張凌鵬，陳井霞，楊云云，李 丹，王學(xué)彬，高麗紅，王 卓

(海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，上海200433)

環(huán)孢素為真菌源性的環(huán)狀十一氨基酸多肽的免疫抑制劑，目前主要用于實(shí)體器官移植、造血干細(xì)胞移植和免疫性疾病[1]。環(huán)孢素治療窗窄，藥動(dòng)學(xué)個(gè)體差異大，體內(nèi)藥物暴露量影響因素多，需定期對(duì)其進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)(TDM)[2]。臨床常規(guī)監(jiān)測(cè)全血環(huán)孢素谷濃度或峰濃度，評(píng)價(jià)環(huán)孢素的療效和安全性，便于及時(shí)調(diào)整環(huán)孢素的用藥方案[1-3]。

目前，新型冠狀病毒奧密克戎在全球肆虐，社區(qū)、醫(yī)院封控頻繁，居家隔離成為常態(tài)[4]。使用環(huán)孢素治療的患者免疫功能低下，新型冠狀病毒感染風(fēng)險(xiǎn)較大，不能正常進(jìn)行門診隨訪和監(jiān)測(cè)藥物濃度，難以判斷環(huán)孢素濃度是否在治療窗內(nèi)，治療效果和安全性也無(wú)法評(píng)估[5]。因治療的需要，封控小區(qū)居家患者及新型冠狀病毒感染者定點(diǎn)醫(yī)院隔離期間采集的環(huán)孢素標(biāo)本，轉(zhuǎn)運(yùn)前消殺和運(yùn)輸耗時(shí)長(zhǎng)，導(dǎo)致標(biāo)本采集當(dāng)日不能及時(shí)檢測(cè)[6]。此外，在非新型冠狀病毒肺炎疫情流行期間，諸多醫(yī)療機(jī)構(gòu)TDM實(shí)驗(yàn)室接受本地或異地的快遞標(biāo)本，采集和送達(dá)當(dāng)日均不能及時(shí)檢測(cè)[2,6-7]。環(huán)孢素濃度檢測(cè)試劑盒要求當(dāng)日采集標(biāo)本如不能及時(shí)處理，需在保存時(shí)限內(nèi)完成檢測(cè)。因此，亟需探究不同保存條件對(duì)環(huán)孢素濃度檢測(cè)結(jié)果的影響。本研究通過(guò)探討常溫、冷藏和冷凍條件保存7 d后全血環(huán)孢素的穩(wěn)定性，針對(duì)新型冠狀病毒肺炎疫情居家隔離及非疫情期間異地不便門診隨訪的患者，為其環(huán)孢素TDM樣本的科學(xué)轉(zhuǎn)運(yùn)及保存提供依據(jù)，確保TDM結(jié)果的可靠性。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源

收集2021年12月至2022年3月我院服用環(huán)孢素患者常規(guī)監(jiān)測(cè)后的廢棄標(biāo)本80例次。采血管：EDTA抗凝管；樣本量：1～2 mL；標(biāo)本要求：不凝血；患者標(biāo)本采樣時(shí)間：再次服藥前或服藥2 h后；常規(guī)監(jiān)測(cè)環(huán)孢素血藥濃度作為初始對(duì)照值。

1.2 儀器

ARCHITECT i1000SR型全自動(dòng)免疫分析儀(美國(guó)Abbott公司)；XW-80A型旋渦混合器(上海琪特分析儀器有限公司)；100/200/1 000 μL型移液槍(德國(guó)Eppendorf公司)；Micro17型高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo Electron Corporation公司)；BCD-322型冰箱(德國(guó)Siemens公司)。

1.3 試劑

環(huán)孢素測(cè)定試劑盒(美國(guó)Abbott公司，批號(hào)為25039M800)；標(biāo)準(zhǔn)曲線液(美國(guó)Abbott公司，批號(hào)為85K28921)，全血質(zhì)控品(美國(guó)Bio-rad公司，批號(hào)分別為21883、21891和21892)。

1.4 樣本分裝與保存

全血標(biāo)本混勻后，每個(gè)標(biāo)本用移液槍精密吸取200 μL至離心管中，平行分裝3份，密封。分別室溫(20～25 ℃)、冷藏(2～8 ℃)、冷凍(-35～-30 ℃)避光保存7 d。冷藏、冷凍保存的標(biāo)本在測(cè)定前，均室溫放置30 min以上，按照標(biāo)本前處理標(biāo)準(zhǔn)步驟處理并檢測(cè)。

1.5 環(huán)孢素分析方法

(1)環(huán)孢素血藥濃度測(cè)定方法：采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法(CMIA)，測(cè)定標(biāo)本保存前后環(huán)孢素濃度，試劑盒檢測(cè)范圍為0～1 500 ng/mL，檢測(cè)限≤25.0 ng/mL[6,8-9]。(2)標(biāo)本前處理操作步驟：①標(biāo)本于旋渦混合器強(qiáng)力渦旋2～3 s，用移液槍精密吸取200 μL全血至離心管中；②移液槍精密吸取100 μL全血溶解劑加入離心管，用旋渦混合器強(qiáng)力渦旋5～10 s；③再移液槍精密吸取400 μL環(huán)孢素全血沉淀劑，立即蓋上離心管，用旋渦混合器強(qiáng)力渦旋10～15 s至充分混勻；④用高速離心機(jī)10 000 r/min離心6 min(離心半徑5.6 cm)；⑤將上清液倒入移植預(yù)處理管中，用旋渦混合器渦旋5～10 s，上機(jī)檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 基本資料

80例環(huán)孢素樣本主要來(lái)自常規(guī)環(huán)孢素濃度監(jiān)測(cè)后廢棄標(biāo)本，樣本來(lái)源患者基本資料見(jiàn)表1。

表1 環(huán)孢素樣本來(lái)源患者基本資料(n=80)Tab 1 General information of source patient of cyclosporine sample (n=80)

2.2 室內(nèi)質(zhì)量控制情況

TDM日常工作中做好室內(nèi)質(zhì)量控制對(duì)環(huán)孢素濃度檢測(cè)至關(guān)重要[10]。本實(shí)驗(yàn)室采用質(zhì)控圖聯(lián)合Westgard多規(guī)則法進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制[11]。2021年11月至2022年3月，開(kāi)展本研究期間，3個(gè)批號(hào)的在控質(zhì)控品變異系數(shù)(CV)均<10%(見(jiàn)表2)，實(shí)驗(yàn)當(dāng)日室內(nèi)質(zhì)控實(shí)測(cè)值相對(duì)偏差均<10%(見(jiàn)表3)。以上合格的質(zhì)控為本研究提供了保障。

表2 2021年11月至2022年3月環(huán)孢素TDM室內(nèi)質(zhì)量控制情況Tab 2 Internal quality control of cyclosporine TDM from November 2021 to March 2022

表3 實(shí)驗(yàn)日環(huán)孢素TDM室內(nèi)質(zhì)量控制情況Tab 3 Internal quality control of cyclosporine TDM on experimental day

2.3 不同條件保存7 d環(huán)孢素濃度變化

室溫保存7 d，環(huán)孢素血藥濃度降低者43例(占53.75%)，濃度變化超過(guò)15%的有6例(占7.50%)，差值為-1.4(-82.1，164.2) ng/mL，變化范圍在-24.39%～27.25%；冷藏保存7 d，環(huán)孢素血藥濃度降低者54例(占67.50%)，濃度變化超過(guò)室溫、冷凍保存7 d的環(huán)孢素濃度分別為(213.0±128.3)、(207.4±121.7) ng/mL，與采樣當(dāng)日測(cè)定的血藥濃度[(212.0±123.5) ng/mL]相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.792、P=0.188)；冷藏保存7 d的環(huán)孢素濃度為(198.4±113.8) ng/mL，較采樣當(dāng)日測(cè)定濃度顯著降低6.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)，見(jiàn)表4。線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，盡管冷藏保存7 d較采樣當(dāng)日測(cè)定的環(huán)孢素濃度顯著降低(P=0.002)，但相關(guān)性好(R2=0.903 8)，見(jiàn)圖1。

A.常溫；B.冷藏；C.冷凍A. room temperature; B. refrigerated condition; C. frozen condition

表4 不同條件保存7 d的環(huán)孢素血藥濃度Tab 4 Blood concentration of cyclosporine under different preservation conditions for 7 days

15%的有22例(占27.50%)，差值為-5.3(-184.3，118.4)ng/mL，變化范圍在-43.90%～33.66%；冷凍保存7 d，環(huán)孢素血藥濃度降低者47例(占58.75%)，濃度變化超過(guò)15%的有11例(占13.75%)，差值為-4.2(-123.4～102.5) ng/mL，變化范圍在-33.77%～26.22%。

3 討論

環(huán)孢素不僅被用于器官移植領(lǐng)域，還被用于自身免疫性疾病及不孕不育輔助生殖等[1]。相關(guān)指南、共識(shí)推薦，環(huán)孢素使用者必須定期進(jìn)行TDM，優(yōu)化環(huán)孢素用藥方案，提高治療效果和降低不良反應(yīng)[1-3]。對(duì)于患者因各種困難(如新型冠狀病毒肺炎疫情和異地居住)不能按計(jì)劃進(jìn)行門診隨訪及監(jiān)測(cè)環(huán)孢素濃度，在選擇其他方式送檢標(biāo)本過(guò)程中，合適的標(biāo)本保存條件對(duì)環(huán)孢素濃度檢測(cè)結(jié)果至關(guān)重要[4-6]。

環(huán)孢素檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)提示，EDTA-K2抗凝標(biāo)本常溫保存1 d，冷藏保存7 d，超過(guò)7 d需冷凍保存。按上述條件保存標(biāo)本，環(huán)孢素濃度不會(huì)顯著變化。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，室溫保存7 d與采樣當(dāng)日環(huán)孢素濃度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與環(huán)孢素檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)不一致。盡管冷藏保存7 d環(huán)孢素濃度相對(duì)于采樣當(dāng)日降低6.6%(P<0.05)，但其與采樣當(dāng)日環(huán)孢素濃度線性相關(guān)性良好。環(huán)孢素檢測(cè)試劑盒(CMIA法)總體精密度要求≤15%。因此，對(duì)冷藏保存7 d的環(huán)孢素標(biāo)本進(jìn)行TDM，為環(huán)孢素用藥方案調(diào)整提供參考。另外，冷凍保存7 d與采樣當(dāng)日環(huán)孢素濃度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，標(biāo)本溶血不影響穩(wěn)定性研究結(jié)果，與環(huán)孢素檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)一致，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]。

綜上所述，針對(duì)新型冠狀病毒肺炎疫情居家隔離及非疫情期間異地不便門診隨訪的患者，本研究為其轉(zhuǎn)運(yùn)及保存環(huán)孢素TDM樣本提供了科學(xué)依據(jù)。然而，本研究樣本量少，具有一定的局限性，后續(xù)尚需進(jìn)一步驗(yàn)證和探索。