張心青，田杰偉，馬娜娜，蔡倩倩，王紅霞，部麗群

（1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500；2.山東京博控股集團(tuán)有限公司，山東 濱州 256500）

施用化肥是補(bǔ)充土壤養(yǎng)分的重要措施，化肥在促進(jìn)作物生長發(fā)育、提高作物產(chǎn)量中發(fā)揮了巨大作用，但肥料利用率低造成的土壤質(zhì)量退化、養(yǎng)分流失、微生物數(shù)量減少等一系列負(fù)面影響已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的主要難題，可持續(xù)化生產(chǎn)已然成為未來農(nóng)業(yè)發(fā)展的必然趨勢。氮、磷、鉀作為農(nóng)作物生長發(fā)育所必須的三大營養(yǎng)元素，在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著極其重要的作用。我國土壤中含有豐富的磷鉀元素，但絕大多數(shù)的磷鉀元素都是以難溶性鹽的形式存在，其中90%以上不能被植物直接吸收利用。如何提高土壤中磷鉀含量，成為限制農(nóng)作物生長的重要因素。為了提高農(nóng)作物產(chǎn)量，需要每年施用大量的化學(xué)肥料或有機(jī)肥料，但施入的肥料利用率卻極低，并不能被農(nóng)作物有效吸收利用，當(dāng)季利用率低于25%。由于化學(xué)肥料的大量施用及施肥結(jié)構(gòu)的不合理，造成了我國的農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境污染和破壞以及土壤理化性能下降。已有大量的研究表明，土壤中存在許多有益微生物，其中部分微生物具有溶磷、解鉀效果，能夠?qū)⒅参镫y吸收的養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的形態(tài)，進(jìn)而在降低化肥使用量的同時(shí)提高作用的產(chǎn)量。若增加土壤中此類有益微生物的含量，能夠有效將土壤中不溶性養(yǎng)分轉(zhuǎn)化為作物可直接吸收利用的養(yǎng)分，降低肥料的使用量和成本，提高產(chǎn)量，同時(shí)降低大量肥料使用對生態(tài)環(huán)境造成的破壞。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 試驗(yàn)所用的WB1、Q1、L4 均是從番茄、黃瓜及小麥等大田連作土壤中分離得到的，對照菌株巨大芽孢桿菌11、西安膠質(zhì)芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試驗(yàn)用培養(yǎng)基 ①LB 培養(yǎng)基（1 L）：氯化鈉10 g、蛋白胨10 g、酵母粉5 g，攪拌至完全溶解后定容至1 000 mL，固體培養(yǎng)基加入1.8%～2%的瓊脂粉，121℃滅菌20 min。②PDA 培養(yǎng)基（1 L）：取200 g土豆去皮切塊，于800～900 mL 蒸餾水中煮30～40 min，冷卻后過濾，濾液中加入20 g 葡萄糖，攪拌至完全溶解后定容至1 000 mL，固體培養(yǎng)基加入1.8%～2%的瓊脂粉后，分裝入三角瓶內(nèi)并用紗布封口，121 ℃滅菌20 min。③發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖10 g，酵母膏3 g，KHPO·3HO 2 g，MgSO0.25 g，豆粕20 g，氯化鈉10 g，pH 值7.5，用蒸餾水混勻并定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要設(shè)備 XSP-BM 系列生物顯微鏡購自上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司；SHP-150 智能生化培養(yǎng)箱購自上海博迅實(shí)業(yè)股份有限公司；SW-CJ-2F 超凈工作臺購自蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；恒溫振蕩器購自上海旻泉儀器有限公司；TG-16WS 臺式高速離心機(jī)購自長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；ARTP 常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)購自北京思清源生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶磷解鉀菌株的篩選（1）菌株的分離純化。本研究篩菌所用的土壤采集自山東省濱州市番茄根際土、黃瓜根際土、小麥根際土。稱取10 g 土壤樣品，置于90 mL 無菌水中，放于35 ℃搖床中振蕩處理2 h，制成土壤菌懸液。然后對菌懸液進(jìn)行梯度稀釋后涂布在LB 固體培養(yǎng)基上，倒置于生化培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)1～3 d。挑取平板上菌落形態(tài)不同的菌株在新的LB 固體培養(yǎng)基上劃線分離純化，將分離純化的純菌進(jìn)行保存。

（2）溶磷解鉀菌株的初篩。先將融化后的1.5%素瓊脂（已滅菌）倒入已滅菌的平板中，形成一層薄薄的瓊脂層，使其恰好覆蓋平板底部。待瓊脂凝固后，每個(gè)平板按照等邊三角形的三個(gè)角放置3 個(gè)牛津杯，每個(gè)平板倒入10 mL 初篩培養(yǎng)基，待凝固后用滅菌的鑷子將牛津杯取出。每個(gè)孔內(nèi)加入相應(yīng)初篩菌液30 μL，于30 ℃培養(yǎng)5～7 d。用直尺測量透明圈的直徑（D）和菌斑的直徑（d），根據(jù)公式（1）計(jì)算直徑比（M）。

式中，M 為直徑比；D 為透明圈直徑；d 為菌斑直徑。

（3）溶磷解鉀菌株的復(fù)篩。將待測菌株轉(zhuǎn)接入LB 液體培養(yǎng)基內(nèi)，35 ℃170 r·min過夜培養(yǎng)，測定OD600，用LB 液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)各菌液的OD600 相同，按照相同的比例添加至對應(yīng)的復(fù)篩液體培養(yǎng)基內(nèi)，32 ℃170 r·min處理7 d，將發(fā)酵培養(yǎng)液置于離心管中，12 000 r·min離心取上清液，用鉬銻抗顯色法和火焰光度法分別檢測可溶性磷和鉀離子濃度的變化情況，對比溶磷能力和解鉀能力。

1.2.2 溶磷解鉀菌株的誘變 采用ARTP 的方法進(jìn)行誘變，通過設(shè)置不同的誘變條件，得到誘變曲線。設(shè)置通氣量為10 SLM，功率為120 W，誘變時(shí)間 依次 為0，10，30，60，70，80，90，100，110，120 s。將誘變后的載片置于1 mL 無菌水中，振蕩1 min以上，梯度稀釋至10，取65 μL 涂布，過夜培養(yǎng)后，計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率，繪制致死率曲線，確定最佳誘變條件。

以最佳誘變條件對無機(jī)磷溶解菌菌株和解鉀菌菌株進(jìn)行誘變。將誘變后的載片置于1 mL 無菌水中，振蕩1 min 以上，梯度稀釋至10，培養(yǎng)過夜后，挑取突變子于4 ℃保存。

采用初篩和復(fù)篩的方法對誘變子進(jìn)行篩選，篩選方法見1.2.1。

1.3 大田試驗(yàn)

將活化后的Q1、L4、WB1 于5 500 r·min4 ℃離心15 min，去掉上清液，其中WB1 離心前添加絮凝劑吸附，用蒸餾水重懸，將菌液和肥料按照表1所示的量進(jìn)行添加，每棵番茄苗按照10 mL 的量澆灌，每周取樣檢測土壤中有效磷和速效鉀含量的變化情況。

表1 大田番茄試驗(yàn)體系配制方案

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷解鉀菌株的篩選

2.1.1 菌株的分離純化 通過各地大田采集土樣等方式，共獲得了23 種樣品，并對這23 種樣品進(jìn)行了分離純化，經(jīng)過分離純化得到了84 種單菌。

2.1.2 溶磷解鉀菌株的初篩 通過對84 株單菌進(jìn)行有機(jī)磷溶解菌的初篩，以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有菌種庫中溶磷效果最好的菌株巨大芽孢桿菌11 為對照菌株，初步篩選得到溶磷能力較對照菌株提高菌株有13 株，具體見圖1，初篩試驗(yàn)中部分菌株溶解圈的效果圖見圖2。

圖1 有機(jī)磷溶解菌的初篩結(jié)果

圖2 有機(jī)磷溶解菌的溶解圈

通過對84 株單菌進(jìn)行無機(jī)磷溶解菌的初篩，以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有菌種庫中溶磷效果最好的菌株凝結(jié)芽孢桿菌為對照菌株，初步篩選得到溶磷能力較對照菌株提高菌株5 株，具體見圖3。

圖3 溶無機(jī)磷菌的初篩結(jié)果

通過對84 株單菌進(jìn)行解鉀菌的初篩，以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有菌種庫中解鉀效果最好的菌株西安膠質(zhì)芽孢桿菌為對照菌株，篩選得到解鉀能力較好的菌株8 株，其中最高的為L4。具體見圖4。

圖4 解鉀菌的初篩結(jié)果

2.1.3 溶磷解鉀菌株的復(fù)篩 對初篩得到的有機(jī)磷溶解效果較好的菌株進(jìn)行了復(fù)篩，通過復(fù)篩發(fā)現(xiàn)，其中溶磷能力高于對照菌株巨大芽孢桿菌11 的有10株（見圖5），溶磷能力提高50%以上的有6 株，提高120%以上的有1 株（Q1）。經(jīng)過16S rDNA 鑒定確定Q1 為解淀粉芽孢桿菌。

圖5 有機(jī)磷溶解菌的復(fù)篩結(jié)果

對初篩得到的無機(jī)磷溶解效果較好的菌株進(jìn)行了復(fù)篩，其中溶磷能力高于對照菌株的有4 株（圖6）。溶磷能力提高5%以上的有2 株。將這4 株復(fù)篩效果較好的菌株又進(jìn)行了同批次對比處理，通過檢測發(fā)現(xiàn)，仍然是WB1 的溶磷能力最高，因此選定WB1 為誘變出發(fā)菌株。經(jīng)過16S rDNA 鑒定和BioLOG 鑒定確定WB1 為產(chǎn)酸克雷伯氏菌。

圖6 無機(jī)磷溶解菌的復(fù)篩結(jié)果

對8 株初篩得到的解鉀效果較好的菌株進(jìn)行了復(fù)篩（表2），以西安膠質(zhì)芽孢桿菌作為對照菌株，培養(yǎng)4 d 后，L4 釋放鉀離子含量為33.88 μg·mL，pH值為5.59，鉀離子含量高于對照組西安膠質(zhì)芽孢桿菌269.06%，高于空白組35.2%，TU13 菌株在培養(yǎng)6 d 時(shí)，鉀離子含量達(dá)到最大為30.79 μg·mL，pH 值為4.68，選擇L4 進(jìn)行下一步誘變處理。經(jīng)過16S rDNA 鑒定確定L4 為枯草芽孢桿菌。

表2 解鉀菌復(fù)篩檢測結(jié)果

2.2 溶磷解鉀菌株的誘變

由圖7 可知，致死率隨著ARTP 誘變時(shí)間的延長而增長，誘變時(shí)間在90 s 內(nèi)時(shí)致死率呈急劇增長趨勢，90 s 時(shí)致死率為89.91%，故確定最佳誘變條件為80～90 s。

圖7 ARTP 誘變試驗(yàn)

根據(jù)上述確定的最佳誘變條件，進(jìn)行了4 批次的無機(jī)磷溶解菌的誘變，共計(jì)獲得誘變子833 個(gè)，并完成了對這833 個(gè)誘變子的初篩，從溶磷圈的直徑比D/d 來看，其中正突變子有364 個(gè)，其余為負(fù)突變子，直徑比D/d 明顯較誘變出發(fā)菌株增大的有56 株菌（圖8）。

圖8 正突變子的溶磷圈

選取初篩效果較好的無機(jī)磷溶解菌株188 株進(jìn)行了復(fù)篩，從檢測結(jié)果來看，有110 個(gè)正突變子，溶磷能力較誘變出發(fā)菌株（野生菌WB1）提高30%以上的有6 株，提高40%以上的有1 株，為4p-462（44.10%），提高60%以上的有1 株，為4p-449（63.23%），確定后期應(yīng)用4p-449 誘變子（表3）。

表3 溶磷菌部分誘變子復(fù)篩結(jié)果

進(jìn)行了2 批次的解鉀菌的誘變，共計(jì)獲得誘變子410 個(gè)，并完成了對這410 個(gè)誘變子的初篩，從溶磷圈的直徑比D/d 來看，其中正突變子有7 個(gè)，誘變子編號分別為編號為6、7、13、55、57、64、82。

選取初篩效果較好的菌株7 株進(jìn)行了復(fù)篩，從檢測結(jié)果來看，編號為64 的菌株培養(yǎng)7 d 后，鉀離子含量高于對照原始菌30.94%，pH 值為6.52，確定后期應(yīng)用編號為64 誘變子（表4）。

表4 解鉀菌部分誘變子復(fù)篩結(jié)果

2.3 溶磷解鉀菌的大田試驗(yàn)

空白組、L4+WB1、L4+Q1 3 個(gè)組做對比，速效鉀和可溶性磷呈先下降后上升的趨勢。其中，21 d 后，L4+WB1 組、L4+Q1 組的速效鉀和有效磷含量都提高了100%以上，甚至有的提高200%以上，充分說明溶磷解鉀菌能夠釋放土壤中的難溶性磷、鉀；隨著植物生長，速效鉀和有效磷含量略有下降，但基本能夠維持在一定的水平，且高于空白組，說明解鉀菌L4、溶磷菌WB1、Q1 能夠成功定植土壤，并發(fā)揮了高效溶磷解鉀的作用。

減肥40%+L4+WB1、減肥20%+L4+WB1、全肥試驗(yàn)組在施用微生物菌劑肥料后，速效鉀、可溶性磷均大幅升高，其中減肥40%+L4+WB1 和減肥20%+L4+WB1 2 組試驗(yàn)組呈先下降后上升的趨勢，全肥組一直呈下降趨勢，21 d 后，減肥組的有效磷和速效鉀含量高于全肥組50%以上；直到下一次施肥，全肥組有效磷和速效鉀含量略有升高，后又呈下降趨勢，而減肥40%+L4+WB1 和減肥20%+L4+WB1 2組能夠維持一直高于全肥組，說明添加解鉀溶磷復(fù)合菌劑后，在減肥40%情況下，土壤中溶磷解鉀菌持續(xù)釋放土壤中速效鉀、可溶性磷，避免植物生長對速效鉀、可溶性磷大量使用后下降的情況出現(xiàn)，使其含量能夠高于施用全肥的效果，滿足植物生長需求。

對大棚種植番茄株高、莖粗進(jìn)行檢測，通過對平均值的對比，其中，試驗(yàn)組WB1+L4 和試驗(yàn)組Q1+L4，莖粗分別為10.98，10.97 mm，株高分別為189，202.05 mm。試驗(yàn)組減肥40%+WB1+L4 與試驗(yàn)組減肥20%+WB1+L4、全肥（未接種解磷解鉀菌劑），莖粗分別為9.96，10.30，10.8 mm，株高分別為188.83，190.75，181.58 mm。通過減肥組與復(fù)合菌劑組的對比，復(fù)合菌劑組株高、莖粗略高于減肥組、全肥組，說明僅添加復(fù)合菌劑的試驗(yàn)組中番茄生長未出現(xiàn)明顯影響，能夠達(dá)到與施用全肥相當(dāng)?shù)男Ч??？紤]番茄苗種植前，土壤中施用過一次有機(jī)肥作為底肥，解鉀溶磷復(fù)合菌劑定植土壤后，主要起到了持續(xù)釋放土壤中難溶性鉀元素、磷元素的作用，使土壤保持豐富磷鉀元素，滿足植物生長需求，可以有效減少后期追肥次數(shù)及肥料施用量。

3 結(jié)論與討論

本研究開發(fā)的高效溶磷解鉀微生物菌劑具有高效溶磷解鉀功能，經(jīng)過誘變改造，溶磷解鉀功能提高30%以上，且該菌劑在土壤中的定植情況良好，能夠提高土壤中速效磷含量3 倍以上，提高速效鉀含量30%以上；通過大田試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高效溶磷解鉀微生物菌劑能夠有效促進(jìn)植物的生長，植株生物量提高25%以上，莖粗提高5%以上，有效提高植株的抗逆性。大田應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，溶磷解鉀菌劑的添加能夠有效釋放土壤中的磷、鉀元素，通過減肥組與全肥組對比，復(fù)合菌劑組與施肥組對比，發(fā)現(xiàn)施用復(fù)合菌劑組土壤中有效磷和速效鉀含量能夠達(dá)到施肥組的水平，效果明顯，且施用復(fù)合菌劑組的番茄莖粗和株高與施肥組相當(dāng)，甚至高于空白組，這與溶磷解鉀菌不僅具有溶磷解鉀功能，還具有固氮等其他功能有關(guān)。