杜鵬，王峰，陳曉波，鄭燕，吳倩倩，劉衛(wèi)軍，王玉亮△

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stromal cells，MSCs）具有多能性、易得性，并兼有免疫調(diào)節(jié)、炎癥趨化、組織修復(fù)等生物學(xué)特性，故有望成為自身免疫疾病、心腦血管疾病、失代償性乙型肝炎肝硬化、器官移植及新型冠狀病毒肺炎（conronavirus disease 2019，COVID-19）等疾病治療的細胞來源［1-2］。脂肪來源間充質(zhì)干細胞（adipose derived mesenchymal stromal cells，ADSCs）是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的組織工程種子細胞，具有容易獲得并可大量復(fù)制的特點，其獲取效率優(yōu)于骨髓MSCs，特別是自體細胞移植不涉及倫理道德問題［3］。隨著ADSCs在多種難治性疾病研究中的應(yīng)用，制備足夠的ADSCs成為研究熱點。ADSCs捐贈者年齡對細胞增殖活性、分化潛能及旁分泌作用有較大影響，尤其是老年患者能否采取自體干細胞治療相關(guān)疾病尚無定論［4］。本研究旨在觀察年齡對ADSCs體外生物學(xué)特性的影響，以期為臨床進行自體細胞移植，迅速獲得所需ADSCs提供實驗依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 納入2020年8月—2021年8月于天津市兒童醫(yī)院行腹部腫物切除的10例患兒（兒童組），男女各5例，年齡2～6歲。納入同期天津市人民醫(yī)院行闌尾炎切除的20例患者；其中，20～40歲的10例（成年組），男女各5例；51～74歲的10例（＞50歲組），男女各5例。獲取各組患者的術(shù)中腹部皮下脂肪組織并留取外周血5 mL。捐獻者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 鼠抗人CD34、CD45、CD73、CD90、CD105單克隆抗體（BD Pharmingen公司，美國）；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司，美國）；Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、植物血凝素（PHA）、成脂及成骨誘導(dǎo)試劑（Sigma公司，美國）；重組人白細胞介素（IL）-2（北京四環(huán)生物制藥有限公司）；TRIzol RNA提取試劑盒（Invitrogen公司，美國）；干擾素（IFN）-γ酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（eBioscience公司，美國）；聚蔗糖-泛影葡胺淋巴細胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國）；超凈工作臺（上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；xCELLigence RTCA實時細胞分析系統(tǒng)及其配套E-plate16孔培養(yǎng)板、CIM-Plate 16孔遷移培養(yǎng)板（Roche公司，德國）；FACS Calibur流式細胞儀（Becton Dickinson公司，美國）；7500型PCR擴增儀（ABI公司，美國）；酶標儀（BioTek公司，美國）。

1.3 研究方法

1.3.1 ADSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定 參照文獻［5］，對兒童組、成年組和＞50歲組腹部皮下脂肪組織進行ADSCs的分離與培養(yǎng)，取第3代ADSCs用于后續(xù)實驗。倒置顯微鏡和姬姆薩染色觀察細胞形態(tài)，流式細胞術(shù)對MSCs細胞表面標志物（CD90、CD105和CD73）、造血干細胞表面標志物CD34及白細胞共同抗原CD45進行鑒定，其中細胞表面標志物表達＞95%為陽性［6］。

1.3.2 增殖細胞指數(shù)（CI）測定 取xCELLigence RTCA實時細胞檢測系統(tǒng)所配置的布滿電極的E-plate 16孔培養(yǎng)板，每孔加入100μL細胞培養(yǎng)液測定基線；待測定完畢，將各組細胞按5 000個/孔的密度種植于E-plate培養(yǎng)板內(nèi)，置于xCELLigence RTCA儀器上，于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗過程中電極實時監(jiān)測各孔增殖CI值，以72 h為監(jiān)測終點。

1.3.3 遷移CI測定 制備細胞懸液前先將細胞在無血清培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)24 h，消化細胞，調(diào)整細胞密度至1×105/mL；取細胞懸液100μL種植于CIM-Plate 16細胞遷移培養(yǎng)板上室；細胞遷移培養(yǎng)板下室加入160μL含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。將CIM-Plate 16孔遷移培養(yǎng)板安置于xCELLigence RTCA儀器上，于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗過程中電極實時監(jiān)測各孔遷移CI值，以72 h為監(jiān)測終點。

1.3.4 ADSCs多向分化能力評估 參照文獻［6］，鑒定ADSCs體外誘導(dǎo)多向分化的潛能，光學(xué)顯微鏡下觀察油紅O染色后脂肪細胞質(zhì)內(nèi)球形脂滴形成情況、茜素紅染色后成骨細胞內(nèi)礦物質(zhì)沉積情況。

1.3.5 實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測成骨特異性基因骨橋蛋白（OPN）和脂肪形成特異性基因過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）mRNA表達水平 采用Trizol法提取ADSCs總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。OPN引物：上游5′-AAACGCCGACCAAGGTACAG-3′，下 游5′-ATGCCTAGGAGGCAAAAGCAA-3′；PPAR-γ引物：上游5′-AGTCCTCACAGCTGTTTGCCAAGC-3′，下 游5′-GAGCGGGTG AAGACTCATGTCTGTC-3′；內(nèi)參基因GAPDH引物：上 游5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下 游5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。反應(yīng)體系：2μL模板、1μL引物、10μL Real PCR Master Mix，焦碳酸二乙酯（DEPC）處理雙蒸水補至20μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。記錄Ct值，以2-ΔCt表示OPN及PPAR-γmRNA的相對表達水平，其中ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH。

1.3.6 ELISA檢測培養(yǎng)上清液中IFN-γ水平 ADSCs以1×104/孔密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板，37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育1 h，將留取的5 mL外周血經(jīng)淋巴細胞分離液以2 000 r/min離心20 min，分離出外周血單個核細胞（PBMCs）。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×105/孔，待ADSCs貼壁后每孔加入1×105個PBMCs，建立共培養(yǎng)體系，共培養(yǎng)體系加入10μL PHA（10 mg/L）及8μL IL-2（100 U/mL）刺激淋巴細胞增殖，每個共培養(yǎng)體系設(shè)3個復(fù)孔，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)72 h，收集培養(yǎng)上清液。參照試劑盒說明書，檢測IFN-γ水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.5軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs的體外培養(yǎng)和鑒定 ADSCs傳代后細胞主要呈長梭形，并呈幾何倍數(shù)穩(wěn)定增長，傳3代后ADSCs細胞形態(tài)均一，呈漩渦狀鋪滿板底，各組細胞形態(tài)均為典型的紡錘形，具備典型的ADSCs形態(tài)特征，見圖1。姬姆薩染色后，可見各組細胞大部分呈紡錘形，也有多角形，胞核染成紫紅色，胞漿染成淡紫色，見圖2。流式細胞儀檢測各組ADSCs表面標志物CD90、CD105和CD73表達均＞95%，CD34、CD45表達均呈陰性，見圖3。

2.2 各組細胞體外增殖和遷移CI比較 與成年組以及＞50歲組比較，兒童組細胞體外增殖CI和遷移CI均增加（P＜0.01），見表1。

2.3 各組細胞多向分化結(jié)果 成脂和成骨誘導(dǎo)液均可誘導(dǎo)ADSCs分化為脂肪細胞和成骨細胞，其中兒童組及成年組能夠明顯誘導(dǎo)分化為成骨細胞，而＞50歲組誘導(dǎo)分化為成骨細胞染色較弱，見圖4。

Fig.1 Morphologic characteristics of ADSCs from three age groups(×200)圖1 3個年齡組ADSCs形態(tài)圖（×200）

Fig.2 Morphologic characteristics of ADSCs after Gemsa staining(×400)圖2 姬姆薩染色后的ADSCs的形態(tài)圖（×400）

Fig.3 Detection of surface markers of ADSCs detected by flow cytometry圖3 流式細胞術(shù)檢測ADSCs表面標志物情況

Tab.1 Comparison of cell proliferation and migration cell index of ADSCs derived from three age groups表1 3組ADSCs增殖及遷移CI比較（n=10，±s）

Tab.1 Comparison of cell proliferation and migration cell index of ADSCs derived from three age groups表1 3組ADSCs增殖及遷移CI比較（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與兒童組比較，P＜0.05。

組別兒童組成年組＞50歲組F增殖CI 2.65±0.18 2.43±0.15a 2.32±0.15a 11.580＊＊遷移CI 2.34±0.17 1.92±0.14a 1.78±0.20a 29.460＊＊

Fig.4 Adipogenic and osteogenic induction differentiation of isolated ADSCs derived from three age groups(×200)圖4 3組ADSCs誘導(dǎo)分化成脂及成骨細胞圖（×200）

2.4 各組PPAR-γ、OPN mRNA相對表達水平及ADSCs抑制PBMCs IFN-γ分泌水平比較 隨年齡的增長，各組PPAR-γmRNA相對表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而OPN mRNA相對表達水平和抑制IFNγ分泌水平逐漸降低（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of PPAR-γ，OPN mRNA expression in ADSCs and IFN-γsecretion in PBMCs from three age groups表2 3組ADSCs中PPAR-γ、OPN mRNA表達及PBMCs中IFN-γ分泌水平比較 （n=10，±s）

Tab.2 Comparison of PPAR-γ，OPN mRNA expression in ADSCs and IFN-γsecretion in PBMCs from three age groups表2 3組ADSCs中PPAR-γ、OPN mRNA表達及PBMCs中IFN-γ分泌水平比較 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與兒童組比較，b與成年組比較，P＜0.05。

組別兒童組成年組＞50歲組F PPAR-γmRNA 0.55±0.11 0.57±0.08 0.63±0.08 2.066 OPN mRNA 0.58±0.07 0.50±0.06a 0.36±0.07ab 26.539＊＊IFN-γ（ng/L）638.5±40.4 687.4±44.8a 740.6±36.6ab 15.701＊＊

3 討論

3.1 ADSCs的形態(tài)及表型 了解不同年齡人群ADSCs的體外生長規(guī)律及生物學(xué)特性是實現(xiàn)其應(yīng)用的基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示，各年齡組細胞形態(tài)均為紡錘形，均具備典型的ADSCs形態(tài)特征；流式細胞分析結(jié)果顯示，3組細胞的MSCs表面標志物CD73、CD90、CD105的表達率均在95%以上，同時陰性標志物CD34、CD45表達率均在1%以下，表明來自所有年齡組的ADSCs含有均一MSCs表型，年齡因素并不影響ADSCs的均一性，與Horinouchi等［7］研究結(jié)論相近。

3.2 ADSCs的生物學(xué)特性 研究顯示細胞的增殖、遷移、抗細胞凋亡和分化能力可能是影響臨床治療結(jié)果以及組織工程成功的關(guān)鍵因素［8］。細胞增殖能力是ADSCs用于治療的關(guān)鍵，即在短時間內(nèi)獲得滿足臨床細胞治療所需要的細胞數(shù)量的能力。遷移指數(shù)反映細胞在體內(nèi)向炎癥部位或是損傷部位遷移能力，在組織修復(fù)中起關(guān)鍵作用。多向分化反映細胞對損傷部位進行損傷修復(fù)及組織再生能力。本實驗通過xCELLigence RTCA實時細胞分析系統(tǒng)檢測3組細胞增殖和遷移能力，該分析系統(tǒng)利用檢測電子傳感器阻抗變化以反映細胞生理狀態(tài)，從而對細胞進行無損傷地定量檢測。結(jié)果表明，在相同培養(yǎng)條件下，隨著年齡的增長，ADSCs體外增殖、遷移能力均逐漸減弱，表明衰老可以降低細胞增殖和遷移能力，提示對老年供體采集ADSCs需要收集更多的脂肪組織或需要對細胞進行預(yù)處理以增強ADSCs的增殖和遷移能力。ADSCs具有多向分化潛能。本研究細胞染色及標志基因表達指標顯示，各組ADSCs均有效地分化為了脂肪細胞和成骨細胞；不同年齡組之間，油紅O陽性細胞數(shù)量相當，脂肪形成特異性基因PPAR-γmRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明高齡人群ADSCs的脂肪生成潛能亦得到了很好的保存。然而，本研究顯示，＞50歲組ADSCs誘導(dǎo)分化成骨細胞的能力較弱，隨年齡的增長，骨結(jié)節(jié)形成特異性基因OPN mRNA相對表達水平降低，表明隨著年齡的增長，ADSCs向成骨細胞分化能力逐漸減弱。兒童因正處于旺盛的生長發(fā)育期，因此要比高齡人群具備更強的自我增殖、遷移和多向分化能力，是較理想的種子細胞的來源。Kornicka等［9］研究顯示，ADSCs的成脂和成骨分化潛能取決于供體年齡，其中＞20歲年齡組OPN mRNA表達水平較高，而50～70歲年齡組的PPAR-γmRNA表達水平更高。另有研究顯示，髂嵴和脛骨來源MSCs的多向分化潛能不受年輕（18～49歲）和高齡（≥50歲）影響［10］。本研究結(jié)果表明，除了不同來源MSCs之間的差異可能影響細胞多向分化潛能外，供體年齡組的差異以及MSCs的培養(yǎng)條件也是導(dǎo)致結(jié)果差異的因素。

3.3 ADSCs免疫調(diào)節(jié) 一般認為，ADSCs的免疫調(diào)節(jié)作用是通過與效應(yīng)細胞的相互接觸并釋放可溶性細胞因子，從而達到抑制免疫細胞增殖的作用［11］。本研究顯示，IFN-γ與淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫反應(yīng)有關(guān)［12］。本研究以有絲分裂原活化的淋巴細胞在體外與來自3組患者的ADSCs共培養(yǎng)結(jié)果顯示，ADSCs可降低促炎細胞因子IFN-γ的分泌，而兒童組來源ADSCsIFN-γ分泌水平低于成年組和＞50歲組，表明ADSCs免疫調(diào)節(jié)能力隨年齡增長而下降，提示需要細胞預(yù)處理策略來提高自體療法中高齡人群來源ADSCs的免疫調(diào)節(jié)功能，與王平等［13］研究結(jié)果相近。

綜上所述，ADSCs的生物學(xué)和功能特征與年齡有關(guān)，兒童來源ADSCs具有更強的體外增殖、遷移、多向分化以及免疫抑制能力。