畢文強(qiáng)，段 釬，李 貞

湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院/有機(jī)化工新材料湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心/有機(jī)功能分子合成與應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430062

0 引 言

半胱氨酸（cysteine, Cys）是20 種天然氨基酸中唯一含有還原性硫醇基團(tuán)的氨基酸，在許多生理和病理過程中起著關(guān)鍵作用[1～4]。正常水平的Cys（30～200 μmol/L）能維持各種蛋白質(zhì)和抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）的合成[5]，同時(shí)也是人類新陳代謝中硫化物的來源[6，7]。然而，過量的Cys 與許多疾病息息相關(guān)，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、帕金森病、阿爾茨海默癥等疾病[8，9]。同時(shí)，有報(bào)道稱缺乏Cys 會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢、水腫、肝臟損傷、皮膚病變等。Cys 被認(rèn)為是早期診斷和治療以及疾病監(jiān)測(cè)最重要的生物標(biāo)志物之一，開發(fā)有效手段對(duì)生物體系中的Cys 進(jìn)行分析檢測(cè)具有巨大的應(yīng)用前景。

傳統(tǒng)的Cys 檢測(cè)方法包括高效液相色譜法、質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法和電化學(xué)方法等[10～17]。但這些方法具有成本高、時(shí)間長(zhǎng)、預(yù)處理復(fù)雜等缺點(diǎn)，在生物體系中的應(yīng)用受到限制。熒光探針因其高效、快速、成本低和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)被應(yīng)用于生物體系中Cys 的檢測(cè)[18，19]，一些基于萘酰亞胺、熒光素、咔唑、氨基喹啉或香豆素等熒光團(tuán)的Cys 探針相繼出現(xiàn)[20～24]。但由于探針在體內(nèi)分布不均以及生物體環(huán)境差異，導(dǎo)致其成像結(jié)果不夠準(zhǔn)確。比率型熒光探針能夠有效消除上述因素所帶來的干擾，顯著提高成像結(jié)果的準(zhǔn)確性[25]。目前可應(yīng)用于特異性檢測(cè)Cys 的比率型熒光探針較少，亟需設(shè)計(jì)構(gòu)建新型的Cys 比率型熒光探針。

基于此，我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了一種可特異性檢測(cè)Cys 的比率型近紅外熒光探針Cy-B。該探針在近紅外光激發(fā)下，發(fā)射位于808 nm 的熒光信號(hào)；而當(dāng)其與Cys 反應(yīng)后，產(chǎn)物能夠在635 nm 處產(chǎn)生熒光信號(hào)，且隨著Cys 濃度增加，808 nm 處的熒光信號(hào)逐漸減弱，635 nm 處的熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)。利用熒光發(fā)射的雙通道信號(hào)，可構(gòu)建比率型探針，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)Cys 的高準(zhǔn)確度分析檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

試劑：3，3′-雙十八烷基氧碳花菁高氯酸鹽（DiOC18(3)）、N-甲基馬來酰亞胺（NMM）、N-乙基馬來酰亞胺（NEM）、二硫蘇糖醇（DTT）、丙烯酰氯、溴-十一酸等試劑購(gòu)于上海阿拉丁試劑公司；其他化學(xué)試劑和溶劑均為分析純級(jí)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司或阿拉丁試劑公司；實(shí)驗(yàn)用水均為電阻率18.2 MΩ·cm 的超純水。

儀器：Avance Neo 400 型磁共振儀（Bruker 公司），6224 TOF 液質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent公司），RF-6000型熒光光譜儀（Shimadzu 公司），UH-4150 型紫外-可見近紅外吸收光譜儀（Hitachi公司），Multiskan FC 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Scientific 公司）LSM-880 型多光子共聚焦熒光顯微鏡（Zeiss 公司），IVIS Lumina LT 型小動(dòng)物活體成像儀（PerkinElmer公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 探針Cy-B 的合成方法

探針Cy-B 的合成路線如圖1 所示。

圖1 Cy-B 的合成路線Fig.1 Synthesis route of Cy-B

其中化合物1～4 參照文獻(xiàn)方法合成[25，26]。終產(chǎn)物Cy-B 的合成步驟如下：將化合物4（918 mg，1 mmol）和K2CO3（280 mg，2 mmol）溶 于20 mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，室溫下攪拌30 min后，將丙烯酰氯（136 mg，1.5 mmol）溶于10 mL DMF 后緩慢加入上述體系，室溫?cái)嚢? h。反應(yīng)完成后，首先將反應(yīng)液用乙酸乙酯和水（80 mL，體積比20∶1）混合溶液萃取，有機(jī)相用無水Na2SO4干燥后減壓蒸餾得到粗產(chǎn)物。最后將粗產(chǎn)物采用硅膠柱層析法（淋洗劑為二氯甲烷/甲醇，體積比20∶1）分離提純，得到綠色固體產(chǎn)物Cy-B。產(chǎn)物的磁共振氫譜1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)化學(xué)位移δ：7.61(t,J=9.3 Hz, 4H),7.42(d,J=3.2 Hz,4H),7.33～7.18(m,2H), 6.85(d,J=17.1 Hz,1H), 6.72(dd,J=17.2,10.3 Hz,1H),6.45(d,J=10.2 Hz,1H),6.24(d,J=14.1 Hz,2H),4.18(t,J=6.1 Hz,4H),3.99(t,J=6.5 Hz,4H),2.67(s, 4H),2.26(t,J=7.3 Hz, 4H), 1.93～1.81(m, 2H), 1.71(t,J=6.3 Hz, 4H), 1.53(s, 12H), 1.42～1.26(m, 16H),1.23(m,20H),0.87(t,J=7.4 Hz,6H)；磁共振碳譜13C NMR(101 MHz，DMSO)δ：14.00，19.09，20.98，24.14，24.95，26.49，27.31，27.91，28.89，29.08，29.22，29.25，30.68，33.97，39.43，44.05，49.22，63.79，101.26，111.89，121.27，122.99，125.48，127.09，129.09，129.98，131.17，136.55，139.67，141.41，142.53，158.75，163.76，172.03，173.38。高分辨質(zhì)譜（HRMS，m/z）：[M]+理論值為971.687 2，實(shí)測(cè)值為971.684 9。

1.2.2 緩沖溶液中Cys 的檢測(cè)

考察緩沖溶液中探針Cy-B 的響應(yīng)性能。探針Cy-B 溶于二甲基亞砜（DMSO）制備成10 mmol/L儲(chǔ)備液。測(cè)試時(shí)，使用4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）緩沖溶液（EtOH/HEPES 體積比1∶4，pH 7.4）將探針儲(chǔ)備液稀釋至5 μmol/L，加入不同濃度（0～150 μmol/L）的Cys，反應(yīng)30 min，測(cè)試體系在720 nm 光激發(fā)下808 nm 處的熒光發(fā)射光譜及520 nm 光激發(fā)下635 nm 處的熒光發(fā)射光譜。

考察探針Cy-B 對(duì)Cys 響應(yīng)的特異性。在Cy-B（5 μmol/L）溶液中加入150 μmol/L 的活性氧或活性氮類（H2O2、HClO、·OH、HNO、NO2-、ONOO-）、活性硫類（NaHS、Na2SO4、Na2S2O3、H2Sn）、金屬離子（NaCl、Fe2+、KCl、Cu2+）以及生物分子（葡萄糖（Glucose）、牛血清白蛋白（BSA）、半胱氨酸（Hcy）、谷胱甘肽（GSH））等干擾物，反應(yīng)30 min，分別測(cè)試在720 nm 光激發(fā)下808 nm 處及520 nm 光激發(fā)下635 nm 處的熒光發(fā)射強(qiáng)度變化。

考察探針的pH 穩(wěn)定性。配制不同pH 值的EtOH/HEPES 緩沖溶液，將Cy-B 稀釋至5 μmol/L，測(cè)定在不同pH 值緩沖溶液中Cy-B 的熒光強(qiáng)度。

1.2.3 細(xì)胞毒性

采用CCK-8 法[27]考察探針的細(xì)胞毒性。將HeLa 細(xì)胞（湖南豐暉生物公司）接種于96 孔板中，使用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM為培養(yǎng)基，37 °C 培養(yǎng)24 h；加入含不同濃度Cy-B 探針（0、5、10、15、20、25、30 μmol/L）的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；每孔再加入10 μL CCK-8 溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。采用酶標(biāo)儀測(cè)定體系在450 nm 處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=（加入Cy-B 組的平均吸光度/對(duì)照組的平均吸光度）×100%。

1.2.4 細(xì)胞共定位成像

將HeLa 細(xì)胞接種于直徑35 mm 的玻璃底培養(yǎng)皿中，每皿中加入1 mL DMEM 培養(yǎng)基，細(xì)胞接種密度為1×105個(gè)，于37 ℃培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)24 h。移去培養(yǎng)基，加入細(xì)胞膜定位染料DiOC18(3)，隨后加入含Cy-B 的培養(yǎng)基，培養(yǎng)30 min，用10 mmol/L PBS（pH 7.4）清洗細(xì)胞3 次去除培養(yǎng)基多余的Cy-B，使用激光共聚焦熒光顯微鏡（CLSM）進(jìn)行細(xì)胞成像。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)Cys 成像

細(xì)胞外源性Cys 成像：參考文獻(xiàn)方法[28]，將HeLa 細(xì)胞接種于直徑35 mm 的玻璃底培養(yǎng)皿中，每皿加入1 mL DMEM 培養(yǎng)基，細(xì)胞接種密度為1×105個(gè)，于37 ℃培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)24 h。移去培養(yǎng)基，加入含不同濃度Cys（100、200 μmol/L）的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)30 min，再加入含Cy-B 的培養(yǎng)基，確保每皿Cy-B 終濃度為5 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)30 min，用PBS緩沖溶液清洗細(xì)胞3 次，使用CLSM 進(jìn)行細(xì)胞成像。

細(xì)胞內(nèi)源性Cys 成像：將HeLa 細(xì)胞接種于直徑為35 mm 的玻璃底培養(yǎng)皿中，每皿加入1 mL DMEM 培養(yǎng)基，細(xì)胞接種密度為1×105個(gè)，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，移去培養(yǎng)基。空白組：加入含Cy-B（5 μmol/L）的培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組1：先加入1 mmol/L NEM（巰基清除劑，用于消耗細(xì)胞內(nèi)源Cys），再加入5 μmol/L Cy-B，培養(yǎng)30 min。實(shí)驗(yàn)組2：先加入1 mmol/L NEM，再加入1 mmol/L DTT（用于誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性Cys）培養(yǎng)30 min，最后加入5 μmol/L Cy-B。上述處理組用PBS 緩沖溶液清洗3 次，再使用CLSM 進(jìn)行細(xì)胞成像。

1.2.6 活體內(nèi)Cys 成像

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理和使用指南》進(jìn)行,并經(jīng)湖北大學(xué)動(dòng)物倫理與福利委員會(huì)批準(zhǔn)。

Balb/c 小鼠（雌性，(20±2）g）由湖北貝恩特生物科技有限公司提供。實(shí)驗(yàn)組：將小鼠麻醉后脫毛，在小鼠的左側(cè)皮下注射Cys（20 μL，1 mmol/L）和Cy-B（20 μL，1 mmol/L），在其右側(cè)相同位置注射等量Cy-B。對(duì)照組：在小鼠的左側(cè)皮下注射NMM（巰基清除劑，清除Cys）、Cys 和Cy-B（劑量均為20 μL，1 mmol/L），右側(cè)相同位置注射等量的Cy-B。30 min 后，對(duì)兩只小鼠進(jìn)行活體成像（I635nm通道激 發(fā) 波 長(zhǎng)λex=545 nm，發(fā) 射 波 長(zhǎng)λem=(635±10）nm；I808nm通道λex=600 nm，λem=(810±10）nm）。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針Cy-B 的設(shè)計(jì)原理

以近紅外花菁染料為母體，基于丙烯酸酯與Cys 的特異性識(shí)別反應(yīng)構(gòu)建了比率型Cys 近紅外熒光探針Cy-B。該探針與Cys 反應(yīng)后游離出羥基，進(jìn)而觸發(fā)分子內(nèi)重排反應(yīng)，使熒光團(tuán)母體從花菁結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)橥冀Y(jié)構(gòu)Cy-O（圖2）。Cy-B 分子中的疏水鏈?zhǔn)凰嵴□タ汕度爰?xì)胞膜的磷脂雙分子層內(nèi)，使其具有細(xì)胞膜定位功能。隨著Cys 含量升高，歸屬于花菁染料808 nm 左右的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度（I808nm）減弱，歸屬于酮菁染料的635 nm 左右熒光發(fā)射峰強(qiáng)度（I635nm）增強(qiáng)，同時(shí)二者間比值（I635nm/I808nm）增大，由此可實(shí)現(xiàn)對(duì)Cys 的檢測(cè)。

圖2 探針Cy-B 響應(yīng)Cys 的設(shè)計(jì)原理Fig.2 Design principle of the Cys probe Cy-B

2.2 探針Cy-B 對(duì)Cys 的響應(yīng)性能

考察了探針Cy-B 在緩沖溶液中對(duì)Cys 的響應(yīng)性能。首先優(yōu)化了反應(yīng)的時(shí)間。由Cy-B 與150 μmol/L Cys 的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)可知，比率熒光信號(hào)（I635nm/I808nm）隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，并在25 min 左右趨于穩(wěn)定。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將Cy-B 與Cys 的孵育時(shí)間確定為30 min，以保證反應(yīng)完全。

在含5 μmol/L Cy-B 的EtOH/HEPES（體積比1∶4）緩沖溶液中加入不同濃度（0～150 μmol/L）的Cys，孵育30 min 后，檢測(cè)體系的熒光發(fā)射光譜。如圖3(a)～(c)所示，在0～150 μmol/L 范圍內(nèi)，隨著Cys濃度的增加，Cy-B 在808 nm 處的熒光強(qiáng)度逐漸降低，同時(shí)，在635 nm 處的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；比率熒光信號(hào)（I635nm/I808nm）在該范圍內(nèi)與Cys 濃度呈良好的線性關(guān)系（R2=0.993），檢出限為0.76 μmol/L。此外，由圖3(d) Cy-B 的紫外-可見吸收光譜可知，Cy-B 與Cys 反應(yīng)后，位于780 nm 左右的吸收峰強(qiáng)度減弱，550 nm 左右的吸收峰強(qiáng)度變強(qiáng)，與對(duì)應(yīng)的熒光光譜變化結(jié)果相符。計(jì)算得到反應(yīng)前Cy-B 的量子產(chǎn)率為0.5%，Cy-B 與Cys 反應(yīng)后所得Cy-O的量子產(chǎn)率為0.2%。

圖3 CyB 與不同濃度Cys 反應(yīng)后在808 nm 左右（a）及635 nm 左右（b）的熒光光譜；（c）比率熒光信號(hào)與Cys 濃度的線性關(guān)系；（d）Cy-B 的紫外-可見吸收光譜Fig.3 Fluorescence spectra of Cy-B around 808 nm (a)and 635 nm (b)after reaction with different concentrations of Cys;(c)the linear relationship between ratio signal and Cys concentration;(d)UV-visible absorption spectra of Cy-B

為了實(shí)現(xiàn)在生物體系中的應(yīng)用，探針需具備良好的特異性和穩(wěn)定性。在相同的條件下測(cè)試其他干擾物對(duì)探針熒光信號(hào)的影響,以考察Cy-B 對(duì)Cys響應(yīng)的特異性。如圖4 所示，濃度為150 μmol/L 的活性氧、活性氮、活性硫、金屬離子以及生物分子等物質(zhì)對(duì)探針的比率熒光信號(hào)干擾較小，由此說明探針識(shí)別Cys 的特異性較強(qiáng)。將探針及其與Cys 響應(yīng)后的產(chǎn)物在pH 4.0～8.0 的EtOH/HEPES（體積比1∶4）緩沖溶液內(nèi)孵育時(shí)，Cy-B 與Cys 反應(yīng)前后的比率熒光信號(hào)（I635nm/I808nm）均無明顯變化（圖5）。這說明探針具有良好的pH 穩(wěn)定性。上述結(jié)果表明探針Cy-B 對(duì)Cys 具有良好的響應(yīng)性能以及優(yōu)異的選擇性和穩(wěn)定性，適合應(yīng)用于復(fù)雜生物環(huán)境中特異性檢測(cè)Cys。

圖4 探針Cy-B（5 μmol/L）對(duì)Cys（150 μmol/L）響應(yīng)的特異性Fig.4 Selectivity of Cy-B (5 μmol/L)to Cys (150 μmol/L)against other disruptors

圖5 不同pH 值緩沖溶液條件下探針Cy-B 的熒光強(qiáng)度以及Cy-B 與Cys 反應(yīng)后產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度Fig.5 Fluorescence intensity of Cy-B and the product of Cy-B reacted with Cys in buffer solution with different pH value

2.3 細(xì)胞內(nèi)Cys 檢測(cè)

在將Cy-B 應(yīng)用于細(xì)胞成像之前，先采用CCK-8 法對(duì)其細(xì)胞毒性進(jìn)行了考察。將HeLa 細(xì)胞與不同濃度的探針溶液孵育24 h 后，細(xì)胞的存活率沒有明顯變化，表明探針的細(xì)胞毒性較低，適用于細(xì)胞成像。

進(jìn)一步考察了探針定位細(xì)胞膜的能力。圖6 為染料Cy-B 和DiOC18(3)對(duì)HeLa 細(xì)胞的共定位成像。由圖6 可知，Cy-B 的熒光分布與商品化細(xì)胞膜定位染料DiOC18(3)在活細(xì)胞中的熒光分布一致，Pearson 系數(shù)為0.94，表明Cy-B 可成功定位于細(xì)胞膜。

圖6 Cy-B 和DiOC18(3)對(duì)HeLa 細(xì)胞的共定位成像（a）Cy-B 的紅色通道（λex=600 nm，λem=700～760 nm）；（b）DiOC18（3）的藍(lán)色通道（λex=488 nm，λem=490～540 nm）；（c）（a），（b）的疊加圖像；（d）兩個(gè)通道強(qiáng)度的散點(diǎn)圖；（e）紅色通道和藍(lán)色通道中細(xì)胞的ROI 強(qiáng)度分布圖。比例尺為20 μmFig.6 Co-localization imaging of HeLa cells incubated with Cy-B and DiOC18(3)(a)The red channel of Cy-B (λex=600 nm, λem=700-760 nm);(b)the blue channel of DiOC18(3)(λex=488 nm, λem=490-540 nm);(c)the merged image of (a)and (b);(d)fluorescence intensity scatter plots of the two channels;(e)ROI intensity distribution of both red channel and blue channel in cells.Scale bar:20 μm

接下來，考察了Cy-B 在細(xì)胞內(nèi)對(duì)外源性Cys 的響應(yīng)能力。如圖7 所示，隨著外加Cys 濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)紅色通道熒光信號(hào)（λex=600 nm，λem=700～760 nm）逐漸減弱。該結(jié)果與溶液中結(jié)果一致（見圖8）。而此時(shí)，綠色通道熒光信號(hào)（λex=543 nm，λem=610～680 nm）逐漸增強(qiáng)，比率熒光信號(hào)（Igreen/Ired）隨著加入Cys濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。上述結(jié)果說明，探針Cy-B 可以檢測(cè)細(xì)胞外源性Cys 的濃度變化。

圖7 （a）HeLa 細(xì)胞內(nèi)外源性Cys 的共聚焦熒光成像紅色通道（λex=600 nm，λem=700～760 nm）、綠色通道（λex=543 nm，λem=610～680 nm）;（b）（a）圖中綠色和紅色兩個(gè)通道的熒光信號(hào)平均強(qiáng)度的比值Igreen/IredFig.7 (a)Confocal fluorescence imaging of exogenous Cys in HeLa cells;red channel(λex=600 nm，λem=700-760 nm), green channel(λex=543 nm, λem=610-680 nm);(b)the ratio signal Igreen/Ired of the average fluorescence intensities for the green and red channels in the figure (a)

圖8 CyB 與不同濃度Cys 反應(yīng)后，在700～760 nm 范圍內(nèi)的熒光光譜（λex=600 nm）Fig.8 Fluorescence spectra of Cy-B in the range of 700-760 nm after reaction with different concentrations of Cys (λex=600 nm)

最后，利用Cy-B 對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性產(chǎn)生的Cys 進(jìn)行檢測(cè)。從圖9 HeLa 細(xì)胞內(nèi)源性Cys CLSM 成像結(jié)果可以看出，加入NEM 的細(xì)胞相較于空白組幾乎觀察不到綠色通道熒光信號(hào)（Igreen），說明細(xì)胞內(nèi)的Cys 被NEM 消耗完全。而當(dāng)進(jìn)一步加入DTT 后，Igreen信號(hào)和比率信號(hào)Igreen/Ired信號(hào)均增加，這證實(shí)了Cy-B 可成功檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性Cys。

圖9 （a）HeLa 細(xì)胞內(nèi)源性Cys 共聚焦成像;（b）（a）圖中兩個(gè)通道比率熒光信號(hào)Igreen/Ired強(qiáng)度Fig.9 (a)Confocal imaging of endogenous Cys in HeLa cells;(b)the ratio signal Igreen/Ired for the two channels in (a)

2.4 活體內(nèi)檢測(cè)Cys

在活細(xì)胞中成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)Cys 的檢測(cè)之后，將探針Cy-B 應(yīng)用于活體內(nèi)Cys 檢測(cè)。如圖10(a)所示，當(dāng)小鼠在右側(cè)皮下注射Cy-B 時(shí)，可觀察到較強(qiáng)的808 nm 通道熒光和較弱的635 nm 通道熒光，說明小鼠體內(nèi)含低濃度Cys；當(dāng)向該小鼠左側(cè)相同位置注射Cys 后，635 nm 通道熒光顯著增強(qiáng)，808 nm通道熒光顯著減弱，同時(shí)比率熒光信號(hào)（I635nm/I808nm）升高了1.73 倍。為證實(shí)該信號(hào)變化源自Cy-B 與Cys 的特異性反應(yīng)，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)對(duì)照組。在小鼠注射Cys 前，在同一部位皮下注射NMM，觀察到較強(qiáng)的808 nm 通道熒光和較弱的635 nm 通道熒光，且比率熒光信號(hào)（I635nm/I808nm）與僅注射Cy-B 時(shí)相當(dāng)（圖10(b)）。值得注意的是，兩組小鼠僅注射Cy-B 時(shí)比率熒光信號(hào)值相近，說明比率探針能夠有效克服由于探針分布不均、生理環(huán)境不同所帶來的干擾，提供更為準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。

圖10 Cy-B 檢測(cè)小鼠體內(nèi)Cys 的比率熒光信號(hào)（a）實(shí)驗(yàn)組；（b）對(duì)照組Fig.10 The ratiometric fluorescence signals of Cys detected by Cy-B in living mice(a)experimental group;(b)control group

3 結(jié) 語(yǔ)

本工作利用近紅外花菁染料為母體，修飾可特異性識(shí)別Cys 的丙烯酸酯及細(xì)胞膜定位基團(tuán)，構(gòu)建了檢測(cè)Cys 的比率型熒光探針Cy-B。該探針在808 nm 處有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，當(dāng)與Cys 反應(yīng)后，808 nm 處熒光強(qiáng)度逐漸減弱，同時(shí)在635 nm 處產(chǎn)生熒光信號(hào)且隨Cys 濃度增加逐漸增強(qiáng)。兩個(gè)通道熒光信號(hào)的比值與Cys 濃度線性相關(guān)，從而可實(shí)現(xiàn)對(duì)Cys 的比率型檢測(cè)。該探針不僅可以成功定位于細(xì)胞膜并檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外源性及內(nèi)源性Cys 的濃度變化，而且能夠克服活體內(nèi)由于探針分布及生物環(huán)境等因素對(duì)成像結(jié)果造成的干擾，實(shí)現(xiàn)對(duì)體內(nèi)Cys 的檢測(cè)。本文的工作為研究Cys 在生物體系中的作用機(jī)制提供了一種可靠的方法。