宋琳琳，孫 娜，王震生，魏新運(yùn)

(1.衡水市第二人民醫(yī)院麻醉科，河北 衡水 053000； 2.衡水市第二人民醫(yī)院骨科，河北 衡水 053000)

骨質(zhì)疏松癥是一種容易引起脆性骨折和慢性致殘性疼痛的疾病，在老年人和絕經(jīng)后婦女中發(fā)生率較高，主要表現(xiàn)為骨量減少和骨骼退化，由破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收與骨形成之間的協(xié)調(diào)平衡失調(diào)引起，研究成骨細(xì)胞的增殖、分化對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療具有重要意義[1-2]。地佐辛為強(qiáng)效阿片類鎮(zhèn)痛藥，在圍手術(shù)期使用廣泛，其在骨折手術(shù)中具有良好的鎮(zhèn)痛效果[3]。但地佐辛對(duì)骨折后愈合及成骨細(xì)胞分化是否有影響尚未可知。Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路參與調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖、分化，在骨形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，研究結(jié)果顯示，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[4-5]。目前，有關(guān)地佐辛在成骨細(xì)胞MC3T3-E1中的作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究探討了地佐辛對(duì)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖、分化及對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司，批號(hào)為BL-1029R。

1.2 儀器

DKW-310型酶標(biāo)儀、BX51-P型顯微鏡和ChemiDoc型凝膠成像儀均購(gòu)自廈門(mén)賽多利儀器有限公司。

1.3 藥品與試劑

地佐辛注射液(規(guī)格為1 mL∶ 5 mg，批號(hào)為20210617)購(gòu)自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司；DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)為GUXMD-50029)、礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(批號(hào)為GUXMD-10058)、茜素紅染色試劑盒(批號(hào)為GUXMD-20154)和RIPA裂解液(批號(hào)為GUXMD-29147)均購(gòu)自賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8，批號(hào)為JL41527)、Wnt/β-catenin通路激活劑氯化鋰(LiCl，批號(hào)為JL58179)、堿性磷酸酶(ALP)顯色液試劑盒(批號(hào)為JL10237)、聚乙二醇辛基苯基醚(批號(hào)為JL20875)和ALP檢測(cè)試劑盒(批號(hào)為JL47127)均購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司；兔抗鼠Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2，批號(hào)為ab9012)、骨橋蛋白(OPN，批號(hào)為ab6027)、骨鈣素(OCN，批號(hào)為ab3074)、Wnt3a(批號(hào)為ab3098)、β-catenin(批號(hào)為ab60121)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin，批號(hào)為ab10563)單克隆抗體和兔抗鼠二抗(批號(hào)為ab10028)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

2 方法

2.1 CCK-8檢測(cè)不同濃度地佐辛對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞存活率的影響

將MC3T3-E1細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞融合至約80%時(shí)，使用質(zhì)量濃度為0、5、10、20、40和80 μg/mL的地佐辛處理細(xì)胞，在96孔板中培養(yǎng)48 h，每孔加入CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，檢測(cè)酶標(biāo)儀450 nm處的吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率=各濃度地佐辛組OD值/(0 μg/mL地佐辛組OD值)×100%]，繪制生長(zhǎng)曲線，計(jì)算細(xì)胞對(duì)地佐辛的半數(shù)抑制濃度(IC50)。每組設(shè)6個(gè)平行樣。

2.2 細(xì)胞分組及處理

待MC3T3-E1細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將MC3T3-E1細(xì)胞分為5組，分別為對(duì)照組、地佐辛低濃度組、地佐辛中濃度組、地佐辛高濃度組和地佐辛高濃度+LiCl組。其中，對(duì)照組正常培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞；地佐辛低、中及高濃度組分別使用10、20及40 μg/mL的地佐辛處理MC3T3-E1細(xì)胞；地佐辛高濃度+LiCl組使用40 μg/mL的地佐辛和20 μmol/L的LiCl[6]處理MC3T3-E1細(xì)胞。每組設(shè)6個(gè)平行樣。

2.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率

將各組處理的MC3T3-E1細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)48 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，孵育1.5 h后檢測(cè)酶標(biāo)儀450 nm處的OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率(細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%)。

2.4 ALP活性檢測(cè)

將各組處理的MC3T3-E1細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)7 d后，棄去培養(yǎng)液，以PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定10 min，加入ALP顯色液，避光染色20 min，顯微鏡下觀察顏色變化并拍照。另取處理48 h后的各組MC3T3-E1細(xì)胞，以PBS洗滌后，使用0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚冰上裂解細(xì)胞10 min，將裂解液反復(fù)凍融3次，離心收集上清液，按照ALP檢測(cè)試劑盒操作方法檢測(cè)ALP活性。

2.5 茜素紅染色檢測(cè)細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)

將不同處理組的MC3T3-E1細(xì)胞調(diào)整成密度為2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，在礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含100 nmol/L維生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和7 mol/L地塞米松)中誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d，以PBS洗滌細(xì)胞，使用95%乙醇固定15 min，再加入0.1%茜素紅染色30 min，顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)取6個(gè)視野觀察鈣化結(jié)節(jié)，計(jì)算平均值。

2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中成骨分化相關(guān)蛋白(RUNX2、OPN和OCN)及Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白(Wnt3a、β-catenin)表達(dá)

不同處理組的MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，定量蛋白濃度后，取20 μg蛋白與上樣緩沖液煮沸變性后，電泳轉(zhuǎn)膜，分別加入兔抗鼠RUNX2(1∶ 300)、OPN(1∶ 300)、OCN(1∶ 500)、Wnt3a(1∶ 1 000)、β-catenin(1∶ 1 000)和β-actin(1∶ 1 000)單克隆抗體，室溫(25 ℃)孵育24 h，再加入二抗(1∶ 3 000)，室溫孵育1 h，ECL顯色，以β-actin為內(nèi)參，通過(guò)Image軟件分析各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 不同濃度地佐辛對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞存活率的影響

使用質(zhì)量濃度為0、5、10、20、40和80 μg/mL的地佐辛分別處理MC3T3-E1細(xì)胞48 h后，隨著地佐辛濃度的增加，MC3T3-E1細(xì)胞存活率逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)計(jì)算，細(xì)胞的IC50約為20 μg/mL，因此選擇10、20和40 μg/mL的濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的地佐辛低、中和高濃度，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度地佐辛對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞存活率的影響Tab 1 Effects of different concentrations of dezocine on the survival rate of MC3T3-E1 cells n=6)

3.2 五組MC3T3-E1細(xì)胞存活率比較

與對(duì)照組比較，地佐辛低、中及高濃度組細(xì)胞存活率依次降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與地佐辛高濃度組比較，地佐辛高濃度+LiCl組細(xì)胞存活率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 五組MC3T3-E1細(xì)胞存活率比較Tab 2 Comparison of survival rates among five groups of

3.3 五組MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性比較

與對(duì)照組比較，地佐辛低、中及高濃度組細(xì)胞ALP活性依次降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，ALP染色變淺；與地佐辛高濃度組比較，地佐辛高濃度+LiCl組細(xì)胞ALP活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，ALP染色變淺變深，見(jiàn)圖1、表3。

A.對(duì)照組；B.地佐辛低濃度組；C.地佐辛中濃度組；D.地佐辛高濃度組；E.地佐辛高濃度+LiCl組A. control group; B. dezocine low concentration group; C. dezocine medium concentration group; D. dezocine high concentration group; E. dezocine high concentration+LiCl group

表3 五組MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性比較Tab 3 Comparison of ALP activity among five groups of

3.4 五組MC3T3-E1細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)比較

與對(duì)照組比較，地佐辛低、中及高濃度組細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)數(shù)目依次降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，鈣化結(jié)節(jié)染色變淺；與地佐辛高濃度組比較，地佐辛高濃度+LiCl組細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)數(shù)目升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，鈣化結(jié)節(jié)染色變深，見(jiàn)圖2、表4。

A.對(duì)照組；B.地佐辛低濃度組；C.地佐辛中濃度組；D.地佐辛高濃度組；E.地佐辛高濃度+LiCl組A. control group; B. dezocine low concentration group; C. dezocine medium concentration group; D. dezocine high concentration group; E. dezocine high concentration+LiCl group

表4 五組MC3T3-E1細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)數(shù)目比較個(gè)，n=6)Tab 4 Comparison of the numbers of calcified nodules among five groups of MC3T3-E1 cells n=6)

3.5 五組MC3T3-E1細(xì)胞RUNX2、OPN、OCN、Wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較，地佐辛低、中及高濃度組細(xì)胞RUNX2、OPN、OCN、Wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)水平依次降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與地佐辛高濃度組比較，地佐辛高濃度+LiCl組細(xì)胞RUNX2、OPN、OCN、Wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3、表5。

表5 五組MC3T3-E1細(xì)胞RUNX2、OPN、OCN、Wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)水平比較Tab 5 Comparison of expression levels of RUNX2, OPN, OCN, Wnt3a and β-catenin protein among five groups of

A.對(duì)照組；B.地佐辛低濃度組；C.地佐辛中濃度組；D.地佐辛高濃度組；E.地佐辛高濃度+LiCl組A. control group; B. dezocine low concentration group; C. dezocine medium concentration group; D. dezocine high concentration group; E. dezocine high concentration+LiCl group

4 討論

地佐辛為新型受體激動(dòng)-拮抗劑，無(wú)明顯的呼吸抑制和藥物依賴性，具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和調(diào)節(jié)免疫作用，在骨折手術(shù)中應(yīng)用廣泛[7-9]。有研究結(jié)果顯示，地佐辛可抑制β淀粉樣多肽處理的原代大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡[10]。本研究使用5～80 μg/mL的地佐辛處理MC3T3-E1細(xì)胞48 h后，結(jié)果顯示，隨著地佐辛濃度的升高，MC3T3-E1細(xì)胞存活率逐漸降低，表明地佐辛對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖具有抑制作用。通過(guò)計(jì)算得出細(xì)胞的IC50約為20 μg/mL，因此選擇10、20和40 μg/mL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。研究結(jié)果顯示，地佐辛通過(guò)靶向調(diào)控蛋白激酶B1/糖原合成酶激酶-3β通路調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和有氧糖酵解[11]。本研究使用10、20和40 μg/mL的地佐辛處理MC3T3-E1細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞存活率較對(duì)照組均降低，且呈濃度依賴性。ALP為成骨細(xì)胞分化早期的標(biāo)志[12]；RUNX2能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化[13]；OPN、OCN為成骨細(xì)胞活性、組織礦化的重要指標(biāo)[14]。鈣化結(jié)節(jié)是成骨細(xì)胞分化的最后階段[15]。本研究結(jié)果顯示，使用10、20和40 μg/mL的地佐辛處理MC3T3-E1細(xì)胞后，細(xì)胞中ALP活性、鈣化結(jié)節(jié)數(shù)目，RUNX2、OPN和OCN蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組降低，呈濃度依賴性，且ALP染色和鈣化結(jié)節(jié)染色變淺。以上結(jié)果表明，地佐辛可抑制MC3T3-E1細(xì)胞增殖與分化，但其作用機(jī)制尚不清楚。

Wnt信號(hào)通路在骨相關(guān)疾病的發(fā)病中有重要作用，Wnt3a可活化β-catenin表達(dá)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以通過(guò)RUNX2基因促進(jìn)成骨的形成[16-17]。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在成骨細(xì)胞的增殖及骨形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[18-19]。研究結(jié)果顯示，上調(diào)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化[20]。而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，則抑制成骨細(xì)胞的增殖、分化[19]。本研究結(jié)果顯示，使用10、20和40 μg/mL的地佐辛處理MC3T3-E1細(xì)胞后，細(xì)胞中Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組降低，且呈濃度依賴性，表明地佐辛可能抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路。另外，本研究使用Wnt/β-catenin通路激活劑LiCl與高濃度地佐辛共同處理MC3T3-E1細(xì)胞后，細(xì)胞存活率、ALP活性和鈣化結(jié)節(jié)數(shù)目，RUNX2、OPN、OCN、Wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)水平較地佐辛高濃度組升高，表明LiCl可逆轉(zhuǎn)地佐辛對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖、分化的抑制作用，證實(shí)地佐辛可通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，抑制成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖、分化。

綜上所述，地佐辛可通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)抑制成骨細(xì)胞的增殖、分化，但本研究?jī)H通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白進(jìn)行了初步研究，接下來(lái)將結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)做更深入的研究。