綠體基因組在遺傳進(jìn)化方面具有重要意義。

山茶屬（Camellia）植物通常為灌木或小喬木，是山茶科（Theaceae）最大并且具有極高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的一個(gè)屬，現(xiàn)中國植物志記載有238個(gè)物種,約占所有山茶屬植物的80%以上[5-6]。毛籽紅山茶（Camellia trichosperma）是山茶屬紅山茶組（Sect.CamelliaDyer）的植物，最早在江西尋烏發(fā)現(xiàn)，其樹高可達(dá)15 m，花色紅艷，頂生，果實(shí)很大，呈球形，直徑一般為10～15 cm，葉脈不明顯，果實(shí)子房室種子被毛是其比較容易辨認(rèn)的特征[6]。由于植株數(shù)量和分布范圍等因素的影響，到目前為止，并沒有毛籽紅山茶遺傳相關(guān)的研究。

對于山茶屬物種分類情況，現(xiàn)存在3種經(jīng)典的分類系統(tǒng)，分別是Sealy分類系統(tǒng)、張宏達(dá)分類系統(tǒng)和閔天祿分類系統(tǒng)[6-8]。山茶屬植物種群分布散亂，自交和種間雜交非常普遍，造成了山茶屬親緣關(guān)系混亂，加大了對山茶屬分類工作的難度。毛籽紅山茶經(jīng)常被人誤認(rèn)為是南山茶（Camellia semiserrata），并且與浙江紅山茶（Camellia Chekiangoleosa）性狀近似[6]，通過形態(tài)學(xué)進(jìn)行分類并不可靠，可與分子手段相結(jié)合，對物種進(jìn)行區(qū)分，判斷物種間的親緣關(guān)系。毛籽紅山茶果實(shí)大，具有成為優(yōu)良油茶樹種的潛力。本研究分析毛籽紅山茶葉綠體基因組序列特征及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以期為山茶屬物種的準(zhǔn)確分類、進(jìn)化模式以及毛籽紅山茶資源進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

毛籽紅山茶的幼嫩葉片材料采自四川省雅安市天全縣（N29°59′19.61?，E102°38′34.13?，海拔1 230 m），采集的嫩葉用茶包裝好放入變色硅膠中帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與測序

將帶回實(shí)驗(yàn)室的嫩葉通過改良的CTAB法提取DNA[9]，再用1%的葡萄糖瓊脂凝膠電泳檢測DNA完整性，用核酸蛋白儀檢測DNA濃度和純度，將濃度高和純度好的DNA進(jìn)行隨機(jī)打斷、末端修復(fù)和連接接頭等測序文庫的構(gòu)建，合格的文庫用Illumina HiSeq 4000平臺進(jìn)行雙末端測序（成都基預(yù)科技有限公司）。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過去接頭污染，去低質(zhì)量序列后得到4.2 G的干凈數(shù)據(jù)（clean reads）。

1.2.2 組裝與注釋

過濾后的數(shù)據(jù)利用GetOrganelle軟件[10]進(jìn)行從頭組裝，得到一條環(huán)形葉綠體基因圖序列。用CPGAVAS2[11]序列信息進(jìn)行在線注釋，再根據(jù)已發(fā)表的同屬其他物種葉綠體基因組信息，利用Blast比對相結(jié)合再進(jìn)行人工矯正，最后向NCBI提交序列（登錄號：OK181904）。葉綠體全基因組圖譜采用在線工具OGDRAW（https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）[12]繪制完成。

1.2.3 葉綠體基因組特征分析

利用MISA軟件[13]對毛籽紅山茶的葉綠體全基因組進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜尋，其檢索程序參數(shù)設(shè)置如下：單核苷酸單元重復(fù)數(shù)不少于10，二核苷酸單元重復(fù)數(shù)不少于5，三核苷酸單元重復(fù)數(shù)不少于4，四核苷酸單元、五核苷酸單元和六核苷酸單元重復(fù)數(shù)不少于3[14]。利用codonW（http://codonw.sourceforge.net）進(jìn)行密碼子偏好性分析[15]，并利用IRscope對IR區(qū)邊界擴(kuò)張收縮分析[16]。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

為了確定毛籽紅山茶的系統(tǒng)發(fā)育位置，從NCBI下載山茶屬19個(gè)物種的葉綠體全基因組序列，以圓籽荷屬（Apterosperma）的圓籽荷（Aptero?sperma oblata，登錄號：NC035641）物種作為外類群進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。利用MAFFT7[17]進(jìn)行比對后，用MEGAX[18]對比對序列進(jìn)行校正后，再計(jì)算出最佳ML建樹模型，然后運(yùn)用Windows版IQ-tree 1.6.12構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展支持率為1 000[19]，使用iTOL在線工具（https://itol.embl.de/）對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行美化[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體全基因組基本特征分析

通過本研究得到156 605 bp核苷酸組成的毛籽紅山茶葉綠體全基因組，其葉綠體具有典型的四分體結(jié)構(gòu)特征，即一個(gè)大單拷貝區(qū)（LSC），一個(gè)小單拷貝區(qū)（SSC）和兩個(gè)相同的反向重復(fù)序列（IRs）。LSC區(qū)長度為86 256 bp，GC含量占37.5%，SSC長度為18 415 bp，GC含量占30.5%，兩個(gè)反向重復(fù)序列長度為25 967 bp，分別位于86 256～112 223 bp及130 638～156 605 bp，其GC含量占43%（圖1）。

表1 系統(tǒng)發(fā)育分析21個(gè)物種信息Table 1 Phylogenetic analysis of 21 species information

毛籽紅山茶葉綠體全基因組的注釋結(jié)果表明，其共有131個(gè)基因（表2），包含87個(gè)蛋白編碼基因，8個(gè)rRNA基因以及36個(gè)tRNA基因。其中，每個(gè)反向重復(fù)區(qū)都包含4個(gè)rRNA基因（rrn4.5S、rrn5S、rrn16S、rrn23S），7個(gè) tRNA 基因（trnI-CAU、trnLGAG、trnV-GAC、trnI-GAU、trnA-UGC、trnR-ACG、trnN-GUU）及6個(gè)蛋白編碼基因（rpl2、rpl23、ycf2、ycf15、ndhB、rps7），ycf1基因位于兩個(gè)IR區(qū)和SSC區(qū)交界處。大單拷貝區(qū)包含64個(gè)蛋白編碼基因和21個(gè)tRNA基因，小單拷貝區(qū)包含11個(gè)蛋白編碼基因（rps15、ndhH、ndhA、ndhI、ndhG、ndhE、psaC、ndhD、ccsA、rpl32、ndhF）和1個(gè)tRNA基因（trnL-UAG）。注釋結(jié)果也顯示了在毛籽紅山茶葉綠體基因中，大多數(shù)基因不具有內(nèi)含子，只有16個(gè)基因具有內(nèi)含子（表3），包含9個(gè)蛋白編碼基因和7個(gè)tRNA基因，其中只有ycf3基因和clpP基因具有兩個(gè)內(nèi)含子，其他基因均只有一個(gè)內(nèi)含子。

圖1 毛籽紅山茶葉綠體全基因組圖譜Figure 1 Complete cp genome map of Camellia trichosperma

表2 毛籽紅山茶葉綠體基因注釋信息Table 2 Gene annotation of Camellia trichosperma chloroplast genomes

表3 毛籽紅山茶葉綠體基因組中含內(nèi)含子信息Table 3 Information of gene introns in the chloroplast genome of Camellia trichosperma

2.2 葉綠體基因組SSR分析

基于對毛籽紅山茶葉綠體基因組序列分析，對其SSR位點(diǎn)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)了68個(gè)SSR位點(diǎn)（表4），除了五核苷酸重復(fù)單元，單核苷酸至六核苷酸重復(fù)單元均有出現(xiàn)。單核苷酸重復(fù)數(shù)量為48，重復(fù)類型僅有A/T，沒有G/C類型的重復(fù)。二核苷酸重復(fù)數(shù)量為4，三核苷酸僅有1次重復(fù)，四核苷酸具有AAAG/CTTT、AAAT/ATTT、ACAG/CTGT、AGAT/ATCT和AGGG/CCCT 5種重復(fù)方式，數(shù)量分別為3、4、1、3、2。從表中也可看出單核苷酸占比最大，達(dá)到70.59%，三核苷酸占比最小，為1.47%。

表4 毛籽紅山茶葉綠體SSR信息Table 4 SSRs information in chloroplast genome of Camellia trichosperma

2.3 密碼子偏好性分析

研究結(jié)果顯示，該物種除終止密碼子外，共有28 987個(gè)密碼子，數(shù)量最多的氨基酸是亮氨酸（Leu），具有2771個(gè)密碼子，占9.56%，數(shù)量最少的氨基酸是半胱氨酸（Cys），具有292個(gè)密碼子，占1.01%。本次研究結(jié)果顯示密碼子具有明顯的偏好性，RSCU等于1的氨基酸有兩個(gè)，分別為甲硫氨酸（Met）和色氨酸（Trp），RSCU大于1的密碼子種類有30個(gè)，大多數(shù)以A/U結(jié)尾（表5）。

表5 毛籽紅山茶各氨基酸相對同義密碼子使用度Table 5 RSCU analysis of protein coding region in Camellia trichosperma

（續(xù) 表5）

2.4 IR邊界的收縮與擴(kuò)張

雖然葉綠體基因進(jìn)化速度較慢，在序列和結(jié)構(gòu)上相對保守，但在IR區(qū)的邊界收縮與擴(kuò)張是普遍存在的現(xiàn)象。為了明確IR區(qū)邊界收縮與擴(kuò)張情況，本次研究從NCBI上下載了4條山茶科物種葉綠體全基因組序列，分別是南山茶（MZ403753）、浙江紅山茶（NC037472）、茶（Camellia sinensis，登錄號：MH042531）和圓籽荷（NC035641），通過與毛籽紅山茶進(jìn)行序列比對，再畫出示意圖（圖2）。其結(jié)果顯示，除了浙江紅山茶的rps19基因位于LSC區(qū)，其余4個(gè)物種rps19基因均位于LSC/IRb邊界，并且其長度都相同，其中位于LSC區(qū)部分的長度為233 bp，位于IRb區(qū)部分的長度為46 bp。毛籽紅山茶、南山茶、茶和圓籽荷rpl2基因都位于IR區(qū)內(nèi)，只有浙江紅山茶rpl2基因處在LSC/IRb邊界，基因全長1 486 bp，其中位于LSC區(qū)部分的長度為53 bp，位于IRb區(qū)部分的長度為1 434 bp。ndhF基因是位于SSC區(qū)靠近IRb區(qū)的一個(gè)蛋白編碼基因，毛籽紅山茶、南山茶、浙江紅山茶、茶和圓籽荷ndhF基因分別距邊界63、5、64、56和53 bp。ycf1基因位于SSC/IRa連接處，毛籽紅山茶、南山茶、浙江紅山茶、茶和圓籽荷ycf1基因長度分別為5 615、5 621、5 624、5 606和5 609 bp，位于SSC區(qū)長度分別是4 652、4 579、4 658、4 547和4 549 bp。5種植物trnH基因均位于LSC區(qū)，靠近IRa區(qū)，其中除浙江紅山茶trnH基因距邊界160 bp外，其余4個(gè)物種均距離LSC/IRa邊界1 bp。

圖2 山茶科6個(gè)物種葉綠體基因組四分體邊界對比圖Figure 2 Comparison of the quadripartite borders of cp genomes of six species from Theaceae

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

用MEGAX計(jì)算出最佳ML建樹模型為GTR+G+I，將毛籽紅山茶與從NCBI上下載的20種山茶科植物通過最大似然法（ML）建立了系統(tǒng)發(fā)育樹。其結(jié)果顯示，圓籽荷作為外類群，其分支最長，毛籽紅山茶與山茶（Camellia japonica）和浙江紅山茶處在一個(gè)小分支上，自展支持率為87.8%（圖3），結(jié)果可信度較高，說明毛籽紅山茶與山茶和浙江紅山茶親緣關(guān)系較近，這與張宏達(dá)系統(tǒng)分類結(jié)果一致，但相較于同組的南山茶和滇山茶，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 基于21個(gè)物種完整葉綠體基因組的ML系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 The ML phylogenetic tree based on 21 species of complete chloroplast genomes

3 討論

從1986年K.Ohyama等[21-22]第一次測出地錢（Marchantia polymorphaL.）和煙草（Nicotiana taba?cumL）葉綠體全基因組序列至今，無數(shù)學(xué)者通過對植物葉綠體全基因組序列的分析，解決了許多分類及系統(tǒng)發(fā)育等關(guān)鍵問題。Xu G.Y.等[23]通過對葉綠體序列分析解決了中國野生葡萄、歐亞葡萄以及北美葡萄親緣關(guān)系問題。從NCBI數(shù)據(jù)庫可知，目前已能在線查看137種山茶屬植物葉綠體全基因組信息以及3種未經(jīng)證實(shí)的葉綠體全基因組信息，其cpDNA長度變化不大，從150～160 kb不等，都具有典型的四分體結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)變化比較保守，并且序列中GC含量越高，序列越保守。本次研究中，將毛籽紅山茶葉綠體全基因組序列信息提交到NCBI數(shù)據(jù)庫，豐富了數(shù)據(jù)庫中山茶屬葉綠體基因組的數(shù)據(jù)。LSC/IR區(qū)和SSC/IR區(qū)收縮與擴(kuò)張除了影響其長度，也是葉綠體進(jìn)化發(fā)展的重要影響因素[24-25]。董婉琳通過對棉屬葉綠體基因組IR區(qū)邊界的收縮與擴(kuò)張分析，認(rèn)為可以用此對葉綠體基因組多樣性進(jìn)行更直接的描述[26]。本次研究通過比較IR區(qū)邊界附近的基因位置和長度（rps19、rpl2、ndhF、ycf1、trnH），來表現(xiàn)基因的收縮與擴(kuò)張，其結(jié)果顯示除浙江紅山茶外，其他4個(gè)物種在IR區(qū)的邊界區(qū)別較小，基因長度和距邊界的距離差異不大，這與李倩等對貴州威寧紅花油茶研究結(jié)果相同[27]。不同物種在IR區(qū)邊界收縮與擴(kuò)張情況存在差異，這對葉綠體IR區(qū)邊界情況的研究具有意義，能為系統(tǒng)發(fā)育和物種鑒定提供依據(jù)。

簡單重復(fù)序列（SSR）是指1～6個(gè)核苷酸為單位，經(jīng)過串聯(lián)形成重復(fù)的DNA序列，形成的幾十至幾百堿基序列，并大量存在于生物體的基因組中，影響著細(xì)胞多種生命活動(dòng)，位于非編碼區(qū)的SSR比位于編碼區(qū)的變化更大[28-29]。因?yàn)镾SR分子標(biāo)記是一種共顯性標(biāo)記，操作簡單，所以普遍運(yùn)用于植物遺傳多樣性的分析，在種屬間也表現(xiàn)為堿基組成差異[30-31]。本次研究中SSR分析結(jié)果顯示，占比最大的是單核苷酸A/T類型，占70.59%，沒有出現(xiàn)G/C類型。也出現(xiàn)了二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸和六核苷酸類型，沒有出現(xiàn)五核苷酸重復(fù)類型。SSR位點(diǎn)的確定，為SSR分子標(biāo)記的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

生物界中廣泛存在密碼子的偏好性現(xiàn)象，突變、遺傳漂變和自然選擇等是密碼子偏好性產(chǎn)生的決定性因素[15]。氨基酸密碼子偏好性是由于同義密碼子出現(xiàn)的概率不同，造成了部分同義密碼子出現(xiàn)概率更高[32]。同義密碼子使用頻率（RSCU）能夠直觀反映出密碼子使用的偏好性，一個(gè)密碼子使用頻率較高，則其RSCU值大于1，密碼子沒有偏好性，則RSCU值等于1[33]。RSCU等于1的氨基酸有兩個(gè)，分別為甲硫氨酸（Met）和色氨酸（Trp），它們只有一種編碼氨基酸的密碼子，不具有密碼子偏好性，毛籽紅山茶密碼子更偏向于A/U結(jié)尾，探究生物的密碼子偏好性，可以通過改變密碼子，提高蛋白質(zhì)表達(dá)量。

研究結(jié)果顯示毛籽紅山茶和浙江紅山茶親緣關(guān)系最近，在張宏達(dá)分類系統(tǒng)中，他們同屬于紅山茶組，雖然滇山茶和浙江紅山茶都屬于紅山茶組，但南山茶屬于滇山茶亞組（Subsect.ReticulataChang）,而浙江紅山茶屬于光果紅山茶亞組（Subsect.Lucidis?simaChang）,這可能是滇山茶和浙江紅山茶處在不同亞支的原因，在張宏達(dá)分類系統(tǒng)中，把毛籽紅山茶也歸于滇山茶亞組，本次研究結(jié)果顯示毛籽紅山茶歸于光果紅山茶亞組更合適。短柱茶和茶梅在一個(gè)小分支上，本次分析結(jié)果支持陳凱[34]不把短柱茶組歸屬于油茶組。譚曉風(fēng)等[35]利用RAPD引物分析，認(rèn)為茶梅和油茶親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，本文研究結(jié)果也不支持將兩者放在一個(gè)分類組中。毛肋茶與茶組物種在一個(gè)分支上，所以研究結(jié)果也支持Huang H.等[36]的結(jié)論，支持張宏達(dá)系統(tǒng)中將毛肋茶分到茶組中。通過系統(tǒng)發(fā)育分析，能為物種間的親緣關(guān)系判別提供有效依據(jù)。

本研究首次報(bào)道了毛籽紅山茶葉綠體基因組序列，并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)、SSR、密碼子偏好性、IR區(qū)邊界收縮與擴(kuò)張及系統(tǒng)發(fā)育分析，判斷了毛籽紅山茶與其他部分山茶屬植物的親緣關(guān)系。這些研究結(jié)果為毛籽紅山茶資源的利用開發(fā)以及保護(hù)提供參考依據(jù)。