鄒小南，羅 丹，李貴洪，王婭南，彭 杰，王淑婷，郭 峰，戰(zhàn) 楠，賈 靜，朱 帥，趙 虎

1.貴州工程職業(yè)學(xué)院，貴州 銅仁 565200 2.國家地質(zhì)實(shí)驗(yàn)測試中心，北京 100037 3.重慶資源與環(huán)境保護(hù)職業(yè)學(xué)院，重慶 402360

內(nèi)分泌干擾物(Endocrine Disrupting Chemicals，EDCs)是指外因性干擾生物體內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)，又稱為環(huán)境激素[1]。該類化合物可對(duì)生物體的免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生干擾，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)疾病的增發(fā)，在甲狀腺疾病方面的影響尤為突出[2-5]。以雙酚A(BPA)為例，其能導(dǎo)致人體內(nèi)分泌失調(diào)，可能會(huì)威脅到胎兒和兒童的健康，因此，許多國家和地區(qū)已禁止生產(chǎn)含BPA的嬰兒奶瓶。BPA、雌二醇(E2)、炔雌醇(EE2)、氫化可的松(CRL)在環(huán)境水體和土壤中的檢出頻率非常高，已造成一定程度的環(huán)境污染[6-10]。地下水是我國的主要飲用水源之一。天然和人工合成的內(nèi)分泌干擾物在生產(chǎn)和使用過程中會(huì)通過淋濾作用進(jìn)入地下水，從而對(duì)地下水質(zhì)量構(gòu)成潛在威脅。國家“十四五”規(guī)劃和2035年遠(yuǎn)景目標(biāo)綱要明確提出了“重視新污染物治理”的工作部署。內(nèi)分泌干擾物是新污染物的典型代表，對(duì)其在地下水中的污染狀況開展調(diào)查勢在必行[11-16]。地下水中的內(nèi)分泌干擾物具有濃度低和性質(zhì)差異大的特點(diǎn)，因此，亟待建立可同時(shí)分析測定地下水中多類內(nèi)分泌干擾物的高效分析方法，以滿足調(diào)查監(jiān)控的需求。

目前，國內(nèi)外用于測定環(huán)境介質(zhì)中內(nèi)分泌干擾物的方法多為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[17-20]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[21-23]兩種技術(shù)。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)耗費(fèi)低、靈敏度高，但其前處理需要經(jīng)歷衍生化步驟，操作煩瑣。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)前處理相對(duì)簡單，選擇性好且無需衍生化,因此，目前多采用高效液相色譜-質(zhì)譜法測定環(huán)境中的內(nèi)分泌干擾物。國內(nèi)有學(xué)者采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了污水中的雌激素水平，但所分析的物質(zhì)種類相對(duì)單一[24-26]。不同種類的激素在質(zhì)譜源中的電離模式不同，通常需分開測定，導(dǎo)致分析時(shí)間長，分析效率有待提高。在實(shí)際研究中，環(huán)境水體中往往多類內(nèi)分泌干擾物共存，而可同時(shí)測定多類內(nèi)分泌干擾物的高效分析方法則相對(duì)較少[27-32]。為更全面、快速地分析地下水中的痕量內(nèi)分泌干擾物，亟待建立準(zhǔn)確可靠、可實(shí)現(xiàn)不同類別內(nèi)分泌干擾物同時(shí)分析的方法[33]，以滿足地下水中痕量內(nèi)分泌干擾物分析的需要。

本研究選擇常見的9種雌激素、5種雄激素、3種腎上腺皮質(zhì)激素、4種酚類化合物和3種人工合成的非甾類激素共24種典型內(nèi)分泌干擾物為目標(biāo)分析物，通過重點(diǎn)優(yōu)化固相萃取時(shí)的pH、色譜條件及質(zhì)譜參數(shù)，建立了基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)分析地下水中24種內(nèi)分泌干擾物的方法，并將其應(yīng)用于實(shí)際地下水樣品分析，以期為地下水中多種內(nèi)分泌干擾物的同時(shí)測定提供可靠的技術(shù)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX，API4000)，固相萃取裝置(美國Waters，wat200609)，氮吹儀(常州歐諾德，ODSL-12)，超純水儀(美國Millipore，Milli-Q)，Oasis MCX固相萃取小柱(美國Waters，500 mg，6 mL)，Poroshell 120 Bonus-RP色譜柱(美國Agilent，2.7 μm，100 mm×2.1 mm)，ACQUITY UPLC BEH色譜柱(美國Waters，1.7 μm，50 mm×2.1 mm)。實(shí)驗(yàn)過程所用試劑見表1。

表1 主要試劑Table 1 The main reagent

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

準(zhǔn)確稱取固體標(biāo)準(zhǔn)品0.005 0 g，用甲醇溶解后定容于5 mL棕色容量瓶中，配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，密封并置于溫度為4 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

分別移取100 μL目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，放入10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，配制成濃度為10 μg/mL的混合儲(chǔ)備液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

移取不同體積的混合儲(chǔ)備液于10 mL棕色容量瓶中，加入100 ng內(nèi)標(biāo)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇定容，配制成濃度梯度為1.00、2.00、5.00、10.00、25.00、50.00、100.00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品的采集及前處理

本研究參考《地下水環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》(HJ 164—2020)，在河北省8個(gè)地級(jí)市采集了48個(gè)地下水樣品。在每個(gè)采樣點(diǎn)，用待采水樣沖洗硬質(zhì)玻璃瓶3次后，采集監(jiān)測水井中水面下10～30 cm處的潛水(淺層地下水)，并用濃硫酸調(diào)節(jié)水樣pH至3及以下。將樣品運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室后，1～5 ℃避光冷藏。所有樣品于48 h內(nèi)完成處理并測定。

取上清液，經(jīng)0.45 μm玻璃纖維膜過濾后，量取1 L水樣，加入10 ng內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。依次用6 mL甲醇、6 mL pH=5的超純水充分活化Oasis MCX固相萃取小柱，然后將上述1 L已準(zhǔn)備好的水樣過柱(流速控制在5～10 mL/min)。上樣完成后，用6 mL pH=5的水進(jìn)行清洗，使固相萃取柱上富集的水溶性離子化合物脫離，隨后真空抽取10 min以去除水分。最后，用9 mL堿化乙腈(4.5%，體積分?jǐn)?shù))洗脫，氮?dú)獯蹈?，并用甲醇定容?.0 mL待上機(jī)分析。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜分析條件

采用Poroshell 120 Bonus-RP色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分離。柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速始終為0.3 mL/min。流動(dòng)相D為0.1%氨水溶液，流動(dòng)相B為乙腈。

梯度洗脫條件：0.0 min，35% B；0.0～5.0 min，35%～95% B；5.0～10.0 min，95% B；10.0～10.5 min，95%～35% B；10.5～14.0 min，35% B。

1.4.2 質(zhì)譜分析條件

采用MRM模式劃分時(shí)間窗口采集正、負(fù)離子。離子源：電噴霧(ESI)；電離模式：正負(fù)離子分段采集；氣簾氣(CUR)壓力：20 kPa；碰撞氣(CAD)壓力：20 kPa；電噴霧電壓：5 000 V；輔助氣1(GS1)壓力：40 kPa；輔助氣2(GS2)壓力：0 kPa；接口加熱器(Ihe)：開；入口電壓(EP)：10 V；離子源溫度(TEM)：500 ℃。在負(fù)離子模式下分析酚類化合物、非甾類激素及部分雌激素，在正離子模式下分析雄激素、腎上腺皮質(zhì)激素及部分雌激素(表2)。

表2 地下水中24種內(nèi)分泌干擾物的質(zhì)譜參數(shù)和保留時(shí)間Table 2 MS parameters and retention time of the 24 endocrine disrupting chemicals in the groundwater

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

對(duì)比了ACQUITY UPLC BEH與Poroshell 120 Bonus-RP兩種色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)后者對(duì)目標(biāo)物的分離度更高，可使雄激素和孕激素等實(shí)現(xiàn)較好的分離。為獲得最佳分離度和分析靈敏度，對(duì)比了分別以甲醇和乙腈為流動(dòng)相時(shí)的分離情況。結(jié)果表明，以甲醇和乙腈為流動(dòng)相時(shí)，大多數(shù)物質(zhì)均可獲得較好的分離度和峰形，但以乙腈為流動(dòng)相時(shí)，E1和Dieno、ME-Prednl和NDL等出峰時(shí)間相近的物質(zhì)的分離度更好，故有機(jī)相選用乙腈。當(dāng)流動(dòng)相選用超純水時(shí)，雌激素的響應(yīng)不高。在水相中加入0.1%的氨水后，負(fù)離子采集模式下的雌激素的響應(yīng)值提高了2～3倍，同時(shí)保證了對(duì)孕激素和雄激素等目標(biāo)物的測定。因此，最終選擇0.1%氨水溶液-乙腈作為流動(dòng)相。在此條件下，24種內(nèi)分泌干擾物的峰形好、信號(hào)強(qiáng)、分離效果佳(圖1)。

圖1 24種內(nèi)分泌干擾物的提取離子色譜圖Fig.1 Extraction ion chromatograms of 24 endocrine disruptors chemicals

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

本文根據(jù)目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)中含有羥基和苯環(huán)的特點(diǎn)，采用了MCX混合型弱陽離子交換柱。這類經(jīng)羧基修飾的混合型弱陽離子吸附劑的苯環(huán)具有較強(qiáng)的疏水作用，羧基則提供了弱陽離子交換能力。對(duì)比pH=3和pH=5的水溶液的富集回收效果，結(jié)果(圖2)表明：用pH=5的水溶液進(jìn)行富集時(shí)，大多數(shù)目標(biāo)化合物的富集回收率在50%～90%之間；用pH=3的水溶液進(jìn)行富集時(shí)，富集回收率大多在10%～80%之間。

圖2 不同pH洗脫液的各物質(zhì)回收率Fig.2 The recoveries of eluentswith different pH values

2.3 線性范圍、檢出限及定量限

將質(zhì)量濃度不同的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)和色譜條件進(jìn)行測定。以類固醇激素定量離子質(zhì)譜峰的面積為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。依據(jù)《環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則》(HJ 168—2020)開展方法檢出限驗(yàn)證。線性方程、決定系數(shù)、方法檢出限和線性范圍見表3。從表3可見，在對(duì)應(yīng)的濃度范圍內(nèi)，24種物質(zhì)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，決定系數(shù)R2均高于0.995，檢出限在0.05～2.00 ng/L之間。在現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中，羅洲飛等[24]建立了利用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定環(huán)境水樣中20種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的方法，其方法檢出限為0.04～0.51 ng/L；王曉燕等[17]采用分散液液微萃取-衍生化高效液相色譜-熒光檢測法測定了環(huán)境水樣中的4種酚類內(nèi)分泌干擾物，其方法的檢出限為0.9～1.6 ng/L。本研究所建方法對(duì)各內(nèi)分泌干擾物的檢出限與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中的檢出限處于同一量級(jí)或優(yōu)于現(xiàn)有水平，且線性范圍寬，檢出物質(zhì)類別較多，定量準(zhǔn)確度高，并通過正負(fù)離子切換掃描實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同性質(zhì)環(huán)境激素的同時(shí)測定，能更好地滿足地下水中多類內(nèi)分泌干擾物痕量分析的需要，具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。

表3 24種類固醇激素的線性范圍、線性方程、決定系數(shù)、檢出限Table 3 Linear range,linear equation,determination coefficient and limits of detection of 24 steroid hormones

2.4 方法準(zhǔn)確性

向1.0 L超純水中準(zhǔn)確加入24種目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，最終的濃度水平分別為2、5、50、100、500 ng/L，各平行制備3份，做加標(biāo)回收試驗(yàn)，考察本文所述方法的精密度和回收率。試驗(yàn)數(shù)據(jù)(表4)顯示，24種目標(biāo)物的平均回收率為68.8%～108%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.99%～9.80%之間，表明該方法的準(zhǔn)確度高，能較好地滿足地下水中痕量類固醇雌激素和雄激素同時(shí)分析測定的需要。

表4 加標(biāo)地下水樣中目標(biāo)物的回收率、精密度Table 4 Recovery and precision of the target hormones in spiked water samples %

2.5 實(shí)際樣品分析

將本文建立的測定方法運(yùn)用于河北省8個(gè)地級(jí)市48個(gè)地下水樣品的內(nèi)分泌干擾物分析，結(jié)果顯示，48個(gè)樣品均有不同程度的內(nèi)分泌干擾物檢出。其中，E3、EE2、Pro、ADD、NDL在所有樣品中均未檢出，雌激素的檢出濃度在未檢出～17.19 ng/L之間，雄激素的檢出濃度在未檢出～40.42 ng/L之間。目標(biāo)激素中，E2和T的檢出率最高，兩者的檢出率、最大濃度分別為11.43%、17.19 ng/L和14.29%、3.03 ng/L。測定結(jié)果表明，該分析方法在實(shí)際地下水樣品的內(nèi)分泌干擾物測定方面具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究建立了一種可同時(shí)分析地下水中24種內(nèi)分泌干擾物含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。研究結(jié)果顯示,采用100 mm色譜柱進(jìn)行分離時(shí)的效果較好,使用pH=5的水溶液進(jìn)行富集回收時(shí)的效果更好。經(jīng)驗(yàn)證，本研究所建方法對(duì)24種物質(zhì)的平均回收率為68.8%～108%，RSD為0.99%～9.80%，線性相關(guān)系數(shù)均高于0.995，檢出限為0.05～2.00 ng/L。將本文建立的測定方法運(yùn)用于河北省8個(gè)地級(jí)市48個(gè)地下水樣品的內(nèi)分泌干擾物分析，結(jié)果顯示：在檢出的目標(biāo)物中，E2和T的檢出率最高，兩者的檢出率、最大濃度分別為11.43%、17.19 ng/L和14.29%、3.03 ng/L；E3、EE2、Pro、ADD、NDL在所有樣品中均未檢出。該方法靈敏度高、準(zhǔn)確度好，可為地下水中痕量內(nèi)分泌干擾物的測定提供一種快速、準(zhǔn)確、可靠的技術(shù)方法，具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。