周 娜，鄭 陽(yáng)，陸景偉，胡 燕，陶偉林，雷開(kāi)榮，潘曉雪*

(1 重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜花卉研究所, 重慶 401329；2 重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所/逆境農(nóng)業(yè)研究重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 401329)

蘿卜(Raphanussativus. L)屬于十字花科蘿卜屬，是中國(guó)廣泛栽培的重要根菜類蔬菜[1]。蘿卜喜冷涼氣候，每年4～10月，大棚內(nèi)平均溫度在30 ℃以上，超過(guò)蘿卜的耐受程度，導(dǎo)致其生長(zhǎng)勢(shì)減弱，植株根莖增長(zhǎng)受到抑制，甚至死亡，嚴(yán)重影響了蘿卜的種植范圍和上市季節(jié)，制約了蘿卜的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)與均衡供應(yīng)[2]。因此，通過(guò)篩選耐熱性較強(qiáng)的蘿卜材料，育成優(yōu)質(zhì)耐熱蘿卜新品種是解決生產(chǎn)需求的重要途徑。

高溫不僅對(duì)植物造成明顯的外部損傷，還會(huì)影響植物體內(nèi)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、滲透調(diào)節(jié)機(jī)制、抗氧化系統(tǒng)以及光合作用等[3]。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中可通過(guò)被動(dòng)的改變來(lái)緩解高溫?zé)岷?，如積累大量的可溶性糖和脯氨酸來(lái)提高自身的滲透調(diào)節(jié)能力，從而保證植物體內(nèi)水分的充足，緩解因高溫而加劇的蒸騰作用；還可通過(guò)降低葉綠素總含量從而避免產(chǎn)生光氧化現(xiàn)象，保護(hù)光合系統(tǒng)免受損傷[4-5]。熱脅迫能引起活性氧(reactive oxygen species，ROS)類物質(zhì)H2O2的生成，激活熱激蛋白(heat shock proteins，HSP)的表達(dá)，而熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factors，HSF)能夠迅速與HSP啟動(dòng)子的熱激元件(heat shock element，HSE)結(jié)合，激活下游基因的表達(dá)，從而提高植物對(duì)高溫脅迫的耐受能力[6-7]。

11162-3-1T-1是從重慶地方品種‘中壩蘿卜’材料中優(yōu)選的單株，再連續(xù)自交分離選擇育成的優(yōu)良高代自交系，它具有苗期耐熱性較強(qiáng)、早熟、配組蘿卜品質(zhì)好且產(chǎn)量高等特點(diǎn)。Wr129A2A1是‘種都2號(hào)’雜交一代圓白蘿卜品種經(jīng)多代連續(xù)自交分離選擇育成的高代自交系，對(duì)熱敏感，但抗病性強(qiáng)。因此，本研究以耐熱性較強(qiáng)的11162-3-1T-1和對(duì)熱敏感的Wr129A2A1為材料，對(duì)比研究高溫脅迫對(duì)二者幼苗生長(zhǎng)、光合作用、細(xì)胞膜透性、滲透物質(zhì)含量和抗氧化活性的影響，以及熱激脅迫相關(guān)基因在葉片中的表達(dá)情況，為蘿卜耐熱材料創(chuàng)制及新品種選育提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為蘿卜耐高溫機(jī)理機(jī)制解析提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

田間自然高溫脅迫試驗(yàn)材料12份，苗期高溫脅迫試驗(yàn)材料為篩選出的熱敏感材料Wr129A2A1和耐熱性較強(qiáng)的材料11162-3-1T-1，其中‘熱白50天’由重慶科光種苗有限公司提供，‘糖晶’由重慶方正農(nóng)業(yè)有限公司提供，其余10份材料均由重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供(表2)

1.2 田間表型調(diào)查

2021年6月18日，12份蘿卜材料于國(guó)家蔬菜改良中心重慶分中心試驗(yàn)基地播種，1 m開(kāi)廂雙行種植，每份材料種植30株，行距0.50 m，株距 0.40 m，單株栽培，設(shè)3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。田間管理同常規(guī)大田栽培管理。于播種后1個(gè)月調(diào)查植株長(zhǎng)勢(shì)，60 d后，田間選取生長(zhǎng)一致的10個(gè)單株，測(cè)量每個(gè)單株的最大葉長(zhǎng)、最大葉寬、葉重、根長(zhǎng)、根粗和根重，同時(shí)調(diào)查每份材料的越夏死亡率和抗病性。

1.3 蘿卜苗期高溫脅迫處理

隨機(jī)選取Wr129A2A1和11162-3-1T-1健康飽滿且無(wú)病蟲(chóng)害的種子在55～58 ℃熱水中浸泡30 min，轉(zhuǎn)入鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中黑暗條件下發(fā)芽，溫度25～28 ℃，期間保持濾紙濕潤(rùn)。將發(fā)芽種子播于裝有育苗基質(zhì)的50孔穴盤中，置于26 ℃人工氣候箱內(nèi)生長(zhǎng)(Climacell 222，德國(guó)MMM)，光照強(qiáng)度12 000 Lx、光照12 h，空氣相對(duì)濕度60%～70%。待苗生長(zhǎng)至三葉一心時(shí)剔除弱苗，選取均勻一致的6株幼苗種植于營(yíng)養(yǎng)缽中。五葉一心時(shí)進(jìn)行高溫處理，處理?xiàng)l件為: 38 ℃熱激處理2 h后，26 ℃恢復(fù)生長(zhǎng)48 h, 然后40 ℃熱處理24 h，再置于26 ℃恢復(fù)生長(zhǎng)1周(先弱光下生長(zhǎng) 2 d，然后在正常光照條件下生長(zhǎng)5 d)，拍照記錄(高溫處理只取到24 h，高溫處理到48 h時(shí)蘿卜幼苗已經(jīng)死亡)。以上每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

將Wr129A2A1和11162-3-1T-1種子按上述方法培養(yǎng)，五葉一心時(shí)放入40 ℃人工氣候箱中進(jìn)行高溫處理，分別于處理0、6、24 h后將所測(cè)幼苗放入黑暗中適應(yīng) 30 min，然后剪下已充分展開(kāi)的功能葉用調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)IMAGING-PAM(德國(guó)WALZ)測(cè)定光合系統(tǒng)Ⅱ的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取10株。

1.5 苗期耐熱性相關(guān)生理生化指標(biāo)測(cè)定

將Wr129A2A1和11162-3-1T-1按上述方法培養(yǎng)至五葉一心時(shí)進(jìn)行40 ℃高溫處理，在處理 0、6、24 h后隨機(jī)選取5株幼苗的地上部分，保存于-80 ℃冰箱內(nèi)用于測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。采用丙酮乙醇混合液法測(cè)定葉綠素含量[8]，采用蒽酮法測(cè)定可溶性糖含量、茚三酮比色法測(cè)定游離脯氨酸(Pro)含量、硫代巴比妥酸(TBA)比色法測(cè)定丙二醛(MDA)含量、硫酸鈦光度法測(cè)定H2O2含量、氮藍(lán)四唑(NBT) 法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD) 活性、紫外吸收法測(cè)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性[9]，各指標(biāo)的測(cè)定均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.6 基因表達(dá)量檢測(cè)

利用Trizol試劑(Invitrogen)參照說(shuō)明書(shū)提取高溫脅迫各時(shí)間點(diǎn)(0、6、24 h)樣品RNA,并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒Reverse Transcription system(Promega 公司)進(jìn)行cDNA的第一鏈合成。

以 cDNA為模，RsActin為內(nèi)參[10]，采用定量試劑盒 SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa 公司)的操作步驟在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀(Applied Biosystems 7500，F(xiàn)oster City，USA)上檢測(cè)候選基因的表達(dá)量。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃、3 min；95 ℃、5 s，58 ℃、30 s，72 ℃、10s，40個(gè)循環(huán)；60 ℃收集熒光。每個(gè)實(shí)驗(yàn)3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，基因相對(duì)表達(dá)量采用ΔΔCT 法計(jì)算。所有基因特異引物(表 1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 用于實(shí)時(shí)定量PCR分析的引物信息Table 1 Gene specific primers used for quantitative RT-PCR analysis

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用 Excel和 OriginPro8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)期間田間氣溫動(dòng)態(tài)和材料耐熱性表現(xiàn)

大田監(jiān)控的氣溫?cái)?shù)據(jù)(圖 1)顯示，2021年的 7 月20日至 8 月6日,以及 8月16日至8月21日之間均出現(xiàn)了不同時(shí)長(zhǎng)和時(shí)段的田間自然高溫天氣條件(日均溫在 30 ℃以上，且最高溫在35 ℃以上持續(xù)13 d)，完全達(dá)到了蘿卜材料熱害鑒定條件。

田間觀測(cè)結(jié)果顯示，不同蘿卜材料在自然高溫條件下耐熱性表現(xiàn)出顯著差異(表2)。在12份供試蘿卜材料中，其中3份材料WC19-57，Wr129A2A1和‘糖晶’在越夏栽培期間全部死亡；‘熱白50天’、W20-15和W20-13前期植株長(zhǎng)勢(shì)和成熟期肉質(zhì)根商品率表現(xiàn)較耐熱，但抗性較差，越夏死株率超過(guò)20%；11162-3-1T-1和‘秋雪’在整個(gè)生長(zhǎng)期間，植株長(zhǎng)勢(shì)正常，葉色翠綠，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐熱性。因此，選取其中熱敏感的Wr129A2A1和耐熱性較強(qiáng)的11162-3-1T-1進(jìn)行后續(xù)苗期高溫脅迫試驗(yàn)研究。

表2 不同類型蘿卜材料田間自然高溫脅迫下性狀表現(xiàn)與耐熱性分析Table 2 Analysis on field traits and heat resistance of different radish varieties

2.2 苗期高溫對(duì)蘿卜幼苗生長(zhǎng)狀況的影響

在40 ℃高溫處理24 h并在室溫恢復(fù)生長(zhǎng)7 d后，Wr129A2A1和11162-3-1T-1苗期耐熱性強(qiáng)弱的表現(xiàn)差異顯著。其中，耐熱材料11162-3-1T-1在高溫條件下仍然保持綠色(圖2)，在室溫條件下恢復(fù)生長(zhǎng)1周后全部成活；熱敏感材料Wr129A2A1高溫處理24 h后， 幼苗脫水嚴(yán)重，植株萎蔫、干枯變黃、甚至整株枯死，室溫下無(wú)法恢復(fù)。

2.3 高溫脅迫對(duì)蘿卜幼苗葉片最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)值和葉綠素含量的影響

高溫處理后，雖然Wr129A2A1和11162-3-1T-1葉片的總?cè)~綠素含量和Fv/Fm值隨著脅迫時(shí)間的增加都呈下降趨勢(shì)，但是11162-3-1T-1葉片中Fv/Fm值和葉綠素含量都明顯高于同期的Wr129A2A1(圖 3)。其中，在高溫脅迫處理6 h后，Wr129A2A1和11162-3-1T-1葉片中Fv/Fm分別下降至0.261和0.547；脅迫24 h后，Wr129A2A1葉片的Fv/Fm幾乎為零，而 11162-3-1T-1仍為 0.457(圖3，A)，同時(shí)11162-3-1T-1葉片中總?cè)~綠素含量約是Wr129A2A1的2倍(圖3，B)。這些結(jié)果表明耐熱材料11162-3-1T-1在高溫脅迫下仍能維持較高的光合能力，表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐熱性。

2.4 高溫脅迫對(duì)蘿卜幼苗葉片可溶性糖和脯氨酸含量的影響

在高溫脅迫處理后，Wr129A2A1和11162-3-1T-1葉片中的可溶性糖和脯氨酸含量都呈上升趨勢(shì)(圖4)。其中，11162-3-1T-1葉片的可溶性糖含量在高溫脅迫處理6 h后約是Wr129A2A1的1.61倍，在脅迫24 h后約是Wr129A2A1的3.18倍，差異達(dá)到極顯著水平(圖4，A)；與適溫處理(0 h)相比，11162-3-1T-1和Wr129A2A1葉片中脯氨酸含量在高溫處理24 h后分別增加了46.91%和43.73%，但是兩個(gè)材料間的脯氨酸含量在高溫處理下始終未見(jiàn)明顯差異(圖4，B)。

2.5 高溫脅迫對(duì)蘿卜幼苗葉片MDA和H2O2含量的影響

高溫脅迫處理后，雖然Wr129A2A1和11162-3-1T-1葉片MDA和H2O2含量都呈上升趨勢(shì)，但是11162-3-1T-1增幅相對(duì)較小(圖5)。其中，高溫脅迫處理24 h后，Wr129A2A1葉片MDA含量是11162-3-1T-1的1.29倍，差異達(dá)到顯著水平(圖5，A)。11162-3-1T-1葉片H2O2含量在脅迫處理6 h后迅速增加，是Wr129A2A1的1.58倍，兩者無(wú)顯著差異；隨后，兩者葉片H2O2含量均繼續(xù)增加，Wr129A2A1的上升幅度更大，在脅迫處理24 h后是11162-3-1T-1的1.56倍，差異達(dá)到極顯著水平 (圖5，B)。

2.6 高溫脅迫對(duì)蘿卜葉片抗氧化酶SOD和APX活性的影響

在40 ℃ 高溫處理24 h后，11162-3-1T-1 葉片SOD活性迅速?gòu)?46.74 U/g上升至2 141.18 U/g，大幅度增加了13.59倍，是同期Wr129A2A1的2.51倍，差異達(dá)到顯著水平(圖6，A)。同時(shí)，Wr129A2A1葉片APX活性在高溫處理后未見(jiàn)明顯變化，而11162-3-1T-1葉片中的APX活性在高溫處理6 h后是同期Wr129A2A1的1.64倍，差異達(dá)到極顯著水平(圖6，B)。

2.7 高溫脅迫對(duì)蘿卜脅迫相關(guān)基因表達(dá)的影響

研究表明，HsfA2作為植物細(xì)胞熱激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵組分，它的表達(dá)水平與熱激脅迫誘導(dǎo)的AtHSP101、AtHsa32、sHSP-CI、APX2和SUS的表達(dá)水平密切相關(guān)[11]。為了確定蘿卜HsfA2基因在熱脅迫下的潛在作用，利用qRT-PCR技術(shù)分析了兩個(gè)不同耐熱性材料中RsHsfA2、RsHSP101、RsHsa32、RsHSP25.3、RsHSP18.2-CI、RsAPX2、RsSUS1和RsGolS1在高溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平(圖7)。其中，兩個(gè)材料的RsHsfA2、RsHsa32、RsHSP18.2-CI和RsGolS1基因在高溫脅迫下持續(xù)上調(diào)表達(dá)，與Wr129A2A1相比，11162-3-1T-1的RsHsfA2和RsGolS1在處理24 h后顯著上調(diào)，RsHSP101、RsAPX2、RsSUS1和RsHSP25.3在處理6 h后迅速上調(diào)達(dá)到最大值，表明高溫脅迫能夠誘導(dǎo)脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高11162-3-1T-1對(duì)高溫脅迫的耐受能力。

3 討 論

高溫不僅可造成作物損傷或死亡，還會(huì)引起一系列生理及代謝物的變化。光合作用是植物對(duì)溫度變化最為敏感的代謝反應(yīng)，植物在高溫脅迫下會(huì)減少葉綠素的合成以及葉綠體的形成[12]。研究表明，耐熱型水稻可以在高溫條件下通過(guò)維持較高的葉綠素含量從而提高對(duì)高溫的耐受能力[13]，過(guò)表達(dá)BrHSF16的轉(zhuǎn)基因擬南芥Fv/Fm顯著增加，并在高溫條件下表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)[14]。在本研究高溫脅迫條件下，耐熱蘿卜材料11162-3-1T-1的葉綠素含量和Fv/Fm明顯高于熱敏感材料Wr129A2A1，表明11162-3-1T-1可通過(guò)維持較高的葉綠素含量和Fv/Fm來(lái)調(diào)節(jié)光合作用，以此緩解高溫帶來(lái)的傷害。

同時(shí)，在高溫脅迫下，獼猴桃、蝴蝶蘭、生菜、棉花和擬南芥葉片可通過(guò)積累可溶性糖和脯氨酸來(lái)提高對(duì)高溫脅迫的耐受能力[12]。在高溫處理24 h后，本研究中耐熱材料11162-3-1T-1葉片中可溶性糖含量是熱敏感Wr129A2A1的3.18倍；雖然11162-3-1T-1葉片中脯氨酸含量隨著高溫處理時(shí)間的增加而增加，但與Wr129A2A1相比未見(jiàn)明顯差異，表明11162-3-1T-1在高溫脅迫下可通過(guò)提高可溶性糖含量來(lái)增強(qiáng)自身滲透調(diào)節(jié)能力。

另外，活性氧(ROS)水平、MDA含量、抗氧化酶活性以及抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄水平常被用作細(xì)胞膜和細(xì)胞膜氧化損傷的判別指標(biāo)，從而反映植物對(duì)高溫脅迫的耐受能力[15]。例如，高溫脅迫下耐熱水稻品種NERICA-L-44和Nagina 22通過(guò)增加抗氧化酶活性，減少ROS和MDA含量來(lái)提高耐熱脅迫能力[13,16]；高溫脅迫不但可以提高小麥、高羊茅和番茄SOD、APX、CAT、POX和GR活性[17]，還可以通過(guò)在擬南芥和水稻胞質(zhì)中大量表達(dá)抗壞血酸過(guò)氧化物酶基因APX2[18-19]，從而增強(qiáng)植物對(duì)H2O2等活性氧的清除能力。與熱敏感材料Wr129A2A1相比，本研究中高溫脅迫下耐熱性蘿卜材料11162-3-1T-1葉片的 MDA和H2O2含量下降，SOD和APX活性以及RsAPX2基因的表達(dá)量增加，表明高溫脅迫產(chǎn)生的H2O2在SOD和APX協(xié)調(diào)作用下維持在較低水平, 從而減少細(xì)胞膜的損傷, 提高了11162-3-1T-1對(duì)高溫脅迫的耐受能力。

此外，HSF作為熱脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要組成部分, 能夠誘導(dǎo)多種熱脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，在植物應(yīng)對(duì)高溫脅迫、生長(zhǎng)和發(fā)育方面發(fā)揮重要作用[20]。例如，擬南芥AtHsfA2 缺失突變體對(duì)高溫、強(qiáng)光、缺氧和氧化脅迫敏感，而過(guò)表達(dá)AtHsfA2能提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)高溫、高鹽、氧化以及滲透脅迫的耐受能力[11,21]。AtHsfA2還可通過(guò)調(diào)控HSP、APX2、SUS以及GolS1等基因的表達(dá)來(lái)提高植物的耐熱性[11,22-23]。與Wr129A2A1相比，耐熱材料11162-3-1T-1脅迫相關(guān)基因在高溫處理過(guò)程中發(fā)生顯著變化，RsHSP101、RsHSP25.3、RsAPX2和RsSUS1基因在高溫處理6 h后顯著上調(diào)，RsHsfA2和RsGolS1在整個(gè)處理期間上調(diào)表達(dá)，表明高溫誘導(dǎo)多種熱脅迫響應(yīng)基因通過(guò)不同的表達(dá)模式來(lái)提高11162-3-1T-1對(duì)高溫脅迫的耐受能力。

綜上所述，耐熱蘿卜材料11162-3-1T-1可通過(guò)調(diào)控光合作用、提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、增加抗氧化酶活性以及激活熱激脅迫相關(guān)基因表達(dá)，從而增強(qiáng)幼苗對(duì)高溫脅迫的耐受能力。