趙 芳，李文竹，潘堅揚，楊嘉譽，瞿海斌*

基于1H-NMR指紋圖譜分區(qū)相似度的丹參注射劑質(zhì)量評價方法

趙 芳1, 2, 3，李文竹1, 2，潘堅揚1, 2，楊嘉譽1, 2，瞿海斌1, 2*

1. 浙江大學(xué)藥學(xué)院，藥物信息學(xué)研究所，浙江 杭州 310058 2. 組分中藥國家重點實驗室浙江大學(xué)交叉創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310058 3. 海正生物制藥有限公司，浙江 杭州 311400

以丹參注射液為研究對象，建立基于1H-NMR指紋圖譜分區(qū)相似度的質(zhì)量一致性評價方法。采集81批丹參注射液的1H-NMR光譜，根據(jù)代謝物信號的分布規(guī)律，將光譜分為氨基酸區(qū)、糖類區(qū)和酚酸區(qū)，分別計算各區(qū)光譜的夾角余弦與標(biāo)準(zhǔn)化歐氏距離2種相似度指標(biāo)，并評價丹參注射液批次質(zhì)量一致性的性能，并與基于全1H-NMR譜的相似度計算結(jié)果進行對比。不同批次丹參注射液間氨基酸、糖類及酚酸的組成均存在一定差異，其中氨基酸、糖類的批間差異較大；同時，歐式距離對成分的批間波動更為敏感。此外，基于全譜的相似度分析結(jié)果受糖區(qū)特征峰影響極大，對酚酸及氨基酸類成分的批間差異辨識能力較差?；?H-NMR光譜分區(qū)相似度計算法可以更好地辨識不同類別成分的批間波動，較全譜相似度計算法更適用于丹參注射液的一致性評價，為進一步提升中藥制劑的質(zhì)量一致性提供參考。

核磁共振氫譜；丹參注射液；質(zhì)量控制；質(zhì)量一致性；相似度分析；氨基酸；糖類；酚酸；丹參素；原兒茶醛；迷迭香酸；紫草酸；丹酚酸B；丹酚酸A

在中藥注射劑生產(chǎn)過程中，由于原料或輔料批次更換，以及工藝參數(shù)波動等原因，產(chǎn)品質(zhì)量會有不同程度的波動[1-2]。由于中藥化學(xué)成分繁多、結(jié)構(gòu)類型高度復(fù)雜，在治療疾病時具有多成分、多靶標(biāo)的特性，其功效取決于多種成分的共同作用[3]，況且中藥注射劑給藥方式的特殊性，因此，中藥注射劑質(zhì)量的全面表征與一致性評價是中藥質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)建立過程中的重點和難點，已成為制約其發(fā)展的瓶頸之一[4]。

目前，中藥注射劑質(zhì)量的批間一致性評價通常采用包括HPLC、GC等在內(nèi)的色譜技術(shù)或色譜聯(lián)用技術(shù)的定量分析及指紋圖譜分析法，通過定量、半定量或定性分析[5-6]，實現(xiàn)化學(xué)成分的表征與量化，在此基礎(chǔ)上進行質(zhì)量一致性評價。其中中藥指紋圖譜是中藥多成分質(zhì)量綜合分析及評價的重要手段[7-8]。在現(xiàn)階段中藥的有效成分大多數(shù)沒有明確的情況下，中藥指紋圖譜能夠有效地從整體上表征中藥的整體質(zhì)量，是基于中藥“多成分、多靶點”的作用特性建立的一種有效的中藥質(zhì)量控制方法[8]。

氫核磁共振（proton nuclear magnetic resonance，1H-NMR）指紋圖譜技術(shù)具有單一性、全面性、定量性和易分辨性等特點，適用于復(fù)雜混合物中各類有機物的定性定量分析[9-11]。1H-NMR指紋圖譜技術(shù)的顯著優(yōu)勢在于分析范圍廣，可同時對初級代謝產(chǎn)物（氨基酸、糖類等）與次級代謝產(chǎn)物（黃酮、酚酸、皂苷等藥用活性成分）進行高通量分析。目前基于1H-NMR指紋圖譜的中藥材及其制劑的質(zhì)量評價方法，一般通過對分析對象的1H-NMR全光譜進行相似度與空間距離計算[12-18]，或在1H-NMR光譜中選擇部分代謝物的特征信號并計算相似度[19]，以實現(xiàn)一致性評價的目的。然而這些計算方法未能充分利用1H-NMR光譜中反映的樣品化學(xué)信息。

本研究以丹參注射液為研究對象，考察其1H-NMR光譜中各類初生及次生代謝產(chǎn)物的特征信號及信號分布規(guī)律，研究基于丹參注射液1H-NMR光譜特征指紋圖譜的產(chǎn)品質(zhì)量一致性評價方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀，美國Agilent公司，配四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器、ChemStation工作站；Bruker Avance III 500型核磁共振光譜儀，德國Bruker公司，配24位自動進樣器及5 mm BBO探頭、Topspin工作站；Mettler AE 200型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；IKA VXR basic Vibrax?型光電控制式小型振蕩器，德國IKA公司；Eppendorf Multipette M4手動連續(xù)分液器，5424及5804R型離心儀，德國Eppendorf公司。

1.2 試藥

含有0.05% 3-(三甲基硅基)氘代丙酸鈉（TSP）的氘代水（D2O，99.9% D），美國Sigma-Aldrich公司。乙腈、甲醇，色譜純，德國Merck公司；甲酸，色譜純，美國ROE科技有限公司；乙酸，色譜純，美國ROE公司；對照品丹參素鈉（批號171027，質(zhì)量分數(shù)99.04%）、原兒茶醛（批號171126，質(zhì)量分數(shù)99.69%）、迷迭香酸（批號171009，質(zhì)量分數(shù)99.36%）、紫草酸（批號180107，質(zhì)量分數(shù)98.85%）、丹酚酸B（批號170924，質(zhì)量分數(shù)99.96%）、丹酚酸A（批號170920，質(zhì)量分數(shù)98.93%）均購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。

去離子水由Milli-Q Synthesis超純水機（美國Millipore公司）每日新制。

此外，生產(chǎn)日期2016年7月1日至2020年3月10日的81個不同批次的丹參注射液均為本實驗室收集的同一廠家的產(chǎn)品。81批丹參注射液中，批次1～19為過期批次，生產(chǎn)時間為2016年7月至2018年3月；批次20～62的生產(chǎn)時間為2019年3月至2019年8月；批次63～81的生產(chǎn)時間為2019年12月至2020年3月。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣本制備與核磁分析

準(zhǔn)確量取900 μL丹參注射液與100 μL含0.05% TSP的氘代水，混合均勻并在10 000 r/min下離心10 min，移取500 μL上清液置入5 mm標(biāo)準(zhǔn)核磁管，留待分析。

在預(yù)飽和水峰壓制的Noesygppr1d的脈沖序列下進行核磁分析，以溶劑90% H2O＋10% D2O鎖場，譜寬為12，中心頻率為4.695，弛豫時間為2 s，混合時間為50 ms，90°脈沖P1為14.75 μs，空掃次數(shù)為4，掃描次數(shù)為32，采集時間為2.726 s，接收器增益為114。

在Bruker Topspin（3.6.2版，美國Bruker Biospin Corporation）軟件中，對自由感應(yīng)衰減（free induction decay，F(xiàn)ID）信號進行傅里葉變換，窗函數(shù)線寬＝0.3 Hz，手動執(zhí)行相位校正并以TSP的特征信號作為內(nèi)部參考，將其化學(xué)位移設(shè)為0.00，作為化學(xué)位移漂移矯正的基準(zhǔn)，確保不同樣品光譜之間具有可比性。

2.2 光譜預(yù)處理

使用MestReNova（14.0.0版，西班牙Mestrelab Research）軟件對光譜在“Peak”模式下進行分箱（Binning）寬度為0.02的降維處理，處理后的光譜作為相似度計算的參考數(shù)據(jù)。分箱后，去除殘留水信號影響的光譜區(qū)域（4.5～5.0）及無信號的區(qū)域（0.0～0.5），原始光譜由32 768個數(shù)據(jù)點降維至513個數(shù)據(jù)點。在此基礎(chǔ)上，在Matlab中采用區(qū)間相關(guān)優(yōu)化平移算法（interval correlation optimised shifting algorithm，ICOSHIFT）[20-21]工具包對齊NMR光譜信號，消除不同批次丹參注射液NMR圖譜間的化學(xué)位移偏差。

2.3 光譜分區(qū)

中藥提取物的1H-NMR光譜按提取物中各類物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)的不同，可被劃分為低場區(qū)（主要為芳香族化合物信號，5.50～10.00）、中場區(qū)（主要為碳水化合物區(qū)信號，3.30～5.50）以及高場區(qū)（主要為小分子有機酸和氨基酸信號，0.05～3.30）。為充分利用光譜中的信息，并全面表征樣品的化學(xué)信息，本研究將丹參注射液的1H-NMR光譜按高、中、低場進行分區(qū)計算，標(biāo)記為1、2、3區(qū)（M1、M2、M3），分別反映注射液中的氨基酸、糖類及丹參酚酸類的成分信息，如圖1所示。

2.4 相似度計算

2.4.1 相似度計算方法 本研究使用標(biāo)準(zhǔn)化歐氏距離與余弦相似度作為丹參注射液1H-NMR光譜指紋圖譜的相似性計算方法[22]。相似度計算由Matlab軟件（版本2019a，美國Mathworks公司）完成。為使標(biāo)準(zhǔn)化歐式距離這一指標(biāo)與余弦相識度量綱一致，便于后續(xù)統(tǒng)一考察，本研究使用“相對歐氏距離”。樣品的1H-NMR光譜的相對歐氏距離DE的計算公式如下。

rE＝E/Emax

A-6批注射液的原始光譜 B-6批原始光譜經(jīng)分箱（δ0.02）處理后所得光譜 a～f-6批樣品批號分別為161001、170901、180301、190301、190201、200301

E為樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品的1H-NMR光譜間的標(biāo)準(zhǔn)化歐氏距離，Emax為根據(jù)所有被考察批次丹參注射液與標(biāo)準(zhǔn)樣品的1H-NMR光譜間的標(biāo)準(zhǔn)化歐氏距離的最大值

2.4.2 丹參注射液1H-NMR光譜的分區(qū)相似度評價結(jié)果 以10批臨床使用無不良反應(yīng)的丹參注射液為標(biāo)準(zhǔn)批次，在此基礎(chǔ)上計算平均光譜，并以該平均光譜為基準(zhǔn)，分別計算81批次丹參注射液3個光譜分區(qū)的余弦相似度與相對歐氏距離。為使數(shù)據(jù)便于觀察，使用Origin（版本2019b，美國OriginLab公司）軟件將81批丹參注射液的3個分區(qū)的相似度計算結(jié)果繪制為雷達圖（圖2）。

余弦相似度越接近1說明該分區(qū)與基準(zhǔn)光譜越相似，相對歐氏距離越接近0說明該分區(qū)的相似度越接近于標(biāo)準(zhǔn)樣品。經(jīng)分析，除批次13、16，不在效期內(nèi)的丹參注射液1區(qū)余弦相似度均大于0.970，效期內(nèi)批次的1區(qū)余弦相似度則均大于0.985，說明余弦相似度對氨基酸區(qū)的波動敏感性不足，但仍能體現(xiàn)出不在效期內(nèi)注射液中的氨基酸、小分子有機酸含量與近期批次有一定程度的差異；與此形成對比的是歐氏距離對樣品變異具有更高的敏感性，效期外丹參注射液的1區(qū)、2區(qū)歐氏距離較大且批間波動也較大，批次20～62的3區(qū)歐式距離則明顯高于標(biāo)準(zhǔn)批次。

A-氨基酸區(qū)余弦相似度 B-糖區(qū)余弦相似度 C-酚酸區(qū)余弦相似度 D-氨基酸區(qū)相對歐氏距離 E-糖區(qū)相對歐氏距離 F-酚酸區(qū)相對歐氏距離

2區(qū)余弦相似度這一指標(biāo)則體現(xiàn)出了不在效期內(nèi)的丹參注射液批次糖區(qū)光譜的無序波動，在效期內(nèi)批次31～81中則均高于0.97。而歐式距離的總體趨勢則隨生產(chǎn)日期與基準(zhǔn)批次的接近而逐漸減?。涸撝笜?biāo)在2018年及之前批次中較高，在2019年3月至6月批次中則顯著降低，在0.2～0.5波動；在2019年7月至2020年1月批次中則在0.08～0.23波動，在20年3月及之后的批次中則在0.1～0.4波動。由于糖類在貯存過程中相對穩(wěn)定，可以推測樣品在出廠時糖類含量即不相同，而氨基酸及酚酸類物質(zhì)可能在貯存過程中發(fā)生了較大變化。

3區(qū)的余弦相似度在各批次注射液中的波動更為顯著，其中批次20～56的余弦相似度均低于0.75，相應(yīng)的，其歐式距離則均較大，說明酚酸含量也有一定程度的批間波動。

綜上，相較余弦相似度，歐式距離更能體現(xiàn)批次間的差異；而3區(qū)的余弦相似度對丹參注射液中酚酸的批間變異有較好的考察能力。此外，評價結(jié)果表明，丹參注射液中糖類與氨基酸類成分組成的批間差異較為顯著，對注射液質(zhì)量一致性的影響較大，為提高丹參注射液的用藥安全性，對這2類成分應(yīng)提出控制標(biāo)準(zhǔn)。

2.4.3 分區(qū)相似度評價方法結(jié)果的準(zhǔn)確性驗證

（1）與丹參注射液1H-NMR光譜的全譜相似度評價結(jié)果對比：計算81個樣品的全1H-NMR光譜（0.05～10.0）的余弦相似度與歐氏距離。全譜相似度的雷達圖如圖3所示。由圖3可知，基于全光譜的余弦相似度與歐氏距離僅能識別部分不在效期內(nèi)的注射液的異常；同時，圖2與圖1中2區(qū)余弦相似度及2區(qū)歐氏距離的評價結(jié)果高度雷同，這是因為糖區(qū)在丹參注射液這一品種的氫譜全譜中所占峰面積比例極大，因此基于全譜的相似度分析受糖區(qū)特征峰影響極大，對酚酸區(qū)及氨基酸區(qū)的差異識別能力因此被削弱。因此，對于丹參注射液，基于全譜的余弦相似度及歐式距離相似度評價對異常樣本的識別能力不如分區(qū)相似度評價方法。

（2）基于主成分分析（principal component analysis，PCA）的一致性評價結(jié)果對比：進一步對比81個注射液的全光譜數(shù)據(jù)（A＝81×513）及分區(qū)相似度數(shù)據(jù)（A＝81×6）的無監(jiān)督PCA模型，建模前使用中心化法對所有數(shù)據(jù)進行縮放處理。81個注射液的全光譜PCA模型包含5個主成分，其2為0.901，2為0.767，前3個主成分分別解釋44.6%、27.5%、10.5%的模型方差；81個注射液的分區(qū)相似度數(shù)據(jù)的PCA模型包含3個主成分，其2為0.998，2為0.823，3個主成分分別解釋91.5%、5.6%、2.8%的方差。建模結(jié)果顯示分區(qū)相似度的PCA模型的分類性能優(yōu)于全光譜PCA模型。在此基礎(chǔ)上，為使分類結(jié)果更為明確，基于PCA結(jié)果繪制基于Ward’s最小方差法的層次聚類（hierarchical clustering analysis，HCA）樹。聚類結(jié)果見圖4。

A-全譜余弦相似度 B-全譜相對歐氏距離

由聚類圖4-A可以看出，PCA-HCA無監(jiān)督判別模型對基于全光譜信息的樣品具有一定的聚類能力，但對各批號注射液的分離能力不高，集群間的分類界限不清晰，非相近日期生產(chǎn)的注射液批次（如20年3月批次與19年3月至19年6月批次）也有被聚類到同一集群（圖4-A IV組）的風(fēng)險。對比圖4-A與4-B，顯然基于分區(qū)相似度信息的模型聚類效果更好，相近批次之間的空間距離更近，類內(nèi)相似度更高而類間差異更為顯著。

（3）基于正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least square-discriminant analysis，OPLS-DA）的批間光譜差異辨識 在“2.4.3（2）”項中對效期內(nèi)樣品的聚類結(jié)果，為進一步驗證方法對注射液批間差異辨識的準(zhǔn)確性，將效期內(nèi)體現(xiàn)出差異的批次分為2類（圖4中III組與IV組），對全光譜的分箱積分數(shù)據(jù)進行帕累托縮放處理后，進行OPLS- DA，以觀察2類注射液中的指標(biāo)差異的明確來源。OPLS-DA模型是一種有監(jiān)督的判別模型，較PCA模型有更強的識別類間差異來源的能力。OPLS-DA模型相應(yīng)的S線圖和置換檢驗圖如圖5所示。其中，S線圖用于識別不同類別注射液間的化學(xué)組成差異，置換檢驗圖用于評估模型是否過擬合。

圖5-D～F表明3個模型均未過擬合，模型性能良好。S線圖的ctr[1]反映了變量與1之間的協(xié)方差，而corr值代表了變量與1之間的相關(guān)性，corr的絕對值越大，表示該點對應(yīng)的化合物對模型的影響越大；corr的正相關(guān)系數(shù)和負相關(guān)系數(shù)分別表示2類樣本中相應(yīng)化合物濃度的正相關(guān)和負相關(guān)。由圖5-A～C中S線圖的corr值可知，酚酸區(qū)的不同是2類樣品的主要差異來源，這一結(jié)論與圖2中2類樣本的分區(qū)相似度統(tǒng)計結(jié)論（2類樣本的3區(qū)余弦相似度與歐氏距離均有差異）完全一致。為進一步驗證這一結(jié)果的準(zhǔn)確性，對注射液中酚酸含量進行基于HPLC-UV的定量分析[23]，并以HPLC法所得酚酸含量的定量結(jié)果為參照，考察2類注射液的酚酸含量差異。6個丹參酚酸在2類注射液中含量差異的雙樣本檢驗結(jié)果分別為＝0.000、0.160、0.640、0.000、0.000、0.004。6種丹參酚酸含量分布的箱型圖見圖6所示。由相應(yīng)檢驗結(jié)果可知，注射液中丹參素、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A的質(zhì)量濃度在III組中有顯著的提升，說明2類樣本在酚酸組成上存在顯著差異，但是基于1H-NMR全譜的指紋圖譜一致性分析（圖3）并未體現(xiàn)出這種差異。

A-基于1H-NMR全光譜 B-基于分區(qū)1H-NMR光譜 黑體對應(yīng)批次為標(biāo)準(zhǔn)批次；縱坐標(biāo)為81批次注射液的批號，6位編號YY-MM-BB分別指代該批次生產(chǎn)的年-月-批

A-1區(qū)的S線圖（曲線的不同顏色對應(yīng)不同變量的Pcorr值，縱坐標(biāo)為Pctr [1]，橫坐標(biāo)為相應(yīng)變量的化學(xué)位移） B-2區(qū)的S線圖 C-3區(qū)的S線圖 D-1區(qū)的置換檢驗圖 E-2區(qū)的置換檢驗圖 F-3區(qū)的置換檢驗圖

為異常值 III-III組 IV-IV組

3 討論

本研究將丹參注射液的1H-NMR光譜按代謝物分布規(guī)律進行了分區(qū)，并以余弦相似度及標(biāo)準(zhǔn)化歐氏距離為評價指標(biāo)，分別計算氨基酸區(qū)、糖區(qū)及酚酸區(qū)的相似度，作為多批次丹參注射液的質(zhì)量一致性評價方法，評價了同一廠家在2016年至2020年間生產(chǎn)的81批丹參注射液中酚酸、氨基酸及糖類成分的組成情況，結(jié)果顯示，生產(chǎn)時間間隔較久的產(chǎn)品在氨基酸及糖類成分的含量與組成上存在差異；此外，隨保存時間變長，丹參酚酸也會產(chǎn)生一定程度的降解導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量波動。在此基礎(chǔ)上，通過多角度的對比證明了所提出的1H-NMR光譜分區(qū)相似度評價方法在丹參注射液的質(zhì)量一致性評價中相較傳統(tǒng)的全光譜相似度計算法具有更強的批間化學(xué)差異識別能力。

綜上所述，本研究建立的丹參注射液的1H-NMR光譜相似度評價方法可以反映出丹參注射液批間不同類別成分的波動，可用于丹參注射液的多組分質(zhì)量控制及評價，同時為中藥注射液的一致性評價提供了新的思路與參考方法。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality evaluation method for Danshen Injection based on sectionalized1H- NMR fingerprint spectral similarity

ZHAO Fang1, 2, 3, LI Wen-zhu1, 2, PAN Jian-yang1, 2, YANG Jia-yu1, 2, QU Hai-bin1, 2

1. Pharmaceutical Informatics Institute, College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China 2. State Key Laboratory of Component-Based Chinese Medicine, Innovation Center in Zhejiang University, Hangzhou 310058, China 3. Hisun Biopharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou 311400, China

To establish a quality consistency evaluation method for Danshen Injection (丹參注射液) based on the similarity of sectionalized1H-NMR fingerprint.The1H-NMR spectra of 81 batches of Danshen Injection were obtained. According to the distribution of various metabolite signals, the spectra were sectionalized into three regions, which were the amino acid region, sugar region, and phenolic acid region, respectively. Then, cosine similarities and standardized Euclidean distances of each region for each spectrum were calculated respectively as the consistency evaluation indexes for Danshen Injection. In addition, the evaluation method results aforementioned was compared with the similarity calculation results based on the full1H-NMR spectra.The results showed that certain fluctuations did exist in the composition of amino acids, carbohydrates, and phenolic acids among different batches of Danshen Injection. Among them, the differences in amino acids and carbohydrates between batches were bigger than those in phenolic acids. At the same time, the Euclidean distance was a more sensitive index to the metabolite fluctuations than cosine similarity. In addition, similarity analysis based on the full1H-NMR spectrum was significantly affected by the sugar region, and so its ability to distinguish differences in phenolic acids and amino acids was weak.Similarities based on sectionalized1H-NMR spectra can identify the fluctuations of different types of metabolites better. The method proposed in this study is more appropriate for quality control of Danshen Injection than that based on full-spectrum, which will help to provide reference ideas for further improving the quality control level of traditional Chinese medicine preparations.

proton nuclear magnetic resonance (1H-NMR); Danshen Injection; quality control; quality consistency; similarity analysis; amino acid; sugar; phenolic acid; danshensu; protocatechuic aldehyde; rosemary acid; alkannic acid; salvianolic acid B; salvianolic acid A

R283.6

A

0253 - 2670(2022)17 - 5312 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.007

2022-03-25

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2018ZX09201011-002）

趙 芳（1993—），女，博士后，研究方向為制藥過程分析。E-mail: z_fang@zju.edu.cn

瞿海斌，博士生導(dǎo)師，從事制藥過程質(zhì)量控制研究。Tel: (0571)88208428 E-mail: quhb@zju.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]