王成德，許允求，蘇志鵬

溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 神經外科，浙江 溫州 325015

神經膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，占顱內腫瘤的60%左右，具有高發(fā)病率、低治愈率、高病死率等特點[1-3]。此外，膠質瘤還具有高侵襲性、高復發(fā)率的特點，傳統(tǒng)的治療手段有手術、放療和化療，但目前患者的平均生存時間僅14.6個月[4-5]。目前臨床尚無有效治療方法，患者5年生存率仍然低于5%[6]。木香內酯（micheliolide, MCL）是從緬桂花中分離得到的倍半萜內酯[7]。既往研究表明MCL可通過PI3K/Akt、NF-κB和MAPK等多種信號通道[7-9]在癌癥治療、炎癥、免疫調節(jié)性急性骨髓性白血病和腎纖維化中均發(fā)揮作用。研究發(fā)現MCL對膠質瘤細胞生長也具有明顯抑制作用[10]。但是，MCL在水溶液中溶解性較低，限制了它的臨床應用[11]。目前，多種納米材料被開發(fā)為藥物載體，以封裝藥物分子，并靶向地將其遞送到病變部位，以提高藥物療效，減少藥物不良反應[12]。本研究將納米材料DSPE-PEG作為藥物載體攜帶MCL，研究其對U87和U251膠質瘤細胞的殺傷作用，為臨床膠質瘤治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要儀器 旋轉蒸發(fā)儀（N-1300V-WB，上海巴玖公司）；透射電子顯微鏡（TEM Tecnai F20，美國FEI公司）；加熱磁力攪拌器（DF-101S，鄭州佰澤儀器有限公司）；激光粒度分析儀（S3500，美國麥奇克有限公司）；高效液相色譜儀（Agilent 1100，美國安捷倫公司）；冷凍高速離心機（美國Thermo scientific公司）；酶標儀（美國Beckman公司）；熒光光學顯微鏡（日本Olympus公司）；倒置普通顯微鏡（日本Olympus公司）；SDS-PAGE電泳儀（美國Bio-rad公司）。

1.2 細胞和試劑 U87和U251 膠質瘤細胞均由溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院中心實驗室提供；MCL由南開大學藥學院提供；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、25%胰酶購自美國Gibco公司；Caspase3、Caspase8、Bcl-2購自美國Abcam公司；蛋白質印跡（Western blot）檢測試劑盒、抗體稀釋液、CCK-8試劑盒購自北京索萊寶公司。

1.3 方法

1.3.1 薄膜水化法制備MCL@DSPE-PEG：精密稱取5 mg MCL、20 mg聚乳酸羥基乙酸共聚物（PLGA）、10 mg二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG）和10 mg卵磷脂（lecithin）放入50 mL的圓底燒瓶中，加入氯仿10 mL振動搖勻至完全溶解。以一定的水浴溫度及旋蒸速度減壓旋蒸，揮干有機溶劑，使其在圓底燒瓶形成一層均勻薄膜，真空干燥20 min去除殘留有機溶劑，再加入5%的葡萄糖溶液，用旋轉蒸發(fā)儀旋轉30 min，使形成的薄膜水化完全，將其轉移至EP管中，冰水浴條件下探頭超聲10 min（功率65 W，超聲2 s，間歇1 s），得MCL@DSPE-PEG脂質體混懸液；采用0.22 μm水膜過濾3次，得MCL@DSPE-PEG液體（取得的MCL@DSPE-PEG藥液于4 ℃冰箱避光保存）。

1.3.2 MCL@DSPE-PEG納米膠束的表征：取100 μL MCL@DSPE-PEG液體，用去離子水稀釋10 倍，使用納米粒度-電位分析儀測量MCL@DSPE-PEG的粒徑和聚合物分散性指數（polymer dispersity index,PDI）。取制備好的MCL@DSPE-PEG經適當稀釋，滴在TEM碳網上并干燥處理，用1%的磷鎢酸溶液負染5 min使對比度增強，晾干后，樣品用電鏡觀察拍照。

1.3.3 MCL@DSPE-PEG納米膠束的穩(wěn)定性測定：將制備好的MCL@DSPE-PEG放入4 ℃冰箱避光保存，并分別于制備的0、2、4、6、8和12 d觀察有無沉淀析出并檢測粒徑大小變化。

1.3.4 MCL@DSPE-PEG納米膠束的載藥量和包封率：精密量取MCL@DSPE-PEG凍干粉適量，記為B0；加入1 mL去離子水溶解，用甲醇稀釋5倍；渦旋5 min使脂質體結構完全破壞，經0.22 μm油膜過濾；HPLC檢測并收集數據，計算1 mL去離子水中含MCL藥物的總質量，記為B1。載藥量計算公式：載藥量（%）=B1/B0×100%。

精密量取過濾前及過濾后的MCL@DSPE-PEG液體200 μL，用甲醇稀釋5倍；渦旋5 min使脂質體結構完全破壞，經0.22 μm油膜過濾；HPLC檢測收集數據，經計算：過膜前藥物質量為A0，過膜后藥物質量為A1。包封率計算公式：包封率（%）=A1/A0× 100%。

1.3.5 MCL@DSPE-PEG納米膠束的體外釋放：精密量取制備好的MCL@DSPE-PEG液體1 mL，置入預先處理過的透析袋中，扎緊袋子兩端后以40 mL的等滲PBS緩沖液浸泡。維持100 r/min和37 ℃恒溫，持續(xù)震蕩。按設定時間間隔置換等體積介質（取出釋放介質0.5 mL，補充新鮮介質0.5 mL）。將上述取出的釋放介質累積后在10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液。上述步驟完成后，將透析袋內液體全部置入釋放介質內，混勻取樣。將取出的樣品加入HPLC檢測并計算出每個時間點累計釋放藥物量及總藥物量，繪制藥物釋放曲線。

1.3.6 MCL@DSPE-PEG納米膠束的體外抗腫瘤實驗

1.3.6.1 細胞培養(yǎng)：U87和U251 膠質瘤細胞系用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)。

1.3.6.2 DSPE-PEG毒性檢測：將對數生長期的U87和U251膠質瘤細胞接種于96孔板，先培養(yǎng)24 h，然后在96孔板中加入DSPE-PEG，加入量分為10、20、40 μL 3個梯度，并按5個復孔設置。24 h后吸除培養(yǎng)液，每孔加入10 μL CCK-8溶液。培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標儀測定450 nm處的吸光度。其中40 μL濃度梯度組分別在0、1、2 d時間點用酶標儀檢測450 nm處的吸光度。

1.3.6.3 細胞克隆形成：將各組細胞接種于12孔板，接種密度為300/皿，培養(yǎng)10 d。培養(yǎng)皿內出現肉眼可見的菌落即終止培養(yǎng)。最后以4%多聚甲醛固定10 min，染色，隨機選取5個視野，顯微鏡下拍照。1.3.6.4 Western blot檢測：預先處理好U87和U251 膠質瘤細胞，分別加入裂解液，在冰上裂解20 min，4 ℃、10 000 r/min離心20 min收集上清液。BCA法測定蛋白濃度后計算加樣量，行10% SDSPAGE電泳并轉膜，抗體孵育后使用ECL顯影。

1.4 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS22.0進行數據分析，計量資料采用±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 液體外觀 本研究合成的MCL@DSPE-PEG納米膠束液體外觀呈乳白色半透明溶液（見圖1）。

圖1 MCL@DSPE-PEG納米膠束溶液外觀

2.2 透射電鏡圖像 本研究制得的MCL@DSPE-PEG納米膠束在透射電鏡下可見其外觀為規(guī)整的球形，大小稍有差異，分散度較好。DSPE-PEG納米膠束的粒徑為（105.1±0.5）nm，PDI為0.244±0.002；載藥后MCL@DSPE-PEG納米膠束的粒徑為（123.8± 0.5）nm，PDI為0.236±0.005。見圖2。

圖2 納米膠束的粒徑分布和透射電鏡圖像

2.3 納米膠束的穩(wěn)定性 MCL@DSPE-PEG納米膠束在4 ℃下放置2周的穩(wěn)定性良好（見圖3）。

圖3 MCL@DSPE-PEG納米膠束的穩(wěn)定性

2.4 載藥量與包封率 MCL@DSPE-PEG納米膠束的包封率為85.49%±3.66%，載藥量為8.96%±0.56%。

2.5 體外釋放曲線 MCL@DSPE-PEG納米膠束在體外有明顯的緩慢釋放現象，長時間的累積釋放度為73.3%，很好地達到了體外緩慢釋放MCL的效果（見圖4）。

圖4 MCL@DSPE-PEG納米膠束藥物釋放曲線

2.6 體外抗腫瘤效果 U87和U251膠質瘤細胞正常條件下呈對數生長（見圖5A）。加入10 μL、20 μL DSPE-PEG后，U87和U251細胞生長不受影響；加入40 μL DSPE-PEG后，U87和U251細胞生長變慢，但仍繼續(xù)增殖（見圖5B）。加入MCL@DSPE-PEG后，加入的濃度越高，對U87和U251膠質瘤細胞生長抑制越強；加入的MCL@DSPE-PEG作用時間越長，對U87和U251膠質瘤細胞生長抑制也越強（見圖5C）。加入5 μL MCL@DSPE-PEG后，U87 的克隆形成率為12.33%；U251的克隆形成率為10.33%（見圖6）。

圖5 膠質瘤細胞在不同條件下生長情況

圖6 MCL@DSPE-PEG對U251、U87細胞克隆形成的影響

2.7 對誘導細胞凋亡的作用 與模型組比，加入MCL@DSPE-PEG后，U87和U251膠質瘤細胞中Bcl-2蛋白表達水平降低，Caspase3、Caspase8蛋白表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖7。

圖7 MCL@DSPE-PEG對U251、U87細胞內凋亡相關蛋白表達的影響

3 討論

本研究以DSPE-PEG納米脂質體為載體，通過薄膜水化法采用溶液中自組裝的形式將難溶于水的MCL包埋在脂質體內核中。借助納米載體極大提高了MCL的水溶性。表征結果顯示MCL@DSPE-PEG納米膠束具有粒徑小、包封率及載藥量高等優(yōu)點。體外釋放結果表明，MCL@DSPE-PEG納米膠束與普通的MCL相比，藥物釋放慢，很好地達到了體外緩慢釋放的效果，并且濃度上升穩(wěn)定，顯示出納米膠束在體外可長時間穩(wěn)定作用的潛力。體外細胞毒性實驗進一步證實，MCL@DSPE-PEG納米膠束能抑制U87和U251膠質瘤細胞生長。

中藥由于其長期的臨床應用歷史而受到越來越a多的關注。因中藥具有的低毒和治療潛力被應用在各種類型疾病的治療，包括多種類型的癌癥，例如肺癌、乳腺癌和神經膠質瘤[13-14]。MCL是從緬桂花中分離得到的倍半萜內酯，已被發(fā)現具有多種生理和藥理特性，例如抗炎和通過各種信號通路的抗癌活性[8-9]。但MCL的穩(wěn)定性和溶解度低，限制了其藥效的發(fā)揮。因此，通過納米遞藥系統(tǒng)解決MCL的上述問題具有重要的臨床意義，尤其在治療腦腫瘤方面，納米顆粒由于能更好地穿透血腦屏障，在靶組織中具有更高的濃度，因此比傳統(tǒng)單藥方法更具優(yōu)勢。

脂質體DSPE-PEG作為藥物遞送系統(tǒng)被用于親脂性藥物的遞送；其具備的水溶性、生物相容性和無免疫原性等優(yōu)勢突出[15]，這些特性可以減弱肝脾網狀內皮系統(tǒng)等體內免疫系統(tǒng)的特異性識別功能[16-17]，從而延長在體內的存留時間；此外，其大分子尺寸結構，不易被腎小球濾過，故能延長藥物在體內的作用時間[17-20]。DSPE-PEG內核具有良好的親脂性，MCL是難溶于水的親脂性藥物，有一定的疏水性，能結合在DSPE-PEG親脂性內核中。為了使納米粒子達到最佳的腫瘤攝取效率，具有高效的腫瘤滲透能力，能通過EPR效應有效地實現腫瘤部位的藥物累積，需要嚴格控制納米粒的粒徑。對于腦腫瘤還面臨需要通過血腦屏障的問題。研究發(fā)現，在直徑200 nm以下的粒子可以比較容易地通過血腦屏障[21]。我們合成的MCL@DSPE-PEG顆粒直徑在123.8nm左右，理論上能夠很好地滿足對血腦屏障透過性的要求，需要在后期的實驗中進一步驗證。本研究中MCL@DSPE-PEG載藥量為8.96%±0.56%，在其他研究中，大多數納米材料的負載能力都在10%以下[22-23]。由于MCL與DSPE-PEG納米膠束的親脂性內核緊密結合在一起，在體內循環(huán)過程中不易短時間解離釋放，減少了藥物到達作用位點前的損失。另外，本研究中合成的納米顆粒具有較高載藥率，在體外表現出明顯的緩慢釋放現象，大大延長藥物作用時間及作用效果。納米遞藥顆粒具備與緩釋類藥品相似的優(yōu)點，可顯著降低血藥濃度峰谷波動，減少給藥次數，從而緩解患者的治療痛苦，在臨床中具有極高的應用價值。

在既往研究中發(fā)現MCL可能通過下調NF-κB/COX-2 信號通路抑制神經膠質瘤的生長[24]。本研究進一步從機制上探討了MCL通過凋亡信號通路對膠質瘤細胞的生長抑制作用。Caspase家族在細胞凋亡發(fā)生過程中起重要作用。根據目前研究顯示，凋亡起始因子Caspase8（還包括Caspase9、Caspase10和Caspase12）與促凋亡信號緊密結合。該起始因子激活之后，可激活下游Caspase-3蛋白，促使DNA修復酶失活，從而誘發(fā)細胞凋亡[25-26]。線粒體信號通路也參與了細胞凋亡的調控，Bcl-2家族是線粒體信號通路重要成員[27]。提取MCL@DSPEPEG干預后的U87 和U251 細胞蛋白，進行Western blot實驗表明，MCL@DSPE-PEG納米膠束能通過抑制膠質瘤細胞中Bcl-2蛋白表達，影響膠質瘤細胞內線粒體功能，還能促進細胞內Caspase8、Caspase3 蛋白表達上升來促使細胞內DNA修復酶失活，進而誘發(fā)細胞凋亡，從而抑制膠質瘤細胞生長。

綜上所述，MCL@DSPE-PEG納米膠束具有粒徑小、載藥量高、緩慢釋藥等優(yōu)點；MCL@DSPE-PEG納米膠束能通過抑制膠質瘤細胞中Bcl-2 蛋白表達，影響膠質瘤細胞內線粒體功能，還能促進細胞內Caspase8、Caspase3蛋白表達水平升高來誘導細胞凋亡，從而抑制膠質瘤細胞生長。