韓銘海，王未鮮，付相榮，彭 意,康麗娟，龔 勛，許存賓

(貴州理工學(xué)院食品藥品制造工程學(xué)院，貴州貴陽 550000)

畢赤酵母(，最新系統(tǒng)命名為)是當(dāng)今科研和商業(yè)化生產(chǎn)重組蛋白最常用、最受歡迎的表達(dá)平臺(tái)之一。畢赤酵母具有良好的生物安全性、易高密度培養(yǎng)、高轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子、較強(qiáng)的蛋白合成分泌能力、胞外產(chǎn)物易分離純化及與更高級(jí)真核細(xì)胞類似的翻譯后修飾等諸多優(yōu)點(diǎn)。畢赤酵母相比釀酒酵母()而言，其表達(dá)分泌蛋白的能力更卓越。蛋白高水平表達(dá)技術(shù)和策略一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，當(dāng)前，提高蛋白表達(dá)的主要技術(shù)有：一是優(yōu)化發(fā)酵條件，包括培養(yǎng)基優(yōu)化、誘導(dǎo)策略優(yōu)化、高密度培養(yǎng)等手段；二是優(yōu)化分子生物學(xué)技術(shù)，包括密碼子優(yōu)化、選用強(qiáng)啟動(dòng)子和高效信號(hào)肽、增加基因拷貝數(shù)等；三是改造蛋白折疊、修飾和分泌途徑等。

在發(fā)酵過程中，畢赤酵母細(xì)胞會(huì)受到環(huán)境中的各種脅迫，例如代謝產(chǎn)物、不適溫度、pH和離子強(qiáng)度等脅迫，這些脅迫可能會(huì)顯著影響細(xì)胞的生理特性，包括蛋白合成和分泌表達(dá)能力，該問題已經(jīng)受到越來越多的科研工作者的關(guān)注。畢赤酵母是甲基營養(yǎng)型酵母，能以甲醇作為唯一碳源和能源，同時(shí)，甲醇也是誘導(dǎo)畢赤酵母外源蛋白表達(dá)最常用的誘導(dǎo)物，但甲醇本身對(duì)宿主也會(huì)產(chǎn)生脅迫效應(yīng)。因此，若要獲得甲醇誘導(dǎo)外源蛋白的高水平表達(dá)，甲醇脅迫是需要關(guān)注的一個(gè)問題。

1 PAOX1的甲醇誘導(dǎo)

畢赤酵母外源蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子主要有醇氧化酶I(AOX1)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAP)、醇脫氫酶(ADH3)、甲醛脫氫酶(FLD1)等基因的啟動(dòng)子，其中，AOX1的啟動(dòng)子(P)最常使用。醇氧化酶包括AOX1和AOX2兩種酶蛋白，畢赤酵母細(xì)胞85%的醇氧化酶活力來自AOX1，該酶蛋白催化甲醇轉(zhuǎn)化為甲醛，是甲醇代謝途徑中的關(guān)鍵酶；醇氧化酶與氧的親和力較弱，因此，細(xì)胞需要合成大量的此酶蛋白來完成相應(yīng)的催化功能。在細(xì)胞利用甲醇生長(zhǎng)過程中，P表現(xiàn)出極強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，AOX1占到了胞內(nèi)蛋白的30%。

P在較低濃度甲醇條件下就可以被高效地誘導(dǎo)。例如，在0.5%濃度下，甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母表達(dá)重組人豆莢蛋白(legumain)、胰島素前體(insulin precursor)、耐熱葡聚糖酶和單鏈Fv抗體片段(single-chain Fv antibody fragment)均能獲得理想的表達(dá)水平。Vanz等報(bào)道，誘導(dǎo)表達(dá)乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen)的甲醇濃度為0.6%。而Ohsawa等報(bào)道，0.1%的甲醇濃度就能誘導(dǎo)P表現(xiàn)出極強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性。

雖然大部分文獻(xiàn)報(bào)道甲醇誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)最適濃度范圍為0.5%～2.0%，但是也有學(xué)者報(bào)道，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究結(jié)果表明稍高濃度(10 g/L)的甲醇反而會(huì)抑制P的轉(zhuǎn)錄活性。另外，除了P以外，畢赤酵母利用甲醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子還有P、P、P等，利用這些啟動(dòng)子表達(dá)外源蛋白時(shí)，甲醇脅迫的影響同樣是必須要關(guān)注的問題。

2 甲醇脅迫響應(yīng)

甲醇不僅作用于畢赤酵母的甲醇代謝途徑，而且對(duì)整個(gè)細(xì)胞都有影響。Vanz等報(bào)道在分批培養(yǎng)模式下，畢赤酵母對(duì)較低濃度的甲醇(6 g/L)即可產(chǎn)生脅迫響應(yīng)?；谵D(zhuǎn)錄組學(xué)研究結(jié)果，畢赤酵母甲醇脅迫響應(yīng)影響多個(gè)代謝途徑和細(xì)胞生理特性。涂庭勇等也報(bào)道了采用“低甲醇濃度-高溶解氧濃度”策略誘導(dǎo)畢赤酵母能獲得更高目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。由此，可以推測(cè)甲醇誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)的最佳濃度是甲醇誘導(dǎo)作用與甲醇脅迫效應(yīng)兩者平衡的結(jié)果。

畢赤酵母中，甲醇在過氧化酶體中被醇氧化酶(AOX1和AOX2)轉(zhuǎn)化為甲醛和過氧化氫。甲醛在細(xì)胞質(zhì)中被甲醛脫氫酶(FLD1)催化為甲酸，接著被甲酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為二氧化碳和水，并釋放能量；或是甲醛在二羥丙酮合成酶(DAS1)作用下與5-磷酸木酮糖合成3-磷酸甘油醛和二羥丙酮，從而進(jìn)入細(xì)胞同化代謝途徑。在甲醇誘導(dǎo)階段，70%～80%的甲醇進(jìn)入了異代謝途徑產(chǎn)生NADH和二氧化碳。畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)階段甲醇代謝的關(guān)鍵酶類AOX1、甲酸脫氫酶(FDH1)、FLD1、甲酰谷胱甘肽水解酶(FGH1)和DAS1表達(dá)量上調(diào)，說明細(xì)胞甲醇代謝途徑更活躍。

在甲醇誘導(dǎo)階段，碳代謝主要集中于甲醇的代謝。TPI1(磷酸甘油醛異構(gòu)酶，引導(dǎo)甘油進(jìn)入碳中心代謝途徑)顯著下調(diào)，糖酵解途徑和戊糖磷酸途徑酶類普遍下調(diào)；除了蘋果酸脫氫酶(MDH1)顯著下調(diào)外，TCA循環(huán)中的酶類變化不顯著。Li等研究發(fā)現(xiàn)，在甲醇誘導(dǎo)階段，畢赤酵母能量代謝途徑普遍下調(diào)。

畢赤酵母需要提高過氧化物酶水平來抵御甲醇的毒害作用。在甲醇代謝途徑中，甲醇被AOX1和AOX2催化形成毒性更強(qiáng)的甲醛、HO和其他過氧化物及活性氧物質(zhì)(ROS)，導(dǎo)致細(xì)胞遭受氧化脅迫(oxidative stress)，細(xì)胞進(jìn)而上調(diào)一些過氧化物酶類，比如CTA1(去除HO)和PMP20(去除烷基氫過氧化物，維護(hù)過氧化酶體膜功能)，來抵御氧化脅迫。同時(shí)，氧化脅迫響應(yīng)不僅提高畢赤酵母抵御氧化脅迫能力，也能增強(qiáng)其抗熱應(yīng)激能力。

一些特定的信號(hào)通路常常介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)惡劣環(huán)境的應(yīng)答，而這些信號(hào)通路大多數(shù)情況下與MAPK信號(hào)通路關(guān)聯(lián)。畢赤酵母的甲醇誘導(dǎo)上調(diào)了MAPK信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)。MAPK信號(hào)通路與畢赤酵母細(xì)胞維持細(xì)胞壁的功能相關(guān)，與細(xì)胞生理生化和相關(guān)基因調(diào)節(jié)都有關(guān)系，影響細(xì)胞生長(zhǎng)率；上調(diào)MAPK信號(hào)通路可有效地提高細(xì)胞抵御甲醇脅迫的能力，確保細(xì)胞的生存。另外，對(duì)于外源蛋白表達(dá)來說，MAPK信號(hào)通路也影響P的活性。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)新生肽的合成及折疊效率對(duì)蛋白的高效表達(dá)至關(guān)重要。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，新生肽經(jīng)歷極為復(fù)雜的折疊加工機(jī)制，而細(xì)胞嚴(yán)謹(jǐn)?shù)馁|(zhì)量控制機(jī)制確保了多肽的正確折疊。只有正確折疊的蛋白才能被細(xì)胞輸送至高爾基體，接受進(jìn)一步的修飾加工進(jìn)而完成分泌表達(dá)，而非正確折疊多肽被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)識(shí)別并進(jìn)入ERAD途徑，最終在細(xì)胞質(zhì)中被蛋白酶體徹底消化。大量非正確折疊的多肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中集聚產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫(ER stress)，上調(diào)細(xì)胞宿主未折疊蛋白響應(yīng)(UPR)通路，以消除大量非正確折疊多肽對(duì)細(xì)胞的毒害作用。

UPR通路雖然與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫關(guān)系最為密切，但是其他脅迫，比如高溫、高滲透壓、有機(jī)溶劑、DTT、重金屬、病毒、營養(yǎng)物饑餓等都會(huì)激發(fā)此通路。UPR下游靶基因功能涵蓋大部分新生肽合成、折疊、翻譯后修飾、運(yùn)輸途徑和ERAD途徑等，對(duì)細(xì)胞生理特性影響也十分廣泛，有些效應(yīng)并不與蛋白表達(dá)有直接的關(guān)聯(lián)。

有些報(bào)道雖然表明甲醇脅迫對(duì)UPR通路和ERAD途徑的影響不顯著。但Vanz等報(bào)道甲醇脅迫響應(yīng)與畢赤酵母UPR通路和ERAD途徑相關(guān)：PDI與SSC1蛋白(UPR通路關(guān)鍵蛋白)和CLPB與CDC48蛋白(ERAD途徑功能蛋白)在甲醇誘導(dǎo)階段上調(diào)了。而Li等研究發(fā)現(xiàn)甲醇誘導(dǎo)階段分子伴侶Hsp40上調(diào)了，表明激發(fā)了UPR；而ERAD途徑是下調(diào)的。

在甲醇誘導(dǎo)階段，細(xì)胞出現(xiàn)顯著的自噬現(xiàn)象：ATG1和其他與自噬相關(guān)的蛋白顯著上調(diào)，而負(fù)調(diào)控細(xì)胞自噬途徑的功能蛋白Tap42、Vps8、LCB1/2和Vps39則下調(diào)；天門冬酰胺蛋白酶(APR1)下調(diào)，標(biāo)志著細(xì)胞液泡降解；與蛋白酶體相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)；通過電鏡觀察到液泡由規(guī)則球形改變?yōu)閮?nèi)陷不規(guī)則形態(tài)；過氧化物酶體也呈現(xiàn)破壞并降解的現(xiàn)象，這也與細(xì)胞自噬有關(guān)。

3 甲醇脅迫響應(yīng)與UPR通路的交互作用

甲醇脅迫響應(yīng)與UPR通路對(duì)畢赤酵母細(xì)胞的多個(gè)途徑及生理特性都產(chǎn)生廣泛的影響，兩者之間存在交互作用的可能性。首先，甲醇脅迫導(dǎo)致上調(diào)細(xì)胞多個(gè)功能迥異的通路，包括上調(diào)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制相關(guān)的UPR通路，以緩解甲醇對(duì)細(xì)胞的脅迫，例如，甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母表達(dá)一些外源蛋白上調(diào)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分子伴侶蛋白，表明激發(fā)了UPR通路；其次，UPR與甲醇脅迫響應(yīng)作用于細(xì)胞若干相同的途徑，比如兩者都作用于糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑和ERAD途徑，同樣影響蛋白合成、運(yùn)輸和分泌途徑等；最后，甲醇脅迫也會(huì)同時(shí)誘發(fā)UPR通路和氧化脅迫響應(yīng)，而且在畢赤酵母中激發(fā)UPR和緩解氧化脅迫這兩種策略都可以促進(jìn)外源蛋白表達(dá)。在釀酒酵母中已證實(shí)了UPR與氧化脅迫響應(yīng)通路之間存在密切關(guān)聯(lián)性，在畢赤酵母中可能也會(huì)存在類似的情況。因此，畢赤酵母UPR通路與甲醇脅迫響應(yīng)存在交互作用的可能性，表1列舉了介導(dǎo)甲醇脅迫響應(yīng)與UPR交互作用可能的途徑及其功能蛋白。

4 緩解甲醇脅迫的策略及促進(jìn)蛋白表達(dá)作用

低濃度的甲醇誘導(dǎo)即可產(chǎn)生活性氧物質(zhì)(ROS)，從而誘發(fā)畢赤酵母氧化脅迫響應(yīng)，而氧化脅迫與畢赤酵母外源蛋白高水平表達(dá)密切相關(guān)。因而有研究者試圖尋求緩解甲醇誘導(dǎo)導(dǎo)致氧化脅迫的策略，并考察對(duì)蛋白表達(dá)的作用。

激發(fā)氧化脅迫響應(yīng)通路轉(zhuǎn)錄因子Yap1p(Gene ID:8200866)已經(jīng)得到了鑒定，并有學(xué)者發(fā)表了通過共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Yap1p緩解甲醇脅迫促進(jìn)蛋白表達(dá)的研究。例如，Delic等報(bào)道，過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Yap1p促進(jìn)了畢赤酵母外源重組蛋白的表達(dá)，而削弱Yap1p功能則導(dǎo)致ROS的聚集；轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明，表達(dá)Yap1p影響超過150個(gè)基因的表達(dá)，其中包括了抗氧化酶類或是與氧化-還原生化過程相關(guān)的功能蛋白；胞內(nèi)氧化細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSSG)水平印證了過表達(dá)Yap1p能夠使細(xì)胞維護(hù)一定的氧化還原狀態(tài)；筆者推測(cè)調(diào)整細(xì)胞抗氧化能力以重建細(xì)胞適宜的氧化還原狀態(tài)，能夠降低細(xì)胞代謝負(fù)荷，緩解由蛋白氧化折疊導(dǎo)致的細(xì)胞脅迫，由此促進(jìn)外源蛋白分泌表達(dá)。

表1 介導(dǎo)甲醇脅迫響應(yīng)與UPR交互作用可能的途徑及其功能蛋白Table 1 Pathway and functional proteins involved in crosstalk between methanol stress response and UPR

另外，還有研究者發(fā)表了通過共表達(dá)一些與氧化還原生化過程相關(guān)的功能蛋白緩解甲醇脅迫以促進(jìn)蛋白表達(dá)的研究。Ibrahim等報(bào)道了在畢赤酵母KM71H中表達(dá)的卵鐵傳遞蛋白(ovotransferrin)會(huì)出現(xiàn)自我剪切并呈現(xiàn)出類似于超氧化物歧化酶的活性，顯著提高了細(xì)胞質(zhì)的還原活性，從而通過表達(dá)卵鐵傳遞蛋白提高了宿主抵御由HO和順丁烯二酸二乙酯(DEM)介導(dǎo)的氧化脅迫能力。Tomàs-Gamisans等則報(bào)道，表達(dá)NADH 激酶(POS5)提高了NADPH/NADP比值，促進(jìn)了抗體片段(Fab)的表達(dá)。Wu等報(bào)道，共表達(dá)N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(N-acetyltransferase)能夠保護(hù)細(xì)胞在甲醇誘導(dǎo)階段免遭ROS的損傷，細(xì)胞生物量提高了22.7%，目標(biāo)蛋白α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)表達(dá)水平提高了21.5%，而且也顯著緩解了目標(biāo)蛋白的降解。

5 激發(fā)UPR緩解甲醇脅迫的研究展望

畢赤酵母是目前外源蛋白表達(dá)最受歡迎的宿主之一，提高外源蛋白表達(dá)水平的技術(shù)和策略一直是該領(lǐng)域研究的重要內(nèi)容。甲醇誘導(dǎo)P是目前最成功、最廣泛使用的外源蛋白表達(dá)強(qiáng)啟動(dòng)子，甲醇除了誘導(dǎo)作用外，本身對(duì)畢赤酵母細(xì)胞也造成脅迫效應(yīng)，更可能影響細(xì)胞合成蛋白的各個(gè)環(huán)節(jié)。因此很有必要進(jìn)一步弄清畢赤酵母對(duì)甲醇脅迫的響應(yīng)，并尋求抵御甲醇脅迫的策略。弄清緩解甲醇脅迫對(duì)蛋白表達(dá)途徑的抑制作用，這將有助于進(jìn)一步推動(dòng)畢赤酵母蛋白高效表達(dá)技術(shù)的發(fā)展。除了P以外，畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子還有P、P、P等，如果能獲得有效緩解甲醇脅迫策略，也將提升這些啟動(dòng)子的使用價(jià)值，擴(kuò)充畢赤酵母外源蛋白表達(dá)啟動(dòng)子的選擇范圍。

另外，UPR通路作用于蛋白合成、折疊和加工以及運(yùn)輸途徑外，也廣泛地作用于細(xì)胞的其他方面，而畢赤酵母UPR通路與甲醇脅迫響應(yīng)存在交互作用的可能性。因此，筆者提出通過激發(fā)畢赤酵母UPR緩解甲醇脅迫促進(jìn)蛋白表達(dá)的策略。

Guerfal等首次鑒定了畢赤酵母UPR通路的轉(zhuǎn)錄因子Hac1p，而且筆者先前的研究工作也已驗(yàn)證了通過共表達(dá)Hac1p可有效地激發(fā)宿主的UPR途徑。根據(jù)甲醇脅迫響應(yīng)與UPR通路的作用途徑，厘清以下途徑和功能有助于闡明UPR和甲醇脅迫響應(yīng)之間的交互作用：① 蛋白合成相關(guān)的途徑和功能。例如蛋白合成強(qiáng)度，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)新生肽合成、折疊和修飾加工的能力，分泌運(yùn)輸?shù)鞍啄芰?，ERAD途徑等。② 甲醇代謝及代謝產(chǎn)物的解毒?？疾旒状即x途徑中關(guān)鍵酶類，分析甲醇代謝途徑強(qiáng)度情況，比較甲醇同化代謝與異化代謝調(diào)整的情況。考察范圍包括催化甲醇轉(zhuǎn)化為甲醛的AOX1、甲醛同化代謝的關(guān)鍵酶二羥基丙酮酶DAS1和DAS2及甲醇異化代謝的關(guān)鍵酶乙醛脫氫酶FLD1；考察甲醇代謝產(chǎn)生的毒害物質(zhì)的關(guān)鍵解毒酶，比如消除過氧化物的CTA1和PMP20，分析細(xì)胞的解毒能力。③ 能量代謝。主要考察糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑、三羧酸循環(huán)代謝途徑和內(nèi)膜電子傳遞系統(tǒng)。④ 氨基酸代謝。主要考察氨基酸合成途徑的關(guān)鍵酶類。其次，還需要考察細(xì)胞其他生理特性，主要關(guān)注氧化脅迫(oxidative stress)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶系統(tǒng)、過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)、液泡和自噬、生長(zhǎng)速率和死亡率。通過考察UPR與甲醇脅迫響應(yīng)作用途徑及其功能蛋白，不僅可以進(jìn)一步完善UPR對(duì)細(xì)胞的作用機(jī)制，同時(shí)可有望闡明畢赤酵母UPR與甲醇脅迫響應(yīng)交互作用的機(jī)制。