胡正利，辛凱莉，劉少創(chuàng)，鐘誠(chéng)兵，武雪原，應(yīng)佚倫,2，孔璇鳳，余曉冬，張劍榮，龍億濤,＊

1南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，生命分析化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023

2南京大學(xué)化學(xué)和生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，南京 210023

3南京大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518057

實(shí)驗(yàn)教學(xué)是化學(xué)學(xué)科培養(yǎng)學(xué)生專(zhuān)業(yè)學(xué)習(xí)和實(shí)踐能力的重要組成部分，有助于學(xué)生在提升實(shí)驗(yàn)操作技能的同時(shí)加深對(duì)相關(guān)基礎(chǔ)理論知識(shí)的理解以及科學(xué)應(yīng)用?！翱平倘诤稀钡慕虒W(xué)改革模式注重將前沿科研成果轉(zhuǎn)化為特色教學(xué)內(nèi)容，并融入大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)課堂。科研與教學(xué)相輔相成，能夠增強(qiáng)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和發(fā)掘?qū)W生的科研潛力，是新時(shí)代“推動(dòng)科研反哺教學(xué)”和推進(jìn)創(chuàng)新型專(zhuān)業(yè)人才培養(yǎng)的有效途徑[1,2]。單分子科學(xué)致力于通過(guò)分子個(gè)體異質(zhì)性測(cè)量研究在分子層面上揭示生物、化學(xué)基本作用原理和反應(yīng)機(jī)制，已逐漸發(fā)展成為生物、化學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域的熱點(diǎn)前沿[3-7]。然而，目前國(guó)內(nèi)分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容多為針對(duì)大量分子群體行為的測(cè)量，很少涉及單分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)。因此，填補(bǔ)單分子技術(shù)在本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)上的空白，具有重要的教學(xué)意義。目前，單分子測(cè)量技術(shù)引入實(shí)驗(yàn)教學(xué)的主要困難在于缺少成本低、便攜式的教學(xué)儀器設(shè)備以及適配的教學(xué)方案。

生物納米孔道技術(shù)是一種利用單分子電流信號(hào)的差異進(jìn)行待測(cè)物區(qū)分和分子間相互作用研究的單分子分析方法，具有操作簡(jiǎn)單、高靈敏、高分辨、無(wú)需標(biāo)記等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是最具潛力的第三代單分子測(cè)序技術(shù)之一[8,9]。1996年，α-溶血素(α-Hemolysin)生物納米孔道被用于DNA單分子檢測(cè)[10]，自此以來(lái)，生物納米孔道技術(shù)已經(jīng)在核酸測(cè)序[11]、DNA損傷檢測(cè)[12,13]、蛋白質(zhì)測(cè)序[14-17]與構(gòu)象解析[18-20]以及單分子反應(yīng)監(jiān)測(cè)[21-24]等方面取得了重要進(jìn)展。經(jīng)過(guò)不斷優(yōu)化迭代，便攜式電化學(xué)微弱電流測(cè)量?jī)x器及配套的數(shù)據(jù)軟件性能也日益完善，確保了本實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛟谟邢薜慕虒W(xué)空間和教學(xué)時(shí)間內(nèi)順利完成。例如，筆者課題組自主研發(fā)了Cube電化學(xué)測(cè)量?jī)x器及SmartNanopore系列數(shù)據(jù)記錄軟件[25-28]，儀器主要包括集成化信號(hào)處理主機(jī)以及裝配有前置電流放大器探頭的法拉第屏蔽箱，兩者尺寸分別僅為12 cm × 12 cm × 8 cm和7.5 cm × 5.5 cm × 12.5 cm，法拉第屏蔽箱可極大地消除周?chē)h(huán)境的電磁噪音干擾，使其能夠在常規(guī)實(shí)驗(yàn)教室進(jìn)行納米孔道實(shí)驗(yàn)教學(xué)；自主開(kāi)發(fā)了PyNanoLab數(shù)據(jù)處理軟件(https://www.pynanolab.com/)，能夠?qū)崿F(xiàn)從原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入到結(jié)果圖表繪制的全過(guò)程、快速處理分析，大大縮短了納米孔道實(shí)驗(yàn)教學(xué)所需的時(shí)間，可以充分滿足實(shí)驗(yàn)教學(xué)需求。因此，筆者團(tuán)隊(duì)在多年從事納米孔道單分子研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了利用生物納米孔道電化學(xué)技術(shù)測(cè)量單個(gè)生物分子的綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)，主要包括課前基礎(chǔ)知識(shí)講解、儀器和實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)、學(xué)生自主實(shí)驗(yàn)以及頭腦風(fēng)暴環(huán)節(jié)四部分內(nèi)容，旨在以興趣為導(dǎo)向，激勵(lì)學(xué)生主動(dòng)學(xué)習(xí)、自由討論和自主創(chuàng)新。該實(shí)驗(yàn)以氣單胞菌溶素(Aerolysin)生物納米孔道檢測(cè)單個(gè)生物分子為實(shí)驗(yàn)范例，于2019年依托南京大學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心開(kāi)設(shè)試行，并根據(jù)教學(xué)實(shí)踐不斷改進(jìn)和完善，獲得了良好的教學(xué)效果[29]。由于單分子檢測(cè)靈敏度和分辨率主要取決于生物納米孔道測(cè)量界面的物理化學(xué)性質(zhì)[30-35]，本實(shí)驗(yàn)選擇使用突變型T232K/K238Q Aerolysin生物納米孔道檢測(cè)多肽磷酸化，模型分子是Tau蛋白微管結(jié)合區(qū)域的多肽片段，Tau蛋白磷酸化與多種神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茲海默癥)相關(guān)。隨著納米孔道單分子DNA測(cè)序的基本實(shí)現(xiàn)，近年來(lái)，準(zhǔn)確還原蛋白質(zhì)“原貌”，實(shí)現(xiàn)多肽/蛋白質(zhì)測(cè)序及其翻譯后修飾檢測(cè)逐漸成為生物納米孔道研究熱點(diǎn)，但是要真正達(dá)到實(shí)際應(yīng)用的目的仍有諸多問(wèn)題需要解決[36,37]。因此，本實(shí)驗(yàn)兼具綜合性和前沿性，能夠很好地展現(xiàn)納米孔道單分子技術(shù)和前沿科學(xué)研究的魅力，較好地達(dá)到培養(yǎng)學(xué)生的科研興趣、團(tuán)隊(duì)合作和科學(xué)素養(yǎng)的教學(xué)目的。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

(1) 了解納米孔道電化學(xué)單分子檢測(cè)的原理和方法；

(2) 掌握磷脂雙分子層和蛋白納米孔道的制備技術(shù)；

(3) 熟悉微弱電化學(xué)信號(hào)測(cè)量系統(tǒng)的使用要點(diǎn)；

(4) 熟悉單分子微弱電流信號(hào)的數(shù)據(jù)處理；

(5) 通過(guò)單分子多肽磷酸化檢測(cè)研究，培養(yǎng)學(xué)生的科研思維和解決問(wèn)題的能力。

2 實(shí)驗(yàn)原理

本實(shí)驗(yàn)采用的生物納米孔道技術(shù)是一種通過(guò)解析單個(gè)分子引起的孔道內(nèi)離子電流的特征性變化，在單分子水平上獲取待測(cè)物信息的檢測(cè)方法。如圖1所示，該方法的關(guān)鍵步驟是在垂直伸展的雙分子層磷脂膜上自組裝形成單個(gè)Aerolysin生物納米孔道，該孔道作為唯一通道執(zhí)行孔道兩側(cè)溶液中的分子離子轉(zhuǎn)運(yùn)[38,39]。實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要在檢測(cè)池兩個(gè)腔室內(nèi)分別灌注500 μL的1.0 mol·L?1的Tris-KCl溶液，隨后加入待測(cè)多肽，在電壓驅(qū)動(dòng)下多肽分子逐一通過(guò)單個(gè)Aerolysin納米孔道，改變流經(jīng)孔道限域空間的離子流，產(chǎn)生皮安培級(jí)、(亞)毫秒級(jí)的單分子離子電流阻斷信號(hào)。不同多肽分子由于其電荷、分子量、構(gòu)象等存在差異，導(dǎo)致其在通過(guò)納米孔道時(shí)將產(chǎn)生不同的特征離子電流信號(hào)，通過(guò)分析這些單分子信號(hào)的形狀、電流幅值和阻斷時(shí)間等特征，即可實(shí)現(xiàn)單分子多肽的區(qū)分。

圖1 突變型T232K/K238Q Aerolysin生物納米孔道檢測(cè)Tau多肽磷酸化的原理示意圖

在測(cè)量微弱電流過(guò)程中，環(huán)境電磁及儀器中存在的噪音會(huì)影響電流信號(hào)，從而導(dǎo)致較微弱的單分子信號(hào)被埋沒(méi)在噪音中。因此，本實(shí)驗(yàn)中選用了課題組研發(fā)的Cube 3.0納米孔道儀器裝置，使用法拉第屏蔽箱進(jìn)行噪音屏蔽、采用電阻反饋式的微弱電流放大系統(tǒng)來(lái)記錄并采集電流信號(hào)。

3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

3.1 實(shí)驗(yàn)試劑

1,2-二植烷?；字?DPhPC)購(gòu)自Avanti Polar Lipids Inc.試劑公司；正癸烷(無(wú)水，≥ 99%)、氯化鉀(≥ 99.5%)和胰蛋白酶均購(gòu)自Sigma-Aldrich試劑公司；乙二胺四乙酸(EDTA，99.995%)、三羥甲基氨基甲烷(Tris，≥ 99.9%)和異丙醇(≥ 99.7%)均購(gòu)自阿拉丁試劑公司；濃鹽酸(36.0%-38.0%)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。待測(cè)多肽由南京金斯瑞生物科技有限公司合成純化(圖2)，未修飾多肽序列為N’-VQIVYKPVDLS-C’ (Tau306-316)，磷酸化多肽序列為N’-VQIVYKPVDLpS-C’ (pTau306-316)，使用電解液作為溶劑現(xiàn)配現(xiàn)用，濃度為1.0 mmol·L?1。T232K/K238Q Aerolysin蛋白溶液(1.5 μg·mL?1)由筆者課題組制備提供。如沒(méi)有特殊說(shuō)明，所有購(gòu)買(mǎi)試劑均為分析純并且使用時(shí)未經(jīng)過(guò)進(jìn)一步純化。實(shí)驗(yàn)用超純水由美國(guó)Millipore公司的Milli-Q純水儀制備得到，所有實(shí)驗(yàn)溶液均用超純水(25 °C時(shí)電阻率為18.2 MΩ·cm?1)配制。

圖2 多肽質(zhì)譜表征圖

為節(jié)約教學(xué)時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)需要用到的30 mg·mL?1磷脂正癸烷溶液、1%的正十六烷-正己烷溶液、1.0 mol·L?1Tris-KCl電解質(zhì)溶液(pH 8.0)均由助教提前準(zhǔn)備。本文所有實(shí)驗(yàn)均在室溫(25 ± 2 °C)條件下完成。

3.2 實(shí)驗(yàn)儀器

銀/氯化銀電極；納米孔道檢測(cè)池，由聚四氟乙烯薄膜隔開(kāi)的兩個(gè)腔室組成，薄膜中間有一個(gè)直徑為50 μm左右的圓形微孔；Cube 3.0納米孔道電化學(xué)測(cè)量?jī)x器，包括配套的SmartNanopore數(shù)據(jù)記錄軟件；PyNanoLab數(shù)據(jù)處理軟件為筆者所在實(shí)驗(yàn)室研制。根據(jù)教學(xué)需要，上述儀器裝置筆者課題組均可提供。

4 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

4.1 儀器參數(shù)設(shè)置

(1) 分別使用音頻線連接Cube 3.0儀器主機(jī)與電流放大器探頭、USB數(shù)據(jù)線連接Cube 3.0儀器主機(jī)與電腦，打開(kāi)電流放大器探頭供電電池開(kāi)關(guān)；

(2) 依次開(kāi)啟Cube 3.0儀器及SmartNanopore軟件，單擊軟件左上角的“Connect to Device (連接設(shè)備)”連接儀器與軟件，單擊軟件左上角電池圖標(biāo)連接儀器主機(jī)與電流放大器探頭(圖3)；

圖3 Cube儀器裝置圖與SmartNanopore數(shù)據(jù)記錄軟件界面

(3) 設(shè)置儀器實(shí)驗(yàn)參數(shù)，具體如下：Format(模式)為V2，Sampling Rate (采樣頻率)為100 kHz，Bessel Filter (貝塞爾濾波)為5 kHz，Gain (增益)為?1；

(4) 單擊軟件面板左上第一個(gè)“Conf. (設(shè)置)”，依次設(shè)置“Rec. Path (數(shù)據(jù)保存路徑)”“File name(文件名稱)”并勾選“AutoNum (自動(dòng)編號(hào))”，如文件名設(shè)為211027，該次實(shí)驗(yàn)記錄的第一個(gè)和第二個(gè)數(shù)據(jù)文件會(huì)依次自動(dòng)保存為211027000.dat和211027001.dat；

(5) 單擊“Data Acq. (數(shù)據(jù)獲取)”窗口的“Start (開(kāi)始)”，運(yùn)行程序。將“Volt. Command (電壓命令)”窗口的電壓值設(shè)為0 mV，單擊“auto (自動(dòng))”，將電壓自動(dòng)校準(zhǔn)至0 mV，可從CH2窗口的右上方實(shí)時(shí)讀取電壓值；

(6) 電壓校準(zhǔn)完成后，在“Data Acq. (數(shù)據(jù)獲取)”窗口，單擊“auto (自動(dòng))”，將電流自動(dòng)校準(zhǔn)至0 pA，可從CH1窗口的右上方實(shí)時(shí)讀取電流值和RMS值(基線噪音的均方根值)，一般情況下RMS值應(yīng)小于1 pA。

4.2 磷脂雙分子層膜的制備與表征

(1) 使用移液器抽取少量(1.0-2.0 μL)正十六烷-正己烷溶液，移液器吸頭貼近檢測(cè)池的聚四氟乙烯薄膜，將烷烴溶液輕輕旋涂在薄膜兩側(cè)微孔附近，隨后靜置10-15分鐘，使正己烷充分揮發(fā)；

(2) 檢測(cè)池放入法拉第屏蔽箱內(nèi)，分別向池子兩個(gè)腔室加入500 μL的Tris-KCl電解質(zhì)溶液，并將一對(duì)Ag/AgCl電極的一端分別浸入檢測(cè)池兩側(cè)的電解質(zhì)溶液中，另一端與放大器探頭相連，指定cis端電極接地。此時(shí)，檢測(cè)池兩側(cè)的電解質(zhì)溶液通過(guò)薄膜上的微孔連通，軟件面板顯示電流為溢出狀態(tài)；

(3) 電壓設(shè)置為0 mV，分別在檢測(cè)池兩個(gè)腔室液面上方附近懸空滴加2.0 μL的磷脂溶液，靜置3-5分鐘，等待磷脂分子分散平鋪在氣液界面；

(4) 電壓調(diào)整為+100 mV，用1 mL注射器緩慢地上下提拉cis或trans腔室中的電解質(zhì)溶液，磷脂分子在檢測(cè)池微孔處聚集形成穩(wěn)定的磷脂雙分子層膜，此時(shí)電流顯示為0 pA；

(5) 調(diào)整電壓，若在+300 - +400 mV范圍內(nèi)電流溢出，則說(shuō)明磷脂膜破裂；應(yīng)立刻重新提拉溶液成膜，在此情況下大多數(shù)新成的膜是強(qiáng)度合適的雙分子層磷脂膜，可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

4.3 AeroIysin生物納米孔道的構(gòu)建與表征

(1) 電壓調(diào)整為+200 mV，向薄膜cis側(cè)靠近微孔處的溶液中緩慢加入1.0 μL的T232K/K238Q Aerolysin蛋白溶液，等待3-5分鐘，若觀察到離子電流突然從0 pA階躍至約110 pA，表明磷脂膜上自組裝形成了單個(gè)T232K/K238Q Aerolysin納米孔道，迅速調(diào)整電壓為+100 mV以防形成多孔；

(2) 單擊“REC. (記錄)”，從0 mV到+160 mV以及0 mV到?160 mV，每隔10 mV記錄10-15秒數(shù)據(jù)，再次單擊“REC. (記錄)”完成記錄，用于后續(xù)I-V表征孔道；

(3) 電壓調(diào)整為+100 mV，記錄2分鐘，同上，分別在+80 mV、+90 mV、+110 mV和+120 mV記錄2分鐘，用做后續(xù)空白對(duì)照。

4.4 未修飾與磷酸化Tau多肽的檢測(cè)識(shí)別

(1) 電壓調(diào)整為+100 mV，向薄膜cis側(cè)溶液中緩慢加入15.0 μL的Tau306-316或pTau306-316多肽溶液，在+80到+120 mV范圍內(nèi)，每隔10 mV分別記錄3-5分鐘，確保每個(gè)電壓下單分子事件數(shù)量在1000以上；

(2) 電壓調(diào)整為+100 mV，向薄膜cis側(cè)溶液中緩慢加入15.0 μL的pTau306-316多肽溶液，同上述步驟相同，獲得足夠的單分子事件；

(3) 結(jié)束后，依次關(guān)閉軟件和斷開(kāi)儀器；

(4) 取出檢測(cè)池并將溶液轉(zhuǎn)移至專(zhuān)用廢液缸，無(wú)需拆分，直接依次使用超純水、異丙醇和超純水沖洗檢測(cè)池兩個(gè)腔室，洗好吹干后置于自封袋內(nèi)妥善保存；

(5) 參照上述4.1-4.4步驟，重復(fù)實(shí)驗(yàn)兩次。

4.5 納米孔道單分子多肽數(shù)據(jù)處理與分析

(1) 讀取不同電壓下的電流數(shù)值，繪制I-V曲線并計(jì)算電導(dǎo)，表征納米孔道的性質(zhì)；

(2) 打開(kāi)PyNanoLab軟件(圖4)，導(dǎo)入原始數(shù)據(jù)并設(shè)置相應(yīng)參數(shù)，自動(dòng)逐個(gè)識(shí)別并提取單分子事件的殘余電流(Current或I)、阻斷電流(ΔI)、殘余電流程度(I/I0)、阻斷時(shí)間(toff或tD)等信息和相關(guān)統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖表，包括阻斷電流、阻斷時(shí)間、間隔時(shí)間的直方圖以及阻斷電流-阻斷時(shí)間散點(diǎn)圖等；

圖4 PyNanoLab軟件數(shù)據(jù)處理界面

(3) 根據(jù)直方圖的高斯或指數(shù)擬合結(jié)果，獲取各相應(yīng)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)平均值，誤差為三次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，繪制阻斷時(shí)間與電壓的關(guān)系圖。

本實(shí)驗(yàn)中，分別定義：開(kāi)孔電流(I0)為孔道內(nèi)無(wú)分子時(shí)的基線電流幅值；阻斷電流(ΔI)為單個(gè)分子在孔道內(nèi)時(shí)造成的電流變化；殘余電流(I)為開(kāi)孔電流與阻斷電流的差值；殘余電流程度(I/I0)為殘余電流與開(kāi)孔電流的比值；阻斷時(shí)間(toff或tD)為單分子阻斷事件的持續(xù)時(shí)間。

5 結(jié)果與討論

5.1 單個(gè)生物納米孔道的I-V表征

如圖5所示，T232K/K238Q Aerolysin納米孔道表現(xiàn)出非對(duì)稱I-V曲線，表明由于非對(duì)稱孔道結(jié)構(gòu)以及非均勻分布的孔道測(cè)量界面電荷，導(dǎo)致納米孔道對(duì)正負(fù)離子的選擇性輸運(yùn)差異，從而出現(xiàn)整流現(xiàn)象。計(jì)算可得，在+100 mV和?100 mV時(shí)，T232K/K238Q Aerolysin納米孔道整流比R= |I+|/|I?|為1.70 ± 0.08。在0到+160 mV范圍內(nèi)，計(jì)算獲得相應(yīng)的孔道電導(dǎo)G=I/V為0.58 ± 0.02 nS。

圖5 突變型T232K/K238Q Aerolysin生物納米孔道的I-V曲線

5.2 單分子多肽阻斷電流與阻斷時(shí)間分析

使用T232K/K238Q Aerolysin納米孔道分別檢測(cè)pTau306-316和Tau306-316多肽，實(shí)時(shí)記錄單分子電流響應(yīng)，可以觀察到pTau306-316單分子特征事件的阻斷時(shí)間(toff)明顯大于Tau306-316 (圖6a)。如圖6b所示，使用一組對(duì)應(yīng)的(I/I0，log(toff))描述每一個(gè)單分子事件，根據(jù)橫縱坐標(biāo)范圍按照100 × 100劃分區(qū)域，統(tǒng)計(jì)落在每個(gè)區(qū)域內(nèi)的單分子事件個(gè)數(shù)作為Counts，據(jù)此對(duì)整幅圖填充相應(yīng)的顏色，得到log(toff)-I/I0的二維(2D)直方圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pTau306-316單分子事件主要分布在P1和P2兩個(gè)區(qū)域范圍內(nèi)，P2區(qū)域事件的阻斷時(shí)間較長(zhǎng)且單分子事件的殘余電流程度(I/I0)分布集中；而Tau306-316單分子事件主要分布在P1區(qū)域內(nèi)，阻斷時(shí)間大多在1 ms以下。進(jìn)一步，圖6c將I/I0按照橫坐標(biāo)0.0-1.0范圍等分為100個(gè)子區(qū)間，統(tǒng)計(jì)每個(gè)I/I0子區(qū)間內(nèi)的單分子事件數(shù)量作為縱坐標(biāo)Counts，得到100組(I/I0，Counts)，繪制I/I0的一維統(tǒng)計(jì)直方圖。分析可得，pTau306-316和Tau306-316的阻斷電流程度也存在一定的差異，pTau306-316單分子事件在P2區(qū)域的I/I0= 0.46 ± 0.01。由此可知，pTau306-316和Tau306-316兩種多肽在納米孔道內(nèi)的動(dòng)態(tài)行為具有顯著差異。推測(cè)是由于絲氨酸磷酸化增加了pTau306-316的帶電量，改變了其與T232K/K238Q Aerolysin納米孔道測(cè)量界面氨基酸殘基之間的靜電相互作用。

圖6 pTau306-316和Tau306-316多肽的阻斷電流信號(hào)特征圖(a)；log(toff)-I/I0 2D直方圖(b)和I/I0統(tǒng)計(jì)直方圖(c)

5.3 單分子多肽穿孔行為解析

為了探究單分子多肽的動(dòng)態(tài)行為與過(guò)孔機(jī)制，進(jìn)一步考察了pTau306-316和Tau306-316兩種多肽的阻斷時(shí)間與外加電壓的依賴關(guān)系。結(jié)果顯示，在80-120 mV范圍內(nèi)，隨著電壓的升高，pTau306-316的阻斷時(shí)間呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)(圖7a)，而Tau306-316的阻斷時(shí)間則基本不變(圖7b)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[40]，兩種多肽的動(dòng)態(tài)行為模式不同。負(fù)電性較強(qiáng)的pTau306-316所受外加電場(chǎng)的驅(qū)動(dòng)力更大，更容易被捕獲，隨后被捕獲的多肽向著孔道trans側(cè)前進(jìn)，直至受到較強(qiáng)阻力后被迫退出孔道，返回到cis側(cè)溶液中(圖7c)。與pTau306-316 (pI = 3.84)不同，Tau306-316 (pI = 5.82)在pH 8.0條件下基本不帶電[31]，在cis側(cè)與孔道碰撞之后，幾乎不進(jìn)入孔道，更傾向于繼續(xù)在溶液中隨機(jī)運(yùn)動(dòng)，故其阻斷時(shí)間隨電壓無(wú)明顯變化(圖7d)，產(chǎn)生了單個(gè)分子在孔口的碰撞信號(hào)。因此，通過(guò)納米孔道單分子實(shí)驗(yàn)，不僅可以得到單分子水平的阻斷電流和阻斷時(shí)間特征等，還能夠獲得單個(gè)分子的動(dòng)態(tài)行為信息，這與整體測(cè)量方法(如質(zhì)譜)相比，能夠幫助學(xué)生們更好地理解分子個(gè)體的異質(zhì)性并激發(fā)他們探索微觀世界的熱情。

圖7 兩種多肽的阻斷時(shí)間-電壓依賴性關(guān)系圖和動(dòng)態(tài)行為解析示意圖

5.4 多肽混合樣品的納米孔道單分子檢測(cè)

依次添加Tau306-316、pTau306-316兩種多肽，實(shí)時(shí)監(jiān)控T232K/K238Q Aerolysin納米孔道的電流響應(yīng)變化。如圖8所示，在添加多肽樣品前，記錄得到的開(kāi)孔電流基線幾乎無(wú)背景信號(hào)；當(dāng)加入Tau306-316時(shí)，觀察到了阻斷時(shí)間很短的脈沖型的單分子電流阻斷信號(hào)；緊接著加入pTau306-316，出現(xiàn)了阻斷時(shí)間較長(zhǎng)、阻斷電流幅值比較均一的臺(tái)階型的單分子特征信號(hào)，這與單一樣品檢測(cè)結(jié)果一致。綜上，T232K/K238Q Aerolysin納米孔道能夠用于多肽磷酸化的單分子測(cè)量，通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化孔道界面與待測(cè)物分子的相互作用特性，未來(lái)有望實(shí)現(xiàn)多種多肽/蛋白質(zhì)翻譯后修飾的同時(shí)識(shí)別。納米孔道單分子檢測(cè)研究通常使用特征事件頻率來(lái)定量表征待測(cè)物濃度，由于課堂時(shí)間有限，綜合考慮實(shí)驗(yàn)教學(xué)目的以及教學(xué)量，將分析物定量檢測(cè)內(nèi)容作為拓展實(shí)驗(yàn)部分，布置給感興趣的學(xué)生課堂外進(jìn)一步思考和探索。

圖8 T232K/K238Q Aerolysin納米孔道實(shí)時(shí)檢測(cè)多肽混合物

6 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

(1) 添加磷脂溶液時(shí)，移液器的吸頭不要伸入檢測(cè)池液面以下；

(2) 溶液提拉速度會(huì)影響磷脂成膜質(zhì)量，應(yīng)緩慢提起并慢慢放掉溶液；

(3) 檢測(cè)池中磷脂溶液的濃度會(huì)影響磷脂膜的厚度，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體情況，適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)磷脂溶液的添加量；

(4) 電壓過(guò)高容易導(dǎo)致出現(xiàn)多個(gè)生物納米孔道，當(dāng)形成單個(gè)孔道后，應(yīng)立即將電壓降低至100 mV以下；

(5) 孔道蛋白活性影響成孔難易程度，由于不同批次蛋白的活性可能存在差異，可通過(guò)調(diào)節(jié)添加蛋白的濃度或體積，確保磷脂膜上僅形成單個(gè)生物納米孔道；

(6) 清洗檢測(cè)池時(shí)，提醒學(xué)生戴好口罩、手套及護(hù)目鏡。

7 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與組織運(yùn)行方式

本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括儀器操作、磷脂膜制備、納米孔道構(gòu)建、數(shù)據(jù)處理分析等，重點(diǎn)和難點(diǎn)是在平面的雙分子層磷脂膜上構(gòu)建單個(gè)生物納米孔道。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)長(zhǎng)為每周5學(xué)時(shí)，共4周。依據(jù)教學(xué)要求和教學(xué)目標(biāo)，精心設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，共分為4部分，通過(guò)4個(gè)階段完成實(shí)驗(yàn)，具體如下：

(1) 第1周，介紹納米孔道技術(shù)原理及研究進(jìn)展，使學(xué)生系統(tǒng)性地了解納米孔道技術(shù)的發(fā)展歷程與應(yīng)用前景，調(diào)動(dòng)學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情，啟發(fā)學(xué)生查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，探究納米孔道電化學(xué)領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)與機(jī)遇，培養(yǎng)學(xué)生發(fā)現(xiàn)問(wèn)題與解決問(wèn)題的能力；

(2) 第2周，講解并演示納米孔道電化學(xué)測(cè)量?jī)x器操作與單分子實(shí)驗(yàn)方法。結(jié)合教學(xué)視頻幫助學(xué)生了解整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，指導(dǎo)學(xué)生認(rèn)真學(xué)習(xí)從儀器設(shè)置到磷脂膜制備、孔道構(gòu)建以及單分子檢測(cè)等每一步實(shí)驗(yàn)操作，幫助學(xué)生在實(shí)驗(yàn)實(shí)踐過(guò)程中加深對(duì)相關(guān)基礎(chǔ)理論知識(shí)的理解和運(yùn)用；

(3) 第3周，學(xué)生分組協(xié)作獨(dú)立完成生物納米孔道單分子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)并學(xué)習(xí)數(shù)據(jù)處理。學(xué)生分工合作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，幫助學(xué)生提取解析單分子數(shù)據(jù)的電流、時(shí)間特征，并與質(zhì)譜手段等獲取的溶液中大量分子的平均測(cè)量結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，在單分子水平上更好地理解分子的動(dòng)態(tài)行為，培養(yǎng)學(xué)生團(tuán)隊(duì)合作意識(shí)并充分調(diào)動(dòng)學(xué)生自主學(xué)習(xí)的積極性；

(4) 第4周，頭腦風(fēng)暴與自由討論。鼓勵(lì)學(xué)生大膽提出實(shí)驗(yàn)設(shè)想并分享對(duì)“納米孔道電化學(xué)”的新認(rèn)知，通過(guò)“模擬科研”的方式，發(fā)掘?qū)W生的科研潛能并培養(yǎng)其創(chuàng)新思維，旨在建立實(shí)驗(yàn)教學(xué)與科學(xué)研究之間的聯(lián)系，為學(xué)生今后的專(zhuān)業(yè)課學(xué)習(xí)和科研工作打下基礎(chǔ)。

該實(shí)驗(yàn)課程適用于小班教學(xué)，每次面向10-15名本科生授課，按照學(xué)號(hào)排序，每2-3名學(xué)生組建成1個(gè)實(shí)驗(yàn)小組，教師及助教引導(dǎo)學(xué)生合理分工，合作完成實(shí)驗(yàn)課程的全部?jī)?nèi)容。為了全面考查學(xué)生的學(xué)習(xí)情況和動(dòng)手、思考、交流以及團(tuán)隊(duì)合作能力等，課程考核以小組為單位，內(nèi)容涵蓋綜述論文、實(shí)驗(yàn)操作、實(shí)驗(yàn)報(bào)告和小組匯報(bào)4個(gè)部分，通過(guò)評(píng)估每位學(xué)生在論文寫(xiě)作、實(shí)驗(yàn)實(shí)踐、結(jié)果分析與PPT匯報(bào)等方面的課堂整體表現(xiàn)，制定最終成績(jī)，其中科研綜述論文撰寫(xiě)占比20%，實(shí)驗(yàn)操作占比20%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)報(bào)告占比30%，研究方案設(shè)計(jì)與分組匯報(bào)占比30%。在往期實(shí)驗(yàn)課程中，> 90%的學(xué)生小組都能夠完成實(shí)驗(yàn)并收集到課程要求的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，學(xué)生在實(shí)驗(yàn)中善于發(fā)現(xiàn)與解決問(wèn)題，結(jié)合實(shí)驗(yàn)實(shí)踐在頭腦風(fēng)暴與自由討論階段大膽提出進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)設(shè)想，包括基于生物納米孔道的核苷類(lèi)藥物代謝反應(yīng)監(jiān)測(cè)、單分子多肽/蛋白質(zhì)構(gòu)象研究以及納米孔道光電檢測(cè)等[29]。根據(jù)學(xué)生反饋意見(jiàn)以及科研進(jìn)展情況，教學(xué)團(tuán)隊(duì)及時(shí)總結(jié)分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)中遇到的問(wèn)題，綜合考慮實(shí)驗(yàn)難度和課程前沿性，改善和優(yōu)化教學(xué)方案。近幾年，單分子多肽/蛋白質(zhì)檢測(cè)和測(cè)序逐漸成為納米孔道電化學(xué)領(lǐng)域的研究前沿，教學(xué)團(tuán)隊(duì)將這一熱點(diǎn)融入到實(shí)驗(yàn)教學(xué)，設(shè)計(jì)了“生物納米孔道檢測(cè)單分子多肽磷酸化”的實(shí)驗(yàn)教學(xué)方案。在前期教學(xué)團(tuán)隊(duì)課題組本科學(xué)生中的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)表明，本科二年級(jí)和四年級(jí)學(xué)生以及研究生新生均能很快獨(dú)立完成生物納米孔道檢測(cè)多肽的實(shí)驗(yàn)，表明該實(shí)驗(yàn)具有高度的可行性，對(duì)于不同院校根據(jù)自身研究特色制定合適教學(xué)方案具有重要的參考意義。

8 結(jié)語(yǔ)

在當(dāng)今的后基因組時(shí)代，納米孔道電化學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)逐漸發(fā)展為單分子多肽/蛋白質(zhì)的檢測(cè)和測(cè)序，磷酸化、乙酰化、甲基化等蛋白質(zhì)翻譯后修飾是其重要研究?jī)?nèi)容。筆者在制定實(shí)驗(yàn)方案時(shí)，將興趣為導(dǎo)向、學(xué)生為中心作為指導(dǎo)思想，綜合考慮了實(shí)驗(yàn)的可操作性、創(chuàng)新性以及學(xué)生的適應(yīng)性和接受度，確保實(shí)驗(yàn)具有適度的挑戰(zhàn)性，能夠增強(qiáng)學(xué)生的學(xué)習(xí)信心和科研熱情，充分發(fā)揮“科教融合”對(duì)教學(xué)改革和高素質(zhì)人才培養(yǎng)的重要促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)利用突變型T232K/K238Q Aerolysin生物納米孔道檢測(cè)多肽磷酸化，研究對(duì)象為絲氨酸磷酸化的Tau多肽，其與阿爾茲海默癥等多種退行性疾病相關(guān)。由于磷酸化增加了絲氨酸的負(fù)電性并改變了其體積，突變型T232K/K238Q Aerolysin納米孔道232位點(diǎn)正電荷的增加可增強(qiáng)靜電相互作用，而238位點(diǎn)谷氨酰胺的引入則增加了分子過(guò)孔能壘，因此，能夠很好地應(yīng)對(duì)因多肽過(guò)孔速度太快而難以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確測(cè)量的難題。本實(shí)驗(yàn)原理簡(jiǎn)單、現(xiàn)象明確，便于學(xué)生理解和掌握，具有較強(qiáng)的可設(shè)計(jì)性和推廣價(jià)值，不局限于多肽磷酸化檢測(cè)，允許拓展DNA損傷識(shí)別、蛋白構(gòu)象研究、生物標(biāo)志物檢測(cè)、離子選擇性測(cè)量等內(nèi)容[41-47]。此外，MinION、Orbit Mini、eONE等商品化儀器設(shè)備以及α-Hemolysin等商業(yè)化孔道蛋白也可應(yīng)用于納米孔道實(shí)驗(yàn)教學(xué)，不同院?？筛鶕?jù)具體情況選擇合適的教學(xué)方案。在前期教學(xué)過(guò)程中，很多學(xué)生表示這是第一次接觸單分子實(shí)驗(yàn)，希望以后有機(jī)會(huì)能夠參與相關(guān)課題研究，進(jìn)一步了解納米孔道電化學(xué)及其交叉領(lǐng)域前沿進(jìn)展。這充分表明了將具有重大應(yīng)用前景的科學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)化為本科教學(xué)內(nèi)容，實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)與前沿研究并軌，對(duì)于培養(yǎng)學(xué)生的綜合創(chuàng)新能力和推動(dòng)“全面的化學(xué)教育”具有重要教學(xué)意義。

致謝：感謝研究生牛紅艷和霍明珠的助教工作、張琳琳對(duì)納米孔道儀器的調(diào)試和維護(hù)，以及本科學(xué)生劉宇航、儲(chǔ)文浩參與突變型生物納米孔道的實(shí)驗(yàn)。