張雙龍 閆一飛 李庚鵬 張國偉

(廈門醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院胃腸外科，福建省廈門市 361000)

結(jié)直腸癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤，常發(fā)生在直腸和乙狀結(jié)腸交界處，具有發(fā)病特征不明顯、易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移、患者預(yù)后差及死亡率高等特點(diǎn)[1-2]。目前結(jié)直腸癌的治療方法主要有手術(shù)、化療、放療等，隨著腫瘤治療技術(shù)的發(fā)展，結(jié)直腸癌的致死率降低至35%左右，但是仍然有近50%的患者死于腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3-5]。因此，探討結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，尋找結(jié)直腸癌治療的新靶點(diǎn)至關(guān)重要。

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一類長度大于200nt的非編碼RNA，種類眾多，調(diào)控機(jī)制復(fù)雜[6]。越來越多的lncRNA被報(bào)告可調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，其中l(wèi)ncRNA α/β水解酶域11反義RNA1(alpha/beta hydrolase domain-containing protein 11 antisense RNA 1,ABHD11-AS1)已經(jīng)被證實(shí)可調(diào)控多種腫瘤的生長或轉(zhuǎn)移，包括非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌、卵巢癌、胰腺癌等腫瘤[7-8]。已有研究表明，ABHD11-AS1可調(diào)控miR-133a/SOX4軸來影響結(jié)直腸癌的發(fā)展[9]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-133a可靶向調(diào)控真核起始因子4A1(eukaryotic initiation factor 4A1,EIF4A1)從而影響結(jié)直腸癌的發(fā)展[10]。目前關(guān)于ABHD11-AS1能否通過調(diào)控miR-133a/EIF4A1軸來影響結(jié)直腸癌的生長和轉(zhuǎn)移的研究較少。因此，本研究探討ABHD11-AS1對結(jié)直腸癌細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移的影響，以及其是否通過調(diào)控miR-133a/EIF4A1軸發(fā)揮作用，旨在為結(jié)直腸癌的靶向診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 人結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29、SW480、DLD-1、HCT116、LOVO、SW620，以及正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC、人胚腎細(xì)胞293T均購自中科院上海細(xì)胞庫。PrimeScriptTM試劑盒購自Takara公司(批號：2690A)，PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix試劑盒、Lipofectamine 2000試劑盒、TRIzol試劑盒均購自美國Invitrogen公司(批號：C11730017、11668019、10296010)，EvaGreen miRNA qPCR Master Mix試劑盒購自Abcam公司(批號：B11050)，Effectene Transfection Reagent試劑盒購自QIAGEN公司(批號：301425)，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自漢恒生物技術(shù)有限公司(批號：hsa-cand-142)，EIF4A1抗體、山羊抗兔二抗、內(nèi)參GAPDH抗體均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司(批號：PR30012、PR30036、6004-l-Ig)，孔徑8 μm的Transwell小室購自康寧生命科學(xué)有限公司(批號：3422)，CCK-8試劑盒、RIPA蛋白裂解液和ECL發(fā)光液購自沈陽萬類生物技術(shù)有限公司(批號：WLA074、WLA016、WLA003)。lncRNA ABHD11-AS1 siRNA、EIF4A1 siRNA、Negative Control、miR-133a inhibitor、miR-133a mimic、miR-NC由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取出經(jīng)液氮保存的結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29、SW480、DLD-1、HCT116、LOVO、SW620，以及正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC、人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞，迅速解凍后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔天更換細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞生長至匯合率達(dá)80%～90%時進(jìn)行傳代。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將HT-29細(xì)胞分為NC組(轉(zhuǎn)染Negative Control)、siABHD11-AS1組(轉(zhuǎn)染lncRNA ABHD11-AS1 siRNA)、miR-133a inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor)、siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組(轉(zhuǎn)染lncRNA ABHD11-AS1 siRNA 24 h后，再轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor)和siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor+siEIF4a1組(轉(zhuǎn)染lncRNA ABHD11-AS1 siRNA 24 h后再轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor 24 h后，再轉(zhuǎn)染EIF4A1 siRNA)，使用Lipofectamine 2000試劑盒轉(zhuǎn)染lncRNA ABHD11-AS1 siRNA、EIF4A1 siRNA、Negative Control，使用Effectene Transfection Reagent試劑盒轉(zhuǎn)染miR-133a inhibitor，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Negative Control序列為(正向)5′-CAGAACGGGUCUAUACUUG-3′、(反向)5′-CAAGGUACCUACGGCAGU-3′；lncRNA ABHD11-AS1 siRNA序列為(正向)5′-CGUAAGCGUUCAUUAAGGC-3′、(反向)5′-CAAGGUGCGAUCUUAAUGC-3′；EIF4a1 siRNA序列為5′-CUGGCCGUGUGUUUGAUAU-3′；miR-133a inhibitor序列為5′-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3′。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 分別將HT-29、SW480、DLD-1、HCT116、LOVO、SW620、FHC細(xì)胞，以及NC組和siABHD11-AS1組HT-29細(xì)胞接種至6孔板中，設(shè)置5個復(fù)孔，其中將轉(zhuǎn)染24 h后的HT-29細(xì)胞培養(yǎng)至匯合率達(dá)80%～90%。按照TRIzol 試劑說明書的步驟提取細(xì)胞的總RNA，使用核酸定量儀(Thermo Scientific公司，型號：NanoDrop One)檢測總RNA含量。參照PrimeScriptTM試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，全程冰浴操作，設(shè)置反應(yīng)條件為 37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s，4 ℃保存反應(yīng)產(chǎn)物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。lncRNA的實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作參照PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix試劑盒說明書，以GAPDH作為內(nèi)參，反應(yīng)體系為包括PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 10 μL、上游和下游各1 μL、DNA模板1 μL、滅菌水7 μL。反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min； 95 ℃ 2 min、95 ℃ 15 s，40個循環(huán)；55 ℃ 15 s；72 ℃ 1 min。miR-133a的實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作參照EvaGreen miRNA qPCR Master Mix試劑盒說明書，以U6作為內(nèi)參，反應(yīng)體系為EvaGreen miRNA Master Mix 10 μL、上游和下游引物各0.6 μL、DNA模板0.5 μL、滅菌水8.3 μL。反應(yīng)條件為：96 ℃ 6 min； 94 ℃ 15 s、65 ℃ 45 s，60個循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，引物序列如表1。

表1 ABHD11-AS1、GAPDH、miR-133a、U6的引物序列

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 根據(jù)miRcode數(shù)據(jù)庫(http://www.mircode.org/)并參考相關(guān)文獻(xiàn)[9]，預(yù)測ABHD11-AS1與miR-133a的結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)野生型和突變型的ABHD11-AS1的3′非翻譯區(qū)-熒光素酶基因表達(dá)質(zhì)粒(即WT-ABHD11-AS1和MUT-ABHD11-AS1)，使用Lipofectamine 2000試劑盒將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，使用Effectene Transfection Reagent試劑盒分別將miR-133a mimic、miR-NC轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

根據(jù)TargetScan數(shù)據(jù)庫(https://www.targetscan.org/vert_80/)和參考相關(guān)文獻(xiàn)[10]，預(yù)測miR-133a和EIF4A1的結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)野生型和突變型的EIF4A1的3′非翻譯區(qū)-熒光素酶基因表達(dá)質(zhì)粒(即WT-EIF4A1和MUT-EIF4A1)，使用Lipofectamine 2000試劑盒將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，使用Effectene Transfection Reagent試劑盒分別將miR-133a mimic、miR-NC轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染24 h后的NC組、siABHD11-AS1組、miR-133a inhibitor組、siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組HT-29細(xì)胞，加入200 μL RIPA蛋白裂解液，4 ℃條件下裂解30 min，然后在4 ℃下12 000 r/min離心10 min，收集上清為總蛋白，使用二喹啉甲酸蛋白定量法測定總蛋白濃度。取10 μg蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE，蛋白分離后轉(zhuǎn)膜，使用PVDF膜封閉2 h后，然后與EIF4A1一抗(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶5 000)4 ℃孵育過夜，使用TBST洗膜后加入二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1.5 h，使用TBST清洗PVDF膜后，使用ECL試劑盒配置發(fā)光液，并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應(yīng)30 s，曝光并拍照，以GAPDH為內(nèi)參，用ImageJ軟件對條帶灰度值進(jìn)行半定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 使用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力。取轉(zhuǎn)染24 h后的NC組、siABHD11-AS1組、siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組、siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor+siEIF4A1組TH-29細(xì)胞，使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至5×104個/mL，將HT-29細(xì)胞接種至96孔板，100 μL/孔，每組3個復(fù)孔，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，設(shè)置0 h、24 h、48 h、72 h時間點(diǎn)對應(yīng)的96孔板，在各時間點(diǎn)取出對應(yīng)的96孔板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司，型號：SpectraMax M5)檢測各孔450 nm處的吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 使用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋NC組、siABHD11-AS1組、siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組、siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor+siEIF4A1組的HT-29細(xì)胞至1×105個/mL，取100 μL細(xì)胞懸液接種于Transwel小室中用于檢測細(xì)胞遷移，接種于鋪含有50 μL Matrigel的Transwell小室中用于檢測細(xì)胞侵襲，每孔1×104個細(xì)胞，每孔再加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基，每組3個復(fù)孔，將小室放置于24孔板中，24孔板每孔加入600 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，并將上述24孔板轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，小室底部用PBS清洗后用無水乙醇固定30 min，然后將小室倒扣，于底部滴加結(jié)晶紫染色10 min，清洗后晾干，于顯微鏡下觀察拍照并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞與人結(jié)直腸癌細(xì)胞中ABHD11-AS1表達(dá)量的比較 與正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC相比，人結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29、SW480、DLD-1、HCT116、LOVO、SW620的ABHD11-AS1表達(dá)量均升高，且HT-29細(xì)胞的ABHD11-AS1表達(dá)量最高(均P<0.05)，因此取HT-29細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。siABHD11-AS1組HT-29細(xì)胞的ABHD11-AS1表達(dá)量低于NC組(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染siABHD11-AS1可抑制TH-29細(xì)胞中ABHD11-AS1的表達(dá)，可進(jìn)行后續(xù)研究。見表1、表2。

表1 正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞與人結(jié)直腸癌細(xì)胞中ABHD11-AS1 mRNA相對表達(dá)量的比較(x±s)

表2 NC組和siABHD11-AS1組HT29細(xì)胞中ABHD11-AS1相對表達(dá)量的比較(x±s)

2.2 ABHD11-AS1與miR-133a的靶向關(guān)系 ABHD11-AS1與miR-133a的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)果如圖1所示。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染MUT-ABHD11-AS1+miR-NC的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染MUT-ABHD11-AS1+miR-133a mimic的細(xì)胞的相對熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而轉(zhuǎn)染W(wǎng)T- ABHD11-AS1+miR-133a mimic的細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度低于轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-ABHD11-AS1+miR-NC的細(xì)胞(P<0.05)，表明ABHD11-AS1可與miR-133a結(jié)合，見表3。siABHD11-AS1組HT-29細(xì)胞中miR-133a表達(dá)量高于NC組(P<0.05)，見表4。

圖1 ABHD11-AS1和miR-133a的結(jié)合位點(diǎn)

表3 ABHD11-AS1與miR-133a靶向關(guān)系的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果(x±s)

表4 NC組和siABHD11-AS1組HT29細(xì)胞miR-133a相對表達(dá)量的比較(x±s)

2.3 EIF4A1與miR-133a的靶向關(guān)系 miR-133a和EIF4A1的結(jié)合位點(diǎn)如圖2所示。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染MUT- EIF4A1+miR-NC的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染MUT- EIF4A1+miR-133a mimic的細(xì)胞的相對熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但轉(zhuǎn)染W(wǎng)T- EIF4A1+miR-133a mimic的細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度低于轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-EIF4A1+miR-NC的細(xì)胞(P<0.05)，說明EIF4A1為miR-133a的靶基因，見表5。

圖2 miR-133a和EIF4A1的結(jié)合位點(diǎn)

表5 EIF4A1與miR-133a靶向關(guān)系的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果(x±s)

2.4 各組HT-29細(xì)胞EIF4A1蛋白表達(dá)量的比較 Western blot檢測結(jié)果顯示，miR-133a inhibitor組HT-29細(xì)胞EIF4A1蛋白表達(dá)量高于NC組(P<0.05)。siABHD11-AS1組HT-29細(xì)胞EIF4A1蛋白表達(dá)量低于NC組，而siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組HT-29細(xì)胞的EIF4A1蛋白表達(dá)量高于siABHD11-AS1組(均P<0.05)。見圖3、表6、表7。

圖3 各組HT-29細(xì)胞EIF4A1蛋白的表達(dá)情況

表6 NC組和miR-133a inhibitor組HT-29細(xì)胞中EIF4A1蛋白相對表達(dá)量的比較(x±s)

表7 NC組、siABHD11-AS1組和siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組HT-29細(xì)胞EIF4A1蛋白相對表達(dá)量的比較(x±s)

2.5 各組HT-29細(xì)胞增殖能力的比較 CCK-8檢測結(jié)果顯示，干預(yù)24 h、48 h、72 h后，siABHD11-AS1組HT-29細(xì)胞吸光度值低于NC組，siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組HT-29細(xì)胞吸光度值均高于siABHD11-AS1組，而siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor+siEIF4A1組HT-29細(xì)胞吸光度值均低于siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組(均P<0.05)。見表8。

表8 各組HT29細(xì)胞吸光度值的比較(x±s)

2.6 各組HT-29細(xì)胞遷移和侵襲能力的比較 相較于NC組，siABHD11-AS1組HT-29細(xì)胞的遷移數(shù)和侵襲數(shù)均減少，siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組HT-29細(xì)胞的遷移數(shù)和侵襲數(shù)均多于siABHD11-AS1組，而siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor+siEIF4A1組HT-29細(xì)胞的遷移數(shù)和侵襲數(shù)均少于siABHD11-AS1+miR-133a inhibitor組(均P<0.05)。見圖4、表9。

圖4 各組HT29細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)的比較(×20)

表9 各組HT29細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)的比較(x±s)

3 討 論

目前，結(jié)直腸癌主要的治療方法有手術(shù)治療、化療和放療。雖然近幾年來結(jié)直腸癌患者的預(yù)后不斷得到改善，治療后患者的生存率可提高至60%左右，但是由于結(jié)直腸癌的早期病理特征不明顯，患者在確診時即已處于中晚期，錯過了手術(shù)治療的最佳時期；同時，約20%的患者在確診時即出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移，無法進(jìn)行手術(shù)治療；此外，手術(shù)治療后患者5年內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)率高達(dá)30%，化療和放療雖然可用于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的患者，但是耐藥等問題嚴(yán)重影響治療效果[11-12]。因此，深入研究結(jié)直腸癌生長和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)更多可用于結(jié)直腸癌診斷和治療的生物標(biāo)志物，對于改善結(jié)直腸癌患者的預(yù)后具有重要意義。

隨著基因芯片和基因測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、耐藥、免疫逃逸等病理進(jìn)程的生物學(xué)功能。其中，lncRNA是一類長度大于200nt的非編碼RNA，并且lncRNA能夠參與調(diào)控機(jī)體的多種生物學(xué)功能，但調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，其主要是作為支架或向?qū)д{(diào)控蛋白與基因之間相互作用，通過“海綿”的方式與miRNA相結(jié)合，作為增強(qiáng)子調(diào)控其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄等。已有研究報(bào)告，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，lncRNA可調(diào)控多種腫瘤的增殖、侵襲、遷移等[13-14]。在結(jié)直腸癌中，lncRNA TINCR可通過調(diào)控miR-107/CD36信號軸而影響結(jié)直腸癌的增殖和凋亡[15-16]，lncRNA cCSC1可通過調(diào)控miR-124-3p/CD44軸而促進(jìn)結(jié)腸癌的增殖[17]。因此，lncRNA有望成為結(jié)直腸癌的新型診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。lncRNA ABHD11-AS1已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。例如，ABHD11-AS1通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)以促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖與遷移[18]；ABHD11-AS1可作為早期診斷胰腺癌的指標(biāo)[19]；ABHD11-AS1通過調(diào)控miR-1301-3p/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3軸和磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路，從而促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌的進(jìn)展[20]；ABHD11-AS1通過調(diào)控miR-199a-5p/溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族1成員5軸而影響甲狀腺乳頭狀癌的進(jìn)程[21]。但是，有關(guān)ABHD11-AS1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，以及其對結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的影響的研究較少，因此，本研究探究ABHD11-AS1對結(jié)直腸癌生長和轉(zhuǎn)移的影響及可能調(diào)控機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，ABHD11-AS1高表達(dá)于結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT-29、SW480、DLD-1、HCT116、LOVO、SW620(均P<0.05)，這提示ABHD11-AS1可能對結(jié)直腸癌的發(fā)生具有調(diào)控作用。此外，通過轉(zhuǎn)染siRNA抑制HT-29細(xì)胞中ABHD11-AS1的表達(dá)后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均下降(均P<0.05)，說明ABHD11-AS1具有調(diào)控腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的功能。lncRNA的主要調(diào)控機(jī)制為，與miRNA相結(jié)合后作為增強(qiáng)子調(diào)控其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。本研究通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了ABHD11-AS1可與miR-133a結(jié)合。Wang等[22]的研究表明，miR-133a的表達(dá)抑制與結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)；Dong等[23]亦發(fā)現(xiàn)miR-133a可作為結(jié)直腸癌的抑制因子。本研究中，siABHD11-AS1組HT-29細(xì)胞中miR-133a表達(dá)高于NC組(P<0.05)，即抑制ABHD11-AS1的表達(dá)可上調(diào)HT-29細(xì)胞中miR-133a的表達(dá)。因此，我們推測ABHD11-AS1或可通過抑制miR-133a的表達(dá)來促進(jìn)結(jié)直腸癌的病理進(jìn)程。在本研究中，我們通過轉(zhuǎn)染siRNA抑制HT-29細(xì)胞中ABHD11-AS1的表達(dá)后再抑制miR-133a的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HT-29細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng)，這進(jìn)一步表明ABHD11-AS1可通過調(diào)控miR-133a的表達(dá)而影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

miRNA是一類長度為19～24 nt的非編碼單鏈RNA，其通過堿基互補(bǔ)配對的方式與靶基因的3′-非翻譯區(qū)部分或完全互補(bǔ)，剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯，從而起到在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達(dá)的作用[24]。本研究通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測了miR-133a和EIF4A1的結(jié)合位點(diǎn)，然后通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了EIF4A1為miR-133a的靶基因。EIF4A1亦與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)，例如EIF4A1的表達(dá)與乳腺癌中的惡性程度和不良預(yù)后呈正相關(guān)[25]。本研究結(jié)果顯示，抑制miR-133a后HT-29細(xì)胞中的EIF4A1蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；抑制ABHD11-AS1表達(dá)后HT-29細(xì)胞中的EIF4A1蛋白表達(dá)下調(diào)，但先抑制ABHD11-AS1表達(dá)再抑制miR-133a的表達(dá)，HT-29細(xì)胞中的EIF4A1表達(dá)反而上調(diào)(P<0.05)。這表明ABHD11-AS1可調(diào)控miR-133a/EIF4A1信號軸，進(jìn)而調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述，ABHD11-AS1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，并且抑制ABHD11-AS1后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著下降， 其可能通過調(diào)控miR-133a/EIF4A1信號軸發(fā)揮作用。但是ABHD11-AS1在結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中的表達(dá)，以及ABHD11-AS1是否可作為結(jié)直腸癌診斷和治療的新靶點(diǎn)，還需要進(jìn)一步探究。

(致謝：感謝廈門醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部李良華老師在實(shí)驗(yàn)上給予的幫助)