常 寧，侯艷霞，盧愛英

（山西林業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，山西太原 030009）

草莓無性繁殖過程中，易受病毒感染，導致大幅減產(chǎn)，經(jīng)濟效益銳減。因此利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進行莖尖脫毒培養(yǎng)至關(guān)重要。在草莓莖尖脫毒培養(yǎng)研究過程中，除了初代培養(yǎng)需要完善莖尖脫毒技術(shù)外，還需優(yōu)化繼代培養(yǎng)基，利于脫毒苗的快速繁殖，優(yōu)化生根培養(yǎng)基，培育出健壯的根系，提高后續(xù)移栽馴化的成活率。

草莓屬于叢生芽增殖型，在適宜的培養(yǎng)基上誘導，不斷發(fā)生腋芽，從而形成叢生芽，大量叢生芽的發(fā)生即可實現(xiàn)大量繁殖的目的[1]。草莓脫毒苗增殖過程中，適當添加植物激素和植物生長調(diào)節(jié)劑可以增加株高、展葉數(shù)和增殖系數(shù)。研究表明，吲哚乙酸（IBA）濃度對草莓脫毒苗增殖有較大影響，一般情況下增殖系數(shù)隨IBA 濃度增加而增大，但較大濃度的IBA 也會導致脫毒苗玻璃體化或增加愈傷組織分化[2-3]。當IBA 濃度低于0.5 mg/L 時，增殖系數(shù)隨6-BA 濃度增加而增大，但當6-BA 的濃度超過1.0 mg/L 時，草莓苗不定芽會產(chǎn)生畸變或嚴重的玻璃化[3-4]。因此，嘗試不同6-BA 和IBA 的濃度配比，找出最有利于草莓叢生芽增殖的培養(yǎng)基，能為草莓脫毒苗的研究奠定基礎。天然有機附加物常含有氨基酸、激素和酶等成分復雜的天然營養(yǎng)成分和生理活性物質(zhì)，因此可以促進細胞增殖和組織分化[5-8]。有研究提出，在文心蘭、蝴蝶蘭、鐵皮石斛和馬鈴薯等植物組培中應用有機附加物能不同程度地促進試管苗的生長[8]。常用的有機附加物有馬鈴薯汁、胡蘿卜汁、番茄汁、香蕉汁、玉米汁、西瓜汁以及小麥面粉等，其中馬鈴薯汁的促進效果較好[7-8]，而草莓脫毒繼代培養(yǎng)中添加馬鈴薯汁的研究鮮見報道。

繼代脫毒苗生根過程中，植株需要從異養(yǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)化為自養(yǎng)狀態(tài)，而培養(yǎng)基中豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如N、P、K 鹽等易使瓶苗產(chǎn)生依賴性，造成生根困難。所以，生根培養(yǎng)基采用MS 培養(yǎng)基時，常適當降低其中N、P、K 鹽的濃度，因此選用1/2 MS 培養(yǎng)基生根有較好的效果[9-10]。此外，不同類型的生長素也會對生根的數(shù)量和質(zhì)量產(chǎn)生影響，一般來說NAA 容易誘導產(chǎn)生粗短的根[11]，但也要嚴格控制生長素的用量，超過一定限度，則會加速形成愈傷組織，影響根的形成和生長，一般NAA 濃度為0.1～1 mg/L為宜[12]。本研究主要探討了草莓脫毒苗繼代和生根培養(yǎng)基的優(yōu)化措施，以期篩選出有利于草莓脫毒苗繼代和生根的處理，為實現(xiàn)草莓脫毒苗工廠化、規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘紅顏’草莓，購于山西太谷巨鑫偉業(yè)農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司。

六芐基腺嘌呤（6-BA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、MS 培養(yǎng)基（不含瓊脂和蔗糖）、瓊脂粉、蔗糖等，均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

奧科破壁料理機，WMS-PB108，深圳市萬清智能電器有限公司；電磁爐，C21N，中山市雅樂思實業(yè)有限公司；立式自動壓力蒸汽滅菌器，GI80DS，致微（廈門）儀器有限公司。

1.3 試驗方法

將通過莖尖和熱處理相結(jié)合的脫毒方法獲得的初代脫毒苗，用于繼代培養(yǎng)基優(yōu)化試驗[13]。繼代培養(yǎng)的瓶苗，用于生根培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗。

1.3.1 不同濃度6-BA 和IBA 的處理

繼代培養(yǎng)過程中，MS 培養(yǎng)基中添加了6-BA 和IBA，共6 種處理。其中，T1 處理為0.5 mg/L 6-BA；T2 處理為0.5 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IBA；T3 處理為0.8 mg/L 6-BA；T4 處理為0.8 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IBA；T5 處理為1.0 mg/L 6-BA；T6 處理為1.0 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IBA。每瓶接種3 株，每個處理接種10 瓶，接種總數(shù)為30株。培養(yǎng)20 d 后觀察并統(tǒng)計繼代苗生長情況。

1.3.2 不同濃度馬鈴薯汁的處理

馬鈴薯汁的制作方法：帶芽馬鈴薯去皮切碎放入破壁機中，加適量蒸餾水榨成汁液[6]。根據(jù)加水比例不同，制成100 g/L 和200 g/L 備用。

馬鈴薯汁的濃度梯度設置兩個處理和一個對照，其中，T4 處理為0.8 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IBA；T7 處理為0.8 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IBA＋100 g/L 馬鈴薯汁；T8 處理為0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA＋200 g/L 馬鈴薯汁。每瓶接種3 株，每個處理接種10 瓶，接種總數(shù)為30 株。培養(yǎng)20 d 后觀察并統(tǒng)計繼代苗生長情況。

1.3.3 不同培養(yǎng)基和不同濃度NAA 的處理

生根培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基類型包括在MS 和1/2 MS兩種處理，NAA 的濃度梯度包括0 mg/L 和0.1 mg/L，共4種處理。其中，T9 處理為MS 培養(yǎng)基；T10 處理為MS 培養(yǎng)基＋0.1 mg/L NAA；T11 處理為1/2MS 培養(yǎng)基；T12 處理為1/2 MS 培養(yǎng)基＋0.1 mg/L NAA。每瓶接種1 株，每個處理接種30 瓶，接種總數(shù)為30 株。培養(yǎng)20 d 后觀察并統(tǒng)計生根苗生長情況。

配制繼代和生根培養(yǎng)基時，1 L 培養(yǎng)基需要添加7 g瓊脂粉和30 g 蔗糖。調(diào)整電磁爐120 W 煮沸后，滴加1 mol/L 鹽酸或1 mol/L 氫氧化鈉將pH 值調(diào)至5.8。分裝后在高壓滅菌鍋中121 ℃下滅菌20 min，冷卻后待用。

1.4 測定指標與方法

平均生根數(shù)和增殖系數(shù)計算公式見式（1）（2）[13]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010 和SPSS 26.0 軟件進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 繼代培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 不同濃度組合6-BA 和IBA 對草莓脫毒苗增殖系數(shù)的影響

由表1 可知，當只添加6-BA 時，其濃度為0.5 mg/L和0.8 mg/L 時，繼代苗增殖系數(shù)分別為2.17 和2.23，但當其濃度達到1 mg/L 時，增殖系數(shù)下降到1.83。這與袁倩等[4]的研究一致，可見當6-BA 濃度過高時，不僅不利于叢生芽增殖，還會對其產(chǎn)生抑制作用。因此，要選擇合適濃度的6-BA，如0.5 mg/L 或0.8 mg/L。

表1 6-BA 和IBA 對草莓脫毒苗增殖系數(shù)的影響Table 1 Effects of 6-BA and IBA on multiplication coefficient of virus-free strawberry seedlings

為了探究IBA 對草莓脫毒苗叢生芽增殖的促進作用，在6-BA 濃度為0.5 mg/L 的培養(yǎng)基中加入0.2 mg/L的IBA，增殖系數(shù)為2.57，與單獨使用0.5 mg/L 的6-BA培養(yǎng)基無顯著差異；在6-BA 濃度為0.8 mg/L 的培養(yǎng)基中加入0.2 mg/L 的IBA，增殖系數(shù)為3.20，與單獨使用0.8 mg/L 的6-BA 培養(yǎng)基有顯著差異。因此，培養(yǎng)基中添加0.8 mg/L 的6-BA+0.2 mg/L 的IBA 的處理更有利于草莓脫毒苗叢生芽增殖。

2.1.2 不同濃度馬鈴薯汁對草莓脫毒增殖系數(shù)的影響

在篩選出的MS＋0.8 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IBA 培養(yǎng)基的基礎上，添加不同濃度馬鈴薯汁，結(jié)果見表2。由表可知，添加的馬鈴薯汁濃度為100 g/L 時，增殖系數(shù)由3.20 增加到4.17，差異顯著；當添加的馬鈴薯汁濃度為200 g/L 時，增殖系數(shù)由3.20 增加到4.00，差異顯著。總體而言，考慮到成本問題，在MS＋0.8 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IBA 培養(yǎng)基中添加100 g/L 馬鈴薯汁的培養(yǎng)基為草莓苗繼代脫毒苗的最佳培養(yǎng)基。

表2 馬鈴薯汁對草莓脫毒苗增殖系數(shù)的影響Table 2 Effects of potato juice on multiplication coefficient of virus-free strawberry seedlings

2.2 生根培養(yǎng)基優(yōu)化

由表3 可知，相比于MS 培養(yǎng)基，1/2 MS 培養(yǎng)基平均生根數(shù)由2.47 增加到5.53，有顯著差異，根系也要繁茂。培養(yǎng)基在1/2 MS 基礎上，加入0.1 mg/L 的NAA 后，平均生根數(shù)由5.53 增加到6.80，有顯著差異，并且根更粗壯。另一方面，在MS 培養(yǎng)基中加入0.1 mg/L 的NAA 時，雖然平均生根數(shù)由2.47 增加到2.87，差異不顯著，但根相對粗壯。因此，一定濃度的NAA 可以改善草莓脫毒苗根系狀態(tài)繁茂度，提高移栽的成活率。綜上所述，生根培養(yǎng)基為1/2 MS＋0.1 mg/L NAA 時不論是平均生根數(shù)，還是從根系的生長狀況來評估，均為最佳。

3 結(jié)論

本研究通過試驗篩選出草莓脫毒苗繼代和生根培養(yǎng)基的優(yōu)化方案。結(jié)果表明，草莓脫毒苗繼代培養(yǎng)基選擇MS＋0.8 mg/L 6-BA＋0.2 mg/LIBA＋100 g/L 馬鈴薯汁，在相同培養(yǎng)時間內(nèi)增殖系數(shù)最高，為4.17，相同生長周期內(nèi)產(chǎn)生的叢生芽數(shù)量最多，能有效提高脫毒苗增殖效率。生根培養(yǎng)基選擇1/2 MS＋0.1 mg/L NAA，在相同培養(yǎng)條件下，平均生根數(shù)最多，為6.80，而且根系繁茂、粗壯，能提高后續(xù)移栽馴化的成活率。