張 敏，王學(xué)峰，馬 利，劉佳杰，張慧玲，王茅雁

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

土壤鹽漬化和干旱嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量及品質(zhì)，成為影響全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要非生物脅迫。植物在演化過程中形成了復(fù)雜的機(jī)制來應(yīng)對(duì)這些逆境脅迫，其中耐逆基因的表達(dá)是形成復(fù)雜耐逆機(jī)制的遺傳基礎(chǔ)[1]。目前已從許多植物中鑒定出大量耐逆相關(guān)基因，其中脫水應(yīng)答蛋白22(responsive to dehydration protein 22，RD22)類基因與植物的耐鹽性和耐旱性密切相關(guān)，成為重要候選耐逆基因。

RD22s屬于植物特有的BURP(取自最初4個(gè)成員BNM2、USP、RD22和PG1β的首字母)蛋白家族中的一個(gè)亞族[2]。至今已相繼從擬南芥(Arabidopsisthaliana)、大豆(Glycinemax)和蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)等許多植物中克隆或發(fā)現(xiàn)其編碼基因[3-8]，并對(duì)部分基因的功能進(jìn)行了研究。序列分析表明，大多數(shù)RD22蛋白從N端至C端由4部分組成，即短疏水區(qū)(多為信號(hào)肽)、短保守區(qū)、含TXV重復(fù)單元的可變區(qū)和長(zhǎng)而保守的BURP結(jié)構(gòu)域[3-5,9-11]，其中多數(shù)蛋白如大豆GmRD22、陸地棉(Gossypiumhirsutum)GhRDL1和擬南芥AtRD22等定位于細(xì)胞壁或質(zhì)外體[9-11]，個(gè)別如咖啡(Coffeaarabica)CaBDP1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[12]。

目前對(duì)于RD22類基因的生理功能所知不多。AtRD22的表達(dá)受脫水、鹽脅迫和外源脫落酸(abscisic acid, ABA)誘導(dǎo)，此過程需ABA信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄激活因子AtMYC2/rd22BP1和AtMYB2的合成與調(diào)節(jié)[3,13-14]，其突變體的耐旱性增強(qiáng)[15]。AtRD22還受Cu2+脅迫的誘導(dǎo)，其編碼蛋白可與Cu2+結(jié)合并在抵抗Cu2+脅迫中起重要作用[16-17]。紫桿檉柳(Tamarixandrossowii)Tard22、多枝檉柳(T.ramosissima)Trrd22和葡萄(Vitisvinifera)VvRD22a/VvRD22的表達(dá)受鹽和/或干旱脅迫的誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)入煙草(Nicotianabenthamiana)可提高耐鹽性和/或耐堿性[7,18-21]。大豆Gm06.2/GmRD22的啟動(dòng)子區(qū)含ABA應(yīng)答元件ABRE(ABA responsive element)，其表達(dá)對(duì)ABA、鹽和滲透脅迫有明顯響應(yīng)，轉(zhuǎn)入擬南芥或水稻(Oryzasativa)可提高木質(zhì)素含量和耐鹽性及耐旱性[6,9]?？Х菴aBDP1的表達(dá)被干旱、鹽和低溫脅迫抑制而下調(diào)，但受ABA誘導(dǎo)，其轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性降低、ABA敏感性增強(qiáng)[12]。其他RD22基因中有許多在干旱、鹽和/或低溫脅迫下表達(dá)量上調(diào)，其中又有多數(shù)基因，如油菜(Brassicanapus)BnBDC1、鹽穗木(Halostachyscaspica)HcRd22和小麥(Triticumaestivum)TaBURP3D等的表達(dá)受外源ABA調(diào)節(jié)，可能通過依賴于ABA的信號(hào)途徑發(fā)揮功能[4,22-23]，但它們?cè)诘挚鼓婢澈虯BA脅迫中的具體作用未見報(bào)道。有少數(shù)RD22基因主要參與生長(zhǎng)發(fā)育過程，如陸地棉GhRDL1/GhRD4在伸長(zhǎng)的棉纖維細(xì)胞中高表達(dá)，其編碼蛋白通過與細(xì)胞壁伸展蛋白GhEXPA1互作而使細(xì)胞壁松弛，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥和棉花的生長(zhǎng)并使其明顯增產(chǎn)[10]。最近報(bào)道該基因?qū)}、熱和滲透脅迫及ABA均有響應(yīng)[24]。

蒙古沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)是豆科沙冬青屬的一個(gè)種，為古老的珍稀瀕危常綠闊葉強(qiáng)旱生灌木，主要分布于中國(guó)西北干旱荒漠區(qū)，具有很強(qiáng)的耐寒、耐旱和耐鹽堿特性[25]。前期通過構(gòu)建cDNA文庫(kù)從該物種獲得一段RD22基因的cDNA序列，命名為AmRD22。本研究對(duì)該基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)分析和轉(zhuǎn)基因功能鑒定，為其耐逆功能和作用機(jī)理研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

蒙古沙冬青種子由內(nèi)蒙古巴彥淖爾市磴口縣林業(yè)局提供，野生型擬南芥(哥倫比亞0型)種子、植物表達(dá)載體pCOMBIA3301(p3301)、大腸桿菌(E.coli)菌株DH5α和根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.1 野外取樣蒙古沙冬青野外植株的嫩葉采自內(nèi)蒙古蒙草抗旱股份有限公司野生植物園區(qū)的成年植株，地點(diǎn)位于呼和浩特市南郊，取樣于2013年7月-2014年5月按月進(jìn)行。

1.1.2 脅迫處理將蒙古沙冬青種子用1.0%的次氯酸鈉溶液滅菌15 min，用滅菌水漂洗5次，置于鋪有濾紙、加適量滅菌水的培養(yǎng)皿中，于25 ℃催芽4 d。將萌發(fā)的種子移栽到河沙土中，于25 ℃、每天16 h光照和8 h黑暗下培養(yǎng)2個(gè)月，然后對(duì)幼苗進(jìn)行不同脅迫處理：(1)干燥失水。從培養(yǎng)盆中取出幼苗并用自來水漂洗干凈，置于25 ℃下自然干燥；(2)鹽脅迫。用300 mmol/L的NaCl溶液澆幼苗一次；(3)低溫。將盆栽苗放入低溫光照培養(yǎng)箱(BD-PRX-1000A，下同)中進(jìn)行4 ℃/12 h、0 ℃/10 h和-6 ℃/2 h的連續(xù)降溫處理；(4)ABA處理。從培養(yǎng)盆中取出幼苗并用自來水漂洗干凈，先浸根于1×MS大量元素培養(yǎng)液中24 h(預(yù)處理)，再浸根于含100 μmol/L ABA的1×MS大量元素培養(yǎng)液中，用小氣泵通氣。

4種處理均在處理前(0 h，對(duì)照)和處理開始后1、3、8和24 h各取5株幼苗為樣品，其中鹽和低溫處理分別用室溫和4 ℃預(yù)冷的自來水漂洗根部沙土。所有樣品用液氮速凍后保存于-76 ℃。

1.2 方 法

1.2.1 基因克隆以AmRD22部分序列(852 bp，5′端不完整)為模板設(shè)計(jì)引物5′-GTTTCTTTGTCTACTTCAGTGGATAC-3′(outer)和5′-CTTTT-CCTCACCTCTAATGCCAG-3′(inner)，利用TaKaRa公司5′-RACE試劑盒進(jìn)行5′-RACE反應(yīng)，獲得其5′端序列并與原序列拼接，得到其全長(zhǎng)cDNA序列。在此序列的編碼區(qū)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物5′-AAAGATCTACCTCTACCACCACCAAG-3′(上游，加BglⅡ切點(diǎn))和5′-GTGGTCACCTAAATCTACTTGGGAAC-3′(下游，加BstEⅡ切點(diǎn))，以蒙古沙冬青低溫脅迫全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)[26]為模板進(jìn)行PCR。將擴(kuò)增片段與pMD19-T載體(TaKaRa公司)連接并用熱激法轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，經(jīng)菌落PCR檢測(cè)獲得陽(yáng)性克隆，送北京華大基因公司測(cè)序。

1.2.2 蛋白序列分析利用DNAMAN軟件預(yù)測(cè)分子量和等電點(diǎn)；利用Myhits SIB Motif Scan(https://myhits.sib.swiss/cgi-bin/motif_scan)檢索BURP結(jié)構(gòu)域；利用SignalP 5.0 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)分析信號(hào)肽；利用Plant-mPLoc server 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu. cn/bioinf/plant-multi/)預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位；利用MEGA7.0軟件通過鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹，均采用默認(rèn)參數(shù)。

1.2.3 基因表達(dá)分析用Trizol法從-76 ℃凍存樣品中提取總RNA，經(jīng)DNase(TaKaRa公司)純化后用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa公司)合成cDNA第一鏈，以蒙古沙冬青AmActin作為內(nèi)參基因(5′-TGTTTCCGGGTATTGCTGAC-3′和5′-ACCCAGAGCCATCAAATAAG-3′)，用AmRD22特異引物5′-TGTGCCTTTGGAAGGTGCGG-3′和5′-TCTACTTGGGAACCCAGACAACG-3′進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)體系中含10×EasyTaq酶緩沖液1.5 μL、dNTPs(2.5 mmol/L each)1.2 μL、上下游引物各0.3 μL(10 μmol/L)、EasyTaq酶(5 U/μL，北京全式金生物技術(shù)有限公司)0.15 μL，cDNA模板(稀釋10倍)經(jīng)內(nèi)參基因均一化而定，用ddH2O補(bǔ)足至15 μL。PCR程序?yàn)?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min；4 ℃保溫。產(chǎn)物在1.8%瓊脂糖凝膠上電泳，利用Image J軟件掃描膠圖得出灰度值，計(jì)算處理樣品相對(duì)于其對(duì)照樣品(灰度值為1)的變化倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化擬南芥用質(zhì)粒小提試劑盒(天根生物公司)提取克隆載體pMD19-AmRD22和植物表達(dá)載體p3301 DNA，用BglⅡ和BstEⅡ(TaKaRa公司)進(jìn)行雙酶切。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離、目的片段回收和連接反應(yīng)，然后用熱激法轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。再經(jīng)菌落PCR檢測(cè)和質(zhì)粒酶切鑒定(BglⅡ和BstEⅡ)獲得重組表達(dá)載體。將其用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101并用AmRD22引物進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，所得陽(yáng)性克隆用于配制轉(zhuǎn)化菌液。

用常規(guī)方法將野生型擬南芥培養(yǎng)至花蕾初現(xiàn)，采用農(nóng)桿菌蘸花法對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化，按照張文君等[27]方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化幼苗的篩選與PCR和半定量RT-PCR檢測(cè)，獲得AmRD22表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)基因株系。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥耐逆性鑒定用T3代純合體進(jìn)行耐逆性鑒定：(1)耐旱性鑒定。將種子在附加300或350 mmol/L甘露醇的1/2 MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將2～3周齡的盆栽苗停止?jié)菜?5～18 d，再恢復(fù)正常澆水；(2)耐鹽性鑒定。將種子在附加150或175 mmol/L NaCl的1/2 MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將盆栽10～15 d的幼苗澆200或300 mmol/L的NaCl溶液一次，4 d后恢復(fù)正常澆水；(3)耐冷耐凍性鑒定。將種子點(diǎn)種于1/2 MS培養(yǎng)基上于4 ℃放置3 d，然后放入6～8 ℃低溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將2～3周齡盆栽苗依次進(jìn)行4 ℃/24 h、-6 ℃/6～8 h和4 ℃/24 h處理，之后恢復(fù)正常培養(yǎng)；(4)ABA敏感性鑒定。將種子在附加0.75或1.00 μmol/L ABA的1/2 MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)；(5)Na+含量測(cè)定。用250 mmol/L的NaCl溶液澆3周齡盆栽苗一次，5 d后收集幼苗并用自來水和ddH2O漂洗干凈，置于80 ℃烘干至衡重，用原子吸收分光光度計(jì)(Zeenit Toop，Jenna，Germany)測(cè)定Na+含量。

上述實(shí)驗(yàn)均以野生型擬南芥為對(duì)照，每次實(shí)驗(yàn)每份材料至少用50粒種子或20株幼苗，實(shí)驗(yàn)過程中觀測(cè)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)與存活等狀況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3～5次。利用SPSS軟件包中的Duncan法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因株系與野生型之間的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AmRD22基因的克隆及其編碼蛋白分析

在前期得到了AmRD22的部分cDNA序列，其5′端不完整。本研究通過5′-RACE(圖 1，A)得到其5′端序列(761 bp)，與原序列拼接后獲得其全長(zhǎng)cDNA序列(1 495 bp)，其中包含1 080 bp的完整編碼區(qū)。再通過PCR，從蒙古沙冬青低溫脅迫全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)[26]中擴(kuò)增到該編碼區(qū)片段(圖 1，B)。推測(cè)其編碼蛋白含360 aa，相對(duì)分子質(zhì)量為38.8 kD，等電點(diǎn)為8.4，初級(jí)結(jié)構(gòu)由N末端21 aa的信號(hào)肽序列、34 aa的保守區(qū)、含3個(gè)TXV重復(fù)單元(TXVXVGKGGVNVXAX0～2KGKP，其中X為任意aa，0～2為其數(shù)目，后同)的可變區(qū)(92 aa)和C端213 aa的BURP結(jié)構(gòu)域組成(圖 1，C)。信號(hào)肽中有16個(gè)疏水性aa，可變區(qū)重復(fù)單元中含T-V-VG-GGV保守序列，BURP結(jié)構(gòu)域中含4個(gè)高度保守的半胱氨酸(C)-組氨酸(H)基序(排列方式：CHX10CHX25CHX25CH)和蘇氨酸、脯氨酸、纈氨酸、色氨酸(T、P、V、W)等高保守殘基。此外，預(yù)測(cè)到AmRD22蛋白定位于細(xì)胞壁。

用AmRD22序列在GenBank中進(jìn)行BlastP，發(fā)現(xiàn)與其序列相似性高的前3個(gè)蛋白依次為白羽扇豆(Lupinusalbus，78.0%)、狹葉羽扇豆(L.angustifolius，78.0%)和相思子(Abrusprecatorius，74.0%)的RD22或BURP蛋白，但目前尚未查到其研究報(bào)道。用AmRD22和其他植物中功能較明確的5個(gè)RD22蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)它與大豆GmRD22(ACM47360)和葡萄VvRD22(AAV36561)的關(guān)系較近，而與陸地棉GhRDL1(AAL67991)、擬南芥AtRD22(NP_197943)和咖啡CaBDP1的關(guān)系較遠(yuǎn)(圖 2)。AmRD22與這些蛋白的序列相似性在45.4%～73.0%。

2.2 AmRD22基因的表達(dá)分析

室內(nèi)培養(yǎng)下蒙古沙冬青幼苗中AmRD22在不同脅迫處理下的表達(dá)結(jié)果(圖 3，A、B)顯示：正常培養(yǎng)條件下(0 h，對(duì)照)該基因有明顯表達(dá)；干燥失水1～8 h后其表達(dá)量持續(xù)增加，24 h后明顯回落但仍顯著高于對(duì)照，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均表達(dá)量為對(duì)照的3.2倍；鹽脅迫1～8 h其表達(dá)量顯著高于對(duì)照，24 h后則顯著低于對(duì)照，平均表達(dá)量為對(duì)照的1.4倍；低溫處理期間其表達(dá)量呈現(xiàn)升-降-升的變化趨勢(shì)，但均顯著高于對(duì)照，平均為對(duì)照的3.7倍；ABA處理1～8 h其表達(dá)量也顯著高于對(duì)照，平均為對(duì)照的2.6倍，其中處理3 h表達(dá)量最高。這些結(jié)果說明4種脅迫處理均可誘導(dǎo)AmRD22的表達(dá)量顯著上調(diào)，但在時(shí)間進(jìn)程和變化幅度上有所不同。

不同季節(jié)野外生長(zhǎng)蒙古沙冬青成年植株葉片中AmRD22的表達(dá)變化模式(圖 3，C、D)表明，在7月上旬該基因只有少量表達(dá)，進(jìn)入9月下旬其表達(dá)量明顯升高；從10月中旬至翌年1月中旬(中秋至隆冬)其表達(dá)量遠(yuǎn)高于前2個(gè)月；在3月中旬和5月中旬其表達(dá)量又變得非常微弱。如以該基因在7月上旬(氣溫較適宜)的表達(dá)量作為對(duì)照，從10月中旬至翌年1月中旬其表達(dá)量平均上調(diào)了6.9倍。由此可見，AmRD22參與了蒙古沙冬青對(duì)秋、冬季寒冷天氣的響應(yīng)。

2.3 AmRD22轉(zhuǎn)基因擬南芥耐逆性鑒定

成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體p3301-35S-AmRD22并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥。對(duì)所得T1和T2代幼苗分別進(jìn)行PPT篩選、PCR檢測(cè)和半定量RT-PCR分析(圖 4)，獲得了4個(gè)AmRD22表達(dá)量較高的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系R1、R3、R5和R9，用其T3代純合體進(jìn)行耐逆性鑒定。

2.3.1 耐旱性鑒定耐旱性鑒定首先在種子萌發(fā)期進(jìn)行，結(jié)果見圖 5。在1/2 MS培養(yǎng)基(0 mmol/L甘露醇)上，4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系與野生型(WT)的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)狀況無明顯差異，但在其中附加300或350 mmol/L甘露醇后，前者的萌發(fā)和生長(zhǎng)狀況均好于后者。以附加300 mmol/L甘露醇培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d時(shí)為例，WT的萌發(fā)率和幼苗根長(zhǎng)分別為58.8%和4.5 mm，而4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系分別為63.4%～78.3%和5.8～6.8 mm，其中R3、R5和R9株系的萌發(fā)率或根長(zhǎng)顯著大于WT。然而，進(jìn)一步在苗期進(jìn)行控水干旱和復(fù)水處理，未發(fā)現(xiàn)4個(gè)株系與WT在耐旱性上存在明顯差異。這些結(jié)果表明，AmRD22的組成型表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥在種子萌發(fā)期的耐旱性。

2.3.2 耐鹽性鑒定轉(zhuǎn)基因株系種子萌發(fā)期耐鹽性的鑒定結(jié)果見圖 6。在不含NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因株系與WT的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)狀況相近，而在附加150或175 mmol/L NaCl的培養(yǎng)基上前者明顯好于后者。培養(yǎng)7 d時(shí)統(tǒng)計(jì)，WT在這兩種培養(yǎng)基上的萌發(fā)率分別為51.5%和21.7%，而4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系分別為76.8%～90.9%和55.4%～65.9%，均顯著高于WT；WT的根長(zhǎng)分別為4.2 mm和2.1 mm，而4個(gè)株系的根長(zhǎng)分別為6.0～7.8 mm和4.0～4.4 mm，其中R3、R5和R9株系顯著長(zhǎng)于WT。

苗期耐鹽性的鑒定結(jié)果見圖 7。未澆鹽水前，4個(gè)株系與WT之間無明顯差異。當(dāng)澆以200 mmol/L的NaCl溶液后，WT幼苗的生長(zhǎng)受到明顯抑制且有少數(shù)蓮座葉變得枯黃，而轉(zhuǎn)基因幼苗受抑制的程度明顯較輕且葉色基本正常(圖 7，A)；澆鹽水20 d后測(cè)量株高，WT為12.6 mm，而4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系為29.4～36.0 mm，均顯著高于WT(圖 7，B)。若澆以300 mmol/L的NaCl溶液，WT會(huì)受到明顯傷害且大部分幼苗逐漸枯死，而轉(zhuǎn)基因幼苗受傷害的程度較輕，有部分幼苗能夠存活下來(圖 7，C)；澆鹽水15 d后統(tǒng)計(jì)存活率，WT為33.1%，而4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系為60.9%～72.5%，均顯著高于WT(圖 7，D)。

上述結(jié)果表明，AmRD22的組成型表達(dá)顯著提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥在種子萌發(fā)期和苗期的耐鹽性。4個(gè)株系相比，以R3和R9株系的耐鹽性較高(圖 6；圖 7，A-D)，為此測(cè)定了二者的Na+含量。從圖 7，E可見，澆250 mmol/L的NaCl溶液5 d后，R3和R9株系的Na+含量均低于WT，表明AmRD22的組成型表達(dá)減少了轉(zhuǎn)基因擬南芥中Na+的積累。

2.3.3 ABA敏感性鑒定眾所周知，ABA對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)有抑制作用[28]，上述表達(dá)分析也顯示外源ABA可誘導(dǎo)AmRD22表達(dá)量上調(diào)，為此觀測(cè)了轉(zhuǎn)基因種子在ABA脅迫下的萌發(fā)狀況。結(jié)果顯示，在附加0.75或1.00 μmol/L ABA的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因種子在培養(yǎng)早期的萌發(fā)速度和胚根生長(zhǎng)快于WT，但在培養(yǎng)一周左右這種差異基本消失。圖 8為培養(yǎng)4 d時(shí)的觀測(cè)結(jié)果，其中R3和R9株系與WT的萌發(fā)率和/或幼苗根長(zhǎng)有顯著差異。這表明AmRD22可降低轉(zhuǎn)基因擬南芥在種子萌發(fā)早期對(duì)外源ABA抑制的敏感性。

此外，對(duì)轉(zhuǎn)基因株系在種子萌發(fā)期和苗期的耐冷耐凍表型進(jìn)行了觀察，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有明顯變化。

上述結(jié)果表明，AmRD22主要在耐鹽性中發(fā)揮功能，在耐旱性和ABA敏感性中也起一定作用，但對(duì)低溫耐性無明顯影響。

3 討 論

RD22s是植物中普遍存在的一類逆境相關(guān)基因，其編碼蛋白多數(shù)由N端信號(hào)肽、短保守區(qū)、可變區(qū)和BURP結(jié)構(gòu)域4部分組成[2]，也有少數(shù)RD22，如OsBURP05和ZmBURP04的編碼蛋白無信號(hào)肽或BURP結(jié)構(gòu)域不完整[29-30]。N端信號(hào)肽的存在意味著其屬于分泌性蛋白，可能定位于細(xì)胞壁或質(zhì)外體并在此發(fā)揮功能，此推測(cè)已在GmRD22、GhRDL1和AtRD22得到驗(yàn)證[9-10]。可變區(qū)是不同RD22蛋白間差異最明顯的部分，主要由所含TXV重復(fù)單元數(shù)不同導(dǎo)致。多數(shù)RD22蛋白可變區(qū)內(nèi)含3～5個(gè)TXV重復(fù)，每個(gè)重復(fù)單元中常含有T-V-VG-GGV保守序列，可能對(duì)維持RD22蛋白的結(jié)構(gòu)和功能起重要作用[2,5]。BURP結(jié)構(gòu)域是RD22亞族最保守的區(qū)域，常含有4個(gè)排列較穩(wěn)定的CH基序和T、P、W等高保守殘基[6-8,24]，對(duì)決定其亞細(xì)胞定位和行使功能非常重要[9-10,17]。本研究發(fā)現(xiàn)AmRD22基因的編碼蛋白含有RD22亞族的上述4部分區(qū)域，并且其可變區(qū)內(nèi)的T-V-VG-GGV保守序列和BURP結(jié)構(gòu)域中的CH基序及T、P等高保守氨基酸齊全，故屬于典型的RD22亞家族成員，具備行使功能的基本結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在分子進(jìn)化上，AmRD22與生理功能較明確的GmRD22和VvRD22關(guān)系較近，而與GhRDL1、AtRD22和CaBDP1關(guān)系較遠(yuǎn)。這些信息為研究AmRD22的功能提供了重要參考依據(jù)。

前人發(fā)現(xiàn)RD22類基因的主要功能是參與對(duì)干旱/失水和鹽脅迫的響應(yīng)并影響植物的耐鹽性和耐旱性，其中GmRD22、Tard22、Trrd22和VvRD22對(duì)耐鹽性和/或耐旱性起正調(diào)節(jié)作用[9,19-21]，而CaBDP1和AtRD22的作用與之相反[12,15]。蒙古沙冬青具有很強(qiáng)的綜合耐逆性，尤其以超常的耐寒性而著稱[25]，挖掘其耐寒基因是我們主要的研究興趣和目標(biāo)所在。本研究發(fā)現(xiàn)AmRD22在失水、高鹽和低溫脅迫、尤其是秋季和冬季寒冷天氣下表達(dá)量明顯增加，推測(cè)其可能在抵御這些逆境、尤其是低溫逆境中起重要作用。然而，將該基因轉(zhuǎn)入擬南芥中表達(dá)顯著提高了其耐鹽性，其次是耐旱性，而對(duì)其耐冷性和耐凍性無明顯影響。這可能與異源表達(dá)和擬南芥本身具有較強(qiáng)的耐低溫特性有關(guān)，也可能是該基因自身的耐冷、耐凍功能本就微弱使然。由于蒙古沙冬青遺傳轉(zhuǎn)化體系尚未建立，我們已構(gòu)建AmRD22轉(zhuǎn)基因楊樹和水稻并開展相關(guān)工作，以期進(jìn)一步驗(yàn)證其耐逆功能和利用價(jià)值。

有關(guān)RD22s的耐逆作用機(jī)制目前所知甚少，僅有Wang等[9]報(bào)道與木質(zhì)素有關(guān)。木質(zhì)素是植物細(xì)胞壁的重要組分[31]，尤其在根內(nèi)皮層細(xì)胞壁上的凱氏帶中大量沉積[32-33]。它不僅能增強(qiáng)細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度和保護(hù)作用，而且可阻止離子和水分通過質(zhì)外體途徑進(jìn)出植物體，在適應(yīng)或抵抗高鹽和干旱等逆境脅迫中起重要作用[31-33]。Wang等[9]發(fā)現(xiàn)，GmRD22定位于質(zhì)外體并可與催化木質(zhì)素聚合的細(xì)胞壁過氧化物酶GmPer1互作，將GmRD22在擬南芥和水稻中表達(dá)可提高二者對(duì)高鹽和滲透脅迫的耐受性及木質(zhì)素含量，同時(shí)GmPer1在擬南芥和水稻中的同源基因受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)量明顯上調(diào)。據(jù)此他們認(rèn)為GmRD22可能與轉(zhuǎn)基因植株中的Per1類蛋白互作并激活其酶活性，從而促進(jìn)了木質(zhì)素的合成，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在脅迫條件下的完整性和植株的耐逆性。我們發(fā)現(xiàn)AmRD22與GmRD22高度同源且定位于細(xì)胞壁，AmRD22的組成型表達(dá)降低了鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因株系的Na+含量，推測(cè)AmRD22可能以類似于GmRD22的機(jī)制發(fā)揮其耐鹽耐旱作用。植物細(xì)胞壁是由多種成分組成的復(fù)雜動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，AmRD22也可能以其他方式作用于細(xì)胞壁或質(zhì)外體而發(fā)揮其耐逆保護(hù)功能。要弄清其作用機(jī)理還需開展大量深入細(xì)致的工作。

ABA是重要的激素類信號(hào)分子，具有調(diào)控逆境脅迫響應(yīng)基因表達(dá)和抑制種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)等重要功能[28]。目前所知有許多RD22基因的表達(dá)受ABA調(diào)控，可能通過依賴于ABA的信號(hào)途徑發(fā)揮功能，其中AtRD22、Gm06.2/GmRD22和CaBDP1的研究較為清楚。AtRD22的啟動(dòng)子區(qū)含ABA應(yīng)答相關(guān)元件，其表達(dá)受失水、鹽脅迫和外源ABA誘導(dǎo)且需要ABA信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄激活因子AtMYC2/rd22BP1和AtMYB2的合成與介導(dǎo)[3,13-14]。Gm06.2/GmRD22和CaBDP1的表達(dá)也受外源ABA誘導(dǎo)，其中前者的啟動(dòng)子區(qū)含有ABA應(yīng)答元件ABRE，后者轉(zhuǎn)入擬南芥可增強(qiáng)種子萌發(fā)期對(duì)外源ABA的敏感性[6,12]。本研究發(fā)現(xiàn)AmRD22的表達(dá)受不同非生物脅迫和外源ABA誘導(dǎo)，將其在擬南芥中表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽性和耐旱性，同時(shí)降低了其在種子萌發(fā)早期對(duì)外源ABA的敏感性，推測(cè)該基因通過依賴于ABA的信號(hào)途徑發(fā)揮功能。