李燦，李振峰，馬劉正，張偉，李曉冬，VIJAYA Raghavan，胡建東，4*

（1.河南省農業(yè)激光技術國際聯(lián)合實驗室，河南農業(yè)大學機電工程學院，鄭州 450002；2.河南問道光電科技有限公司，鄭州 450002；3.McGill大學生物資源工程系，加拿大 蒙特利爾H9X3V9；4.小麥玉米作物學國家重點實驗室，鄭州 450002）

雖然大部分農業(yè)工作者已經遵從精準農業(yè)、科學施肥的原則，但在某些地區(qū)依然存在施肥過度的問題，目前我國化肥消耗量約占世界的35%，過量的氮、磷導致水體富營養(yǎng)化，嚴重威脅人類賴以生存的水資源。我國不同類型土壤對于不同的作物目標產量需要不同的施肥量，過量化學肥料施用不僅對生態(tài)環(huán)境造成破壞，還影響到作物產量。長期過量施肥還會引起土壤理化性狀惡化，加速土壤酸化。據第二次全國土壤面源污染調查報告顯示，農業(yè)生產引起的河湖流域總氮、總磷面源污染量分別占總污染量的36.79%、50.23%。因此實施科學施肥，不僅有助于糧食產量提高，而且能極大地降低農田面源氮、磷污染。只有全面掌握土壤養(yǎng)分分布狀況，才能根據肥料釋放規(guī)律和作物養(yǎng)分吸收特點等針對性地施肥，從而提高肥料利用率。

土壤氮、磷測量典型的方法有質譜法、色譜法、電化學法和分光光度法等，其中質譜法和色譜法的測試結果精確，但測試成本高，且需專業(yè)的操作人員。電化學方法的檢測速度快，但是檢測結果易受到待測樣品中其他離子的干擾，尤其是待測樣品中有機分子對其影響較大。紫外可見分光光度法（UV-Vis spectrophotometry）盡管操作繁雜，但方法成熟，測試結果可靠，所以仍是實驗室檢測氮、磷的主要方法。目前，隨著光電探測技術和自動控制技術的進步，流動分析方法在土壤氮、磷自動化測試方面最具有潛力。按照傳質過程和化學反應發(fā)生條件進行分類，流動分析方法有擴散對流（Dispersion convection）和強制對流（Forced convection）兩種。市場化的流動分析方法普遍采用智能機器手或者注射泵實現(xiàn)微量土壤氮、磷樣品自動化進樣，不僅使試劑消耗量降低了90%以上，而且減少了紫外可見分光光度法中由于操作者帶來的操作誤差。但現(xiàn)有流動分析方法由于追求多樣品的測試速度而沒有考慮化學反應的徹底性，導致被測對象的回收率低。為此，本研究提出擾動擴散流動分析法，在測試系統(tǒng)中增加集成化學反應腔，不僅滿足土壤樣品快速測試，而且最大限度地保證了化學反應完全徹底地進行。擾動擴散流動分析法通過多通道切換閥連接多個土壤有效態(tài)氮、磷樣品和試劑，實現(xiàn)土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和水溶性磷依次自動連續(xù)測量。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

檸檬酸鈉、鉬酸銨購自天津永大化學試劑有限公司；水楊酸鈉、硝普鈉、硫酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸、氫氧化鈉、二氯異氰脲酸鈉、N-1-萘基乙二胺鹽酸、硫酸鋅、酒石酸銻鉀、抗壞血酸、磷酸二氫鉀、濃硫酸、氯化鈷、十二烷基硫酸鈉購自國藥集團化學試劑有限公司；Brij-35 購自合肥千盛生物科技有限公司；十水二磷酸鈉、硫酸肼購自天津市科密歐化學試劑有限公司；硫酸銅、磺胺購自天津市大茂化學試劑廠。以上試劑均為分析純。實驗過程所用的水均為去離子水。銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和水溶性磷的標準物質購自北京海岸鴻蒙有限公司。

1.2 擾動擴散流動分析方法

擾動擴散流動分析方法構建方案如圖1所示，其構建思想是采用化學反應腔和模塊化光電探測單元，實現(xiàn)流動分析穩(wěn)態(tài)測量。被測樣品和試劑通過注射泵精確定量化后依反應先后順序注入化學反應腔，反應集中在化學反應腔內進行。然后程序控制蠕動泵正反轉，提供化學反應所需要的混合動力，空氣從化學反應腔的底部泵入推動樣品和試劑循環(huán)擾動，加速其化學反應過程，待反應完成后流入光電探測單元。

圖1 擾動擴散流動分析土壤氮、磷測試原理示意圖Figure 1 Schematic diagram of the principle of soil nitrogen and phosphorus testing by perturbation diffusion flow analysis

擾動擴散流動分析方法涉及到復雜物理化學過程，如擾動力學、流體擴散、對流和化學反應動力學等。首先被測樣品被注射泵注入到化學反應腔，然后依次根據反應對象和條件注入相應的試劑。蠕動泵正轉抽取化學反應腔中反應物進入均勻螺旋環(huán)發(fā)生擴散反應，再高速反轉使其泵回化學反應腔中發(fā)生湍流運動，加速化學反應進行。反復擾動化學反應腔中的反應物使其化學反應到達穩(wěn)定狀態(tài)，最后流入模塊化光電探測單元進行土壤氮、磷含量測試。與常見流動分析方法只能進行瞬態(tài)測試相比，擾動擴散流動分析方法提供了一種全新的穩(wěn)態(tài)流動分析方法。

擾動擴散流動分析系統(tǒng)中化學反應腔和螺旋管中樣品和試劑混合反應以擴散和對流為主。根據菲克第一定律（Fick’s first law），化學反應腔中反應物徑向和軸向質量擴散通量為：

式中：為溶液擴散系數，m·s；為溶液擴散濃度，kg·m；為軸向距離，m；為徑向距離，m；和分別為軸向和徑向質量擴散通量，kg·m·s?！?”號表示擴散方向為濃度梯度的反方向，即擴散組元由高濃度區(qū)向低濃度區(qū)擴散。

在直流管道流動過程中，無量綱雷諾數用于判斷液體流動形式為層流或湍流，當雷諾數超過2 100時，液體管道流動形式為湍流，反之則為層流，雷諾數計算公式為：

在層流條件下，所有溶液流動都遵循平行于主方向流線，不同直徑方向流速計算公式為：

由于液體擴散系數值非常低，通常約為10～10m·s，因此擴散通量相比于對流質量傳質通量來說，其值也非常低。在擾動擴散流動分析系統(tǒng)中，蠕動泵推進液體進行擾動，流量小于5 mL·min，管半徑為0.3～0.8 mm，液體流動形式為層流（＜150）。根據流體動力學參數確定管子直徑、長度和各器件位置合理布局等。氣泡分割測試溶液成多段，實現(xiàn)樣品多次連續(xù)測量，使擾動擴散流動分析方法測試土壤氮、磷自動化。

1.3 擾動擴散流動分析系統(tǒng)設計

1.3.1 系統(tǒng)組成與結構

基于擾動擴散流動分析土壤氮、磷測定系統(tǒng)如圖2所示，由3個單元組成，分別是樣品和試劑量化取樣單元、化學反應腔單元和模塊化光電探測單元。

圖2 擾動擴散流動分析法土壤氮、磷測試系統(tǒng)組成及結構Figure 2 Composition and structure of soil nitrogen and phosphorus testing system by perturbation diffusion flow analysis

被測樣品和試劑取樣單元由多通道電磁閥組、儲液環(huán)、微量注射泵（分辨率0.041 5 μL）和超聲液位傳感器組成。多通道電磁閥組包括試劑和樣品溶液切換電磁閥。土壤樣品溶液和試劑的切換由八通道電磁切換閥實現(xiàn)，電磁切換閥點到點的速度為300 ms，最大驅動力1.6 N，完成待測樣品的銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和水溶性磷依次測量。儲液環(huán)由內徑1.5 mm 和外徑2.5 mm 的塑料軟管制成圓環(huán)形狀，樣品和試劑提取完成后，儲液環(huán)內充滿去離子水，防止交叉污染。微量注射泵每次抽取液體最大容量為5 mL，步進電機步距角為0.9°，額定行程為30 mm，步數為120 000步，線性范圍為0.017～5.000 mm·s，控制分辨率為0.002 5 mm。最小進樣量為0.041 5 μL，速度為1～50 r·min，重復性誤差為3‰～7‰。

1.3.2 化學反應腔

化學反應腔是擾動擴散流動分析系統(tǒng)最重要的單元。樣品和試劑通過注射泵精確提取之后，蠕動泵反復擾動化學反應腔中反應物，使其充分發(fā)生化學反應，然后流入光電探測單元?；瘜W反應腔結構如圖3 所示，包括頂端蓋、霧化噴頭、化學反應混合筒和下端蓋?；瘜W反應腔為石英玻璃材質，內壁涂覆疏水涂層使液體匯集成液滴，減少液體內壁殘留。通過控制蠕動泵流量使霧化噴頭噴射到化學反應腔內壁，液體最高點距頂端蓋尺寸適中。程序控制蠕動泵首先抽取化學反應腔內反應物，然后再反轉，使溶液全部泵回化學反應腔，接著泵入一段空氣，使化學反應腔中樣品和試劑充分擾動并達到反應平衡。

圖3 擾動擴散流動分析法化學反應腔結構Figure 3 Chemical reaction chamber structure of perturbation diffusion flow analysis method

1.3.3 模塊化光電探測單元

模塊化光電探測單元由微流池、光源控制電路、信號處理電路、光電信號采集與傳輸電路組成。光源控制電路板和光電信號采集電路板分別安裝在微流池兩端，信號處理電路板置于微流池側面，各板之間信號以RS485 總線協(xié)議與主控制器通訊。由于土壤速效氮、磷含量是一個動態(tài)變化過程，不同地域不同時期土壤速效氮、磷含量差別較大，如低施肥和森林土壤速效氮、磷含量普遍較低。為了滿足不同情況下測試精度要求，微流池可組成10、20 mm 和30 mm 3種不同光程長，組合LED 光源波長有405、440、515、550、640、880 nm和660 nm等供選擇。

2 結果及討論

2.1 樣品和試劑取樣誤差

擾動擴散流動分析方法采用微量注射泵和儲液環(huán)精確提取土壤速效氮、磷樣品和試劑，樣品和試劑定量化提取的準確性直接影響到擾動擴散流動分析測試結果。為了評測取樣誤差，在操作系統(tǒng)中設定提取量分別為0.2、0.4 mL 和1.0 mL 的去離子水，經過注射泵注入到化學反應腔后，采用標準體積量具從化學反應腔端接提取液，分別重復5次，測試結果如表1所示。實驗結果表明，提取樣品最大絕對偏差和最大相對偏差分別為0.006 mL 和1.56%，滿足擾動擴散流動分析方法對取樣精度要求。

表1 擾動擴散流動分析取樣誤差Table 1 Sampling errors of perturbation diffusion flow analysis

2.2 蠕動泵流量校正

為了減少擾動擴散流動分析土壤速效氮、磷測定系統(tǒng)中液體在管道中殘留，同一個樣品被氣泡分割多段進入流動系統(tǒng)，氣泡的引入和樣品流動穩(wěn)定性不僅影響氣泡大小，而且影響數據采集的準確性。擾動擴散流動分析系統(tǒng)中使用了多個蠕動泵，為了使不同蠕動泵的流量保持一致，設計了蠕動泵流量校正程序，校正實驗結果如表2 所示。校正后，平均流量值為4.075 mL·min，最大絕對標準偏差和最大相對標準偏差分別為0.029 mL·min和0.71%。

表2 擾動擴散流動分析進樣誤差Table 2 Injection errors of perturbation diffusion flow analysis

2.3 實際樣品測量

采集湖北省國家農業(yè)環(huán)境潛江觀測實驗站同一地區(qū)不同點的10 個水稻土土壤樣品，對土樣中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮和水溶性磷含量進行測定。土壤樣品取樣深度為20 cm。銨態(tài)氮測定基于靛酚藍反應方法和納氏試劑反應方法，硝態(tài)氮測定基于重氮偶合反應方法，水溶性磷測定基于抗壞血酸還原鉬藍反應方法。選擇擾動擴散流動分析土壤氮、磷測試模塊化光電探測單元光程長20 mm，設定PID 控制器控制溫度為37 ℃。土壤待測樣品分別分成2份，一份用擾動擴散流動分析系統(tǒng)進行測量，另一份采用紫外可見分光光度計測量。用于建立銨態(tài)氮測量標準曲線的標準溶液濃度分別為0、1.2、1.8、2.6 mg·L和3.2 mg·L，土壤標準硝態(tài)氮濃度分別為0、2、4、5 mg·L和6 mg·L，土壤標準水溶性磷溶液濃度分別為0、0.6、1.2、2.0 mg·L和2.6 mg·L。首先對標準溶液進行測試，建立擾動擴散流動分析測試吸光度值與標準溶液濃度校準曲線，如圖4所示。圖4a基于靛酚藍反應方法吸光度與標準溶液的線性相關系數為0.992 8，基于納氏試劑反應銨態(tài)氮擾動擴散流動分析方法相關系數為0.998 1?；谙鯌B(tài)氮重氮偶合反應擾動擴散流動分析測量方法相關系數為0.994 2，基于水溶性磷鉬藍反應擾動擴散流動分析測量方法相關系數為0.997 9。

圖4 擾動擴散流動分析土壤速效氮、磷校準曲線Figure 4 Perturbation diffusion flow analysis of soil effective state nitrogen and phosphorus calibration curve

標準曲線建立之后，分別采用兩種方法進行對比測量。紫外可見分光光度法采用275 nm和220 nm測定土壤速效氮磷含量。首先連續(xù)進行5 次空白溶液測試，然后測量實際樣品。擾動擴散流動分析土壤速效氮磷測量值與紫外可見分光光度計測量值之間的相關性如圖5所示。

由圖5a 可知，基于硫酸鈉和碳酸氫鈉聯(lián)合浸提納氏試劑反應集成流動分析銨態(tài)氮測量值與常規(guī)測量值之間的相關系數為0.915 5，基于氯化鈣浸提的土壤銨態(tài)氮靛酚藍反應、硝態(tài)氮重氮偶合反應和水溶性磷鉬藍反應集成反應流動分析測試值與常規(guī)方法測量值之間的相關系數分別為0.998 5、0.990 1和0.991 1（圖5b～圖5d）?？梢姅_動擴散流動分析測試與常規(guī)方法具有很好的相關性。擾動擴散流動分析能夠滿足不同浸提及測量方法體系自動化分析，其通用性和可移植性將使其具有很好的應用前景。

圖5 擾動擴散流動分析土壤速效氮、磷樣品相關性實驗驗證Figure 5 Experimental validation of correlation of soil effective state nitrogen and phosphorus samples by perturbed diffusion flow analysis

2.4 檢出限與精密度

測定11 次空白溶液的吸光度，計算各指標的檢出限（LOD），計算公式為LOD=3·，（為11 次測定值的標準偏差，為接近LOD 標準曲線的斜率）。通過計算，銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和水溶性磷的檢出限分別為0.055 4、0.020 3 mg·L和0.008 4 mg·L，平均值分別為0.018 0、0.011 1 mg·L和0.008 5 mg·L，標準偏差分別為0.002 6、0.001 6 mg·L和0.000 3 mg·L。

擾動擴散流動土壤速效氮磷分析儀在進行銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和水溶性磷重復性測定中的結果顯示，其平均值（=7）分別為1.98、2.05 mg·L和2.02 mg·L，標準偏差（=7）分別為0.035、0.099 mg·L和0.019 mg·L，相對標準偏差（RSD，=7）分別為1.8%、4.8%和1.0%，滿足現(xiàn)場測試要求。

2.5 與AA3（Seal Analytical）連續(xù)流動分析方法對比

分別取銨態(tài)氮標準濃度樣品為0.25、0.50、1.00、2.00 mg·L，硝態(tài)氮標準濃度樣品為0.50、1.00、2.00、4.00 mg·L進行測試（=5），對比擾動擴散流動分析法與AA3連續(xù)流動分析方法，測試結果如表3、表4所示。

表3 兩種方法銨態(tài)氮測試結果對比Table 3 Comparison of ammonium nitrogen test results between the two methods

表4 兩種方法硝態(tài)氮測試結果對比Table 4 Comparison of nitrate nitrogen test results between the two methods

根據測試結果，在銨態(tài)氮檢測方面，AA3 連續(xù)流動分析方法的最大誤差是50.80%，本方法的最大誤差是6.00%，在檢測硝態(tài)氮方面，AA3 連續(xù)流動分析方法的最大誤差是3.60%，本方法的最大誤差是6.00%，說明這兩種方法具有可比性。AA3 型流動分析方法采用機器手自動化定量取樣，而本方法采用注射泵程序化定量取樣，因此，在確保取樣量化精度上，本測試方法構建成本極大降低。

3 結論

（1）本研究對新穎的擾動擴散流動分析方法進行了理論分析，構建了擾動擴散流動分析方法的實驗系統(tǒng)，該系統(tǒng)由樣品和試劑量化取樣單元、化學反應腔單元和模塊化光電探測單元三部分組成。

（2）采用來自于不同地區(qū)的土壤樣品對擾動擴散流動分析系統(tǒng)進行了實驗驗證，同時與實驗室常規(guī)土壤樣品分析使用的紫外可見分光光度法的測定結果進行了對比，結果表明，兩者測定結果有較高的相關性。擾動擴散流動分析系統(tǒng)不需要人工參與操作，極大地減少了操作人員帶來的實驗誤差。

（3）采用標準樣品與基于常規(guī)流動分析方法的AA3 型儀器進行對比，結果表明，兩種方法均能夠自動化完成樣品測試，在低濃度范圍內，本文提出的擾動擴散流動分析方法具有較高的測試精度。