陳代武，彭若君，李核

(1.邵陽學(xué)院 國(guó)際學(xué)院，湖南 邵陽，422000；2.華南師范大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，廣東 廣州，510006)

刀豆球蛋白 A(ConA)是一種植物血凝素，具有很強(qiáng)的促有絲分裂和促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用，它還可以選擇性地激活抑制性 T(TS)細(xì)胞[1]，在細(xì)菌和病毒感染和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[2-3]。目前檢測(cè)ConA的方法主要有熒光法[4]、表面等離子體共振[5]、電化學(xué)生物傳感器[6]等。然而，這些方法存在靈敏度低、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)[6]。因此，建立靈敏度高、選擇性好的ConA檢測(cè)方法在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域是十分必要的，而溴氧化鉍(BiOBr)和硫化銀(Ag2S)復(fù)合材料制成的光電化學(xué)傳感器具有靈敏度高和選擇性好等特點(diǎn)，本研究將此光電化學(xué)傳感器用于檢測(cè)人體血清中ConA具有重要意義，同時(shí)也為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域檢測(cè)人體血清中其他高分子提供科學(xué)方法和參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和試劑

PH計(jì)(PHSJ-3F，上海科學(xué)儀器有限公司)，超聲波清洗機(jī)(AS3120b，天津奧特賽恩斯儀器有限公司)，干燥箱(DGG-9053A，上海森信實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司)，迷你渦旋混合器(生工生物科技(上海)有限公司)、Autolab電化學(xué)工作站(PGSTAT302N，瑞士萬通中國(guó)有限公司)和 SEM(蔡司 Ultra55，卡爾蔡司光學(xué)(中國(guó))有限公司)。氯金酸、磷酸二氫鈉、鹽酸、三(羥甲基)氨基甲烷、硫化鈉、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、硝酸鉍、硝酸銀和巰基丙酸(MPA)購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司，所有試劑均為分析純。

1.2 ITO-PET預(yù)處理

將柔性氧化銦錫/聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(ITO-PET)片材(210 mm×290 mm)切成25 mm×10 mm的薄片，用帶圓孔(直徑0.5 cm)的絕緣透明膠密封ITO-PET切片，再分別用酒精和去離子水清洗，保存用作基地電極。

1.3 BiOBr的合成

在文獻(xiàn)[7]的基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)修改合成。稱取0.952 6 g Bi(NO)3·H2O放入100 mL燒杯中，加 35 mL 乙二醇溶解。將 1.450 8 g CTAB 添加到燒杯中，攪拌溶解并轉(zhuǎn)移到反應(yīng)器中，將反應(yīng)器置于真空烘箱中。烘箱溫度從室溫升至400 ℃并保持4 h，然后冷卻至室溫，得到灰白色BiOBr。取適量BiOBr，用少量去離子水溶解于25 mL燒杯中，然后取一定量溶液至2 mL容量瓶中，得到一定濃度的BiOBr溶液(4、6、8、10和12 mg·mL-1)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 Ag2S/BiOBr/ITO-PET電極的制備

按文獻(xiàn)[8]進(jìn)行改進(jìn)制備電極。將 20 μL BiOBr(8 mg·mL-1)水性懸浮液滴在干凈的 ITO-PET 電極切片的圓形區(qū)域上并自然干燥。然后，在BiOBr/ITO-PET電極中加入20 μL 0.1 mol·L-1巰基丙酸溶液，用紅外光照射10 min，得到3-MPA修飾的BiOBr/ITO-PET電極。在 3-MPA 修飾的BiOBr/ITO-PET 電極上加入 20 μL 0.08 mol·L-1AgNO3溶液，置于黑暗環(huán)境中 30 min。最后，在電極中加入 20 μL 0.1 mol·L-1Na2S 溶液，在黑暗環(huán)境中放置 30 min，得到 Ag2S/BiOBr/ITO-PET 電極。

1.5 金納米膠體的制備

通過氯金酸的檸檬酸鈉還原制備金納米膠體[9]。將1 mL 1%氯金酸溶液加入100 mL容量瓶中，用去離子水稀釋至100 mL，得到0.01%氯金酸溶液；然后，取0.5 g檸檬酸鈉溶解并用去離子水稀釋至50 mL，得到10 mg·mL-1檸檬酸鈉溶液。將配制好的0.01%氯金酸100 mL轉(zhuǎn)移到200 mL圓底燒瓶中，加熱煮沸15 min，然后，快速加入配制好的10 mg·mL-1檸檬酸鈉，繼續(xù)加熱煮沸10 min，停止加熱，自然冷卻至室溫，得到金納米膠體。

1.6 光電化學(xué)傳感器的構(gòu)建

通過在 Ag2S/BiOBr/PET-ITO 電極中加入10 μL金膠體溶液制備工作電極，使用前保存于4 ℃冰箱。光電化學(xué)系統(tǒng)由Ag/AgCl 電極作為參比電極，鉑電極作為對(duì)電極，Ag2S/BiOBr/PET-ITO 電極為工作電極。

2 結(jié)果與討論

2.1 光電傳感器構(gòu)建原理

光電化學(xué)傳感器的構(gòu)建過程見圖1。在該系統(tǒng)中，BiOBr作為光電敏感材料吸收光并將其轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。金膠體主要用作信號(hào)放大器和電子導(dǎo)體。Ag2S 納米粒子與BiOBr結(jié)合形成納米復(fù)合層，進(jìn)一步增強(qiáng)了光吸收和光電轉(zhuǎn)換效率[8]。納米復(fù)合層還提供了與蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的平臺(tái)。Ag2S/BiOBr復(fù)合材料在可見光照射下產(chǎn)生的光電子將傳輸?shù)?ITO-PET 電極以產(chǎn)生光電流。然而，當(dāng)目標(biāo)ConA在電極上孵育時(shí)，它會(huì)抑制電子傳輸，導(dǎo)致信號(hào)降低。因而可以根據(jù)電流的變化來進(jìn)行ConA定量檢測(cè)。

圖1 光電傳感器構(gòu)建示意圖

2.2 電極材料的 SEM 表征

圖2為BiOBr和Ag2S/BiOBr掃描電子顯微鏡(SEM)圖，圖 2(a)表明，BiOBr具有層狀微球形態(tài)，層狀微球由許多納米片和納米顆粒組成[10]，為 Ag2S 的原位生長(zhǎng)提供了大的表面積。圖2(b)表明，Ag2S 納米粒子在 MPA 修飾的BiOBr的分級(jí)表面上原位生長(zhǎng)。所有結(jié)果證明Ag2S/BiOBr復(fù)合材料層已成功制備。

(a)BiOBr;(b)Ag2S/BiOBr

2.3 電極的電化學(xué)表征

通過光電流響應(yīng)和電化學(xué)阻抗譜的方法表征電極的修飾過程，見圖3。圖3(a)顯示了不同修飾電極的光電流-時(shí)間(I-t)曲線。由圖3(a)可知，曲線a為裸ITO-PET電極的光電流響應(yīng)，曲線b為BiOBr修飾后的光電流信號(hào)。這些結(jié)果表明，BiOBr可以提高光電轉(zhuǎn)換效率。當(dāng)在上述電極上修飾Ag2S 時(shí)，光電流進(jìn)一步增強(qiáng)(圖3(a)中的曲線 c)。這是由于Ag2S是一種窄帶半導(dǎo)體材料，在光照下具有良好的光捕獲和光電轉(zhuǎn)換能力。然而，在上述電極上連續(xù)修飾金膠體(曲線d)和ConA(曲線e)后，光電流逐漸減小，可能的原因是半導(dǎo)體納米粒子和金納米粒子之間存在共振能量轉(zhuǎn)移[11]，ConA阻礙了電極和溶液之間的電子轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致光生空穴更傾向于與光生電子復(fù)合，因此觀察到光電流信號(hào)下降。層狀改性ITO-PET電極在含0.1 mol·L-1[Fe(CN)6]3-0.1 mol·L-1KCl的溶液中進(jìn)行電化學(xué)阻抗譜(EIS),見圖3(b)。EIS結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了I-t曲線的可靠性，見圖3(a)。EIS圖由兩部分組成：一是與高頻區(qū)電荷轉(zhuǎn)移過程對(duì)應(yīng)的半圓形部分；另一個(gè)是對(duì)應(yīng)于低頻區(qū)擴(kuò)散過程的線性部分。電荷轉(zhuǎn)移電阻(Rct)值隨著在 ITO-PET 電極上改性的不同材料而變化。從圖3(b)可以看出，ITO-PET 的Rct值在這些修飾電極中最低(曲線 b、c、d、e)。Rct值隨著BiOBr、Ag2S、Au膠體修飾和ConA鍵合的ITO-PET的變化而變化。這表明修飾電極制備成功。

(a)光電流響應(yīng)；(b)交流阻抗圖

2.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為了獲得優(yōu)異的光電化學(xué)傳感器性能，提高它的靈敏度和選擇性，詳細(xì)探究了BiOBr濃度、激發(fā)波長(zhǎng)、偏壓和溶液pH等實(shí)驗(yàn)條件對(duì)傳感器性能的影響。

2.4.1 BiOBr濃度的影響

為了考察BiOBr濃度對(duì)光電流的影響，不同濃度BiOBr溶液(4、6、8、10和12 mg·mL-1)被修飾在電極上研究光電流的變化，結(jié)果見圖4(a)。結(jié)果表明，當(dāng)BiOBr溶液濃度為8 mg·mL-1時(shí)，光電流最大。如果濃度過高，修飾層的厚度會(huì)進(jìn)一步增加。這將不利于光電子傳輸，從而導(dǎo)致光電流降低[7]。如果濃度太低，由于電極上修飾的BiOBr量太少，無法獲得最大光電流。因此，選擇8 mg·mL-1的 20 μL BiOBr溶液進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.4.2 激發(fā)波長(zhǎng)和偏壓

圖4(b)顯示了365、375、395、420、450、475、490、520 和590 nm的激發(fā)波長(zhǎng)分別對(duì)光電流的影響。結(jié)果表明，在475 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下獲得了最大光電流，這意味著能量與Ag2S/BiOBr復(fù)合材料的能量更匹配，而且無光照時(shí)，所有電極的光電流信號(hào)幾乎與基地電極的光電流一致。因此，選擇 475 nm 作為激發(fā)波長(zhǎng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。還研究了偏位以獲得出色的光電流信號(hào)，結(jié)果見圖4(c)。當(dāng)偏壓施加到0時(shí)，在這些試驗(yàn)偏壓中獲得了最強(qiáng)的光電流信號(hào)。所以，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用0作為偏壓。

(a)BiOBr的濃度;(b)激發(fā)波長(zhǎng);(c)偏壓;(d)緩沖溶液pH

2.4.3 緩沖液pH的優(yōu)化

為了研究pH對(duì)所得光電化學(xué)傳感器和ConA穩(wěn)定性的影響，使用不同pH(pH=7.0、7.5、8.0、8.5和9.0)的Tris-HCl緩沖溶液進(jìn)行測(cè)試。如圖4(d)所示，當(dāng)Tris-HCl緩沖溶液的pH值為8.5時(shí)，該傳感器的光電流響應(yīng)達(dá)到最大值。在隨后的實(shí)驗(yàn)中使用pH值為8.5的Tris-HCl溶液作為緩沖液。

2.5 ConA檢測(cè)的光電化學(xué)性能

不同濃度的ConA由所提出的PEC傳感器在最佳實(shí)驗(yàn)條件下確定。如圖5(a)所示，隨著ConA濃度的增加，光電流逐漸減小。此外，光電流是ConA在0.001 ng·mL-1～100 ng·mL-1范圍內(nèi)濃度的對(duì)數(shù)，呈線性關(guān)系，線性方程為：I=-0.162 2 lgCConA+ 0.912 81，相關(guān)系數(shù)的平方根為 0.993 0。其中，I是光電流(μA)；CConA是ConA的濃度(ng·mL-1)。檢測(cè)限為0.35 pg·mL-1(S/N=3)。

(a)光電流隨ConA濃度的變化；(b)選擇性

研究了PEC傳感器檢測(cè)ConA的選擇性，以驗(yàn)證其實(shí)用性。通過100 ng·mL-1BSA、100 ng·mL-1葡萄糖、1 ng·mL-1ConA和 100 ng·mL-1BSA、1 ng·mL-1的混合物測(cè)試光電流響應(yīng)分別為ConA和 100 ng·mL-1葡萄糖。結(jié)果表明，當(dāng)這些干擾物質(zhì)存在時(shí)，對(duì)ConA的測(cè)定沒有明顯影響,見圖5(b)。這表明新型 PEC 傳感器具有優(yōu)異的選擇性。

2.6 血清樣品中ConA的檢測(cè)

通過對(duì)血清樣品中加入不同濃度ConA進(jìn)行回收率的研究，見表1。人體血清中ConA的平均回收率范圍為99.7%～106.7%，RSD范圍為1.25%～3.72%。并且將該方法與其他方法進(jìn)行了比較(表2)。結(jié)果表明,該P(yáng)EC傳感器具有較好的靈敏度和選擇性，在實(shí)際血液樣本分析中具有潛在的實(shí)用價(jià)值。

表1 人體血清中ConA測(cè)定

表2 ConA不同測(cè)定方法比較

3 結(jié)論

Ag2S/BiOBr是通過原位生長(zhǎng)合成的，并成功地用于制造 PEC 生物傳感器來檢測(cè)ConA。微球BiOBr為負(fù)載更多的Ag2S提供了一個(gè)平臺(tái)來放大檢測(cè)信號(hào)，Ag2S不僅可以作為光吸收劑，還可以作為光電流放大器。它們?cè)谛盘?hào)放大和提高 PEC 生物傳感器靈敏度方面發(fā)揮作用。所提出的 PEC 生物傳感器可以在1.0×10-3～1.0×102ng·mL-1的范圍內(nèi)測(cè)定ConA，檢測(cè)下限為 0.35 pg·mL-1。人體血清分析結(jié)果表明，所提出的PEC生物傳感器在生物分析方面靈敏度高，選擇性好，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。