顧鳴宇，林毅，馬宇航，熊川浩，蓋顯英，丁曉穎，彭永德

1.南京醫(yī)科大學(xué)上海市第一人民醫(yī)院 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科,上海 200080;2.上海市松江區(qū)泗涇醫(yī)院內(nèi)分泌科

我國糖尿病患病率快速上升，胰島素抵抗(IR)是糖尿病的病理生理機(jī)制之一[1]。既往研究顯示，全身的炎癥反應(yīng)參與了胰島素抵抗的發(fā)生，抑制慢性、亞臨床性炎癥可能成為篩選治療IR和2型糖尿病藥物的新靶點(diǎn)[2]。目前已證實(shí)兼有一定抗炎作用的藥物包括原有的降糖藥(二甲雙胍、格列酮類等)、部分調(diào)脂藥和降壓藥等均具有改善胰島素抵抗的作用[3]。水楊酸鹽是臨床常用的抗炎藥物，既往研究顯示大劑量的水楊酸鹽可通過調(diào)節(jié)肥胖誘導(dǎo)的胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和作用缺陷而防止和改善胰島素抵抗[4]。但是阿司匹林等水楊酸鹽發(fā)揮改善胰島素抵抗作用時服用劑量較大，會引起消化道出血等并發(fā)癥，影響了其在改善胰島素抵抗中的應(yīng)用。舒林酸(Sulinda)是一種廣泛應(yīng)用于臨床的非甾體類抗炎藥物。其抗炎作用為阿司匹林的16倍，而胃腸道潛在出血率約是阿司匹林的1/10。較小的起效劑量和較低的副作用使這類抗炎藥物可望成為改善IR的新藥[5]。本研究團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn)，舒林酸可以通過改善胰島素受體底物1(IRS1)絲氨酸/酪氨酸磷酸化狀態(tài)來緩解白細(xì)胞介素(IL)-1β誘導(dǎo)的3T3L1成熟脂肪細(xì)胞胰島素抵抗[6]。在本研究中，通過觀察舒林酸對飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗大鼠糖代謝狀態(tài)的改變，以及舒林酸對大鼠胰島素靶組織信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白IRS1絲氨酸(Ser)/酪氨酸(Tyr)磷酸化狀態(tài)的影響，在體內(nèi)試驗(yàn)探討舒林酸改善胰島素抵抗的作用，為臨床糖尿病患者選擇抗感染治療方案，輔助改善胰島素抵抗提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料 本研究使用的舒林酸購買自Sigma-Aldrich(純度≥98%)，胰島素購買自Eli-Lilly；IRS1 抗體購買自Cell Signal Technology；IRS1-Tyr抗體和IRS1-Ser抗體購買自Upstate Biotechnology；大鼠胰島素檢測試劑盒(放射免疫分析法)購自Linco Research。

1.2 研究方法

1.2.1 高脂飼養(yǎng)大鼠胰島素抵抗模型制備及分組 3周齡雄性SD大鼠20只，體重60～80 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物中心。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為2組：普食組(Chow組)，5只；高脂飼養(yǎng)組(HFD組)，15只。飼養(yǎng)20周后所有大鼠行口服糖耐量試驗(yàn)(OGTT)，10只HFD肥胖大鼠胰島素抵抗造模成功，再隨機(jī)分為2組高脂飼養(yǎng)組(HFD組)和舒林酸組(S組)，舒林酸組在高脂飼養(yǎng)下予以舒林酸100 mg·kgBW-1·d-1灌胃[舒林酸溶于二甲基亞砜(DMSO)中]；高脂飼養(yǎng)組繼續(xù)高脂飼養(yǎng)，Chow組繼續(xù)普食，高脂飼養(yǎng)組和Chow組同時予舒林酸組同樣容積的DMSO溶媒灌胃。4周后所有大鼠稱重后，分別予高胰島素正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 大鼠口服葡萄糖耐量試驗(yàn) 大鼠禁食10 h后，眶后靜脈竇取血，50%葡萄糖 2 g/kgBW灌胃，2 h后取尾靜脈尖血用One Touch Ⅱ型血糖儀檢測微量法血糖。

1.2.3 大鼠高胰島素正糖鉗夾試驗(yàn) 大鼠禁食10 h后，戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定在動物臺上，頸靜脈置管用于胰島素和葡萄糖的輸入，頸動脈置管用于采血。蠕動泵恒定地注入速效胰島素(6.0 mU·kg-1·min-1)，每10 min經(jīng)動脈采血測定血糖，根據(jù)血糖值調(diào)節(jié)葡萄糖(20%)的輸入速度，經(jīng)過100～140 min后鉗夾試驗(yàn)進(jìn)入穩(wěn)定期，以穩(wěn)定期血糖值和葡萄糖的輸入速度計算葡萄糖清除率(GDR)。GDR(mg·kg-1·min-1)=穩(wěn)定期葡萄糖的平均輸入速度×葡萄糖液濃度/大鼠體重。

1.2.4 靶組織胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化 取大鼠的骨骼肌提取蛋白，利用蛋白免疫印跡(Western Blot)的方法檢測骨骼肌組織IRS1以及IRS1-Tyr和IRS1-Ser的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。對于符合正態(tài)分布的變量，組間比較采用SNK法(Student Newman-Keuls)；方差不齊時，行Dunnett′s T3檢驗(yàn)。非正態(tài)分布變量，經(jīng)變量轉(zhuǎn)換成近似正態(tài)分布或采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較和血液學(xué)檢測指標(biāo)的變化 HFD組大鼠平均體重高于Chow組和S組，P值均<0.05。HFD組大鼠餐后血糖高于Chow組,P<0.01。HFD組大鼠三酰甘油水平高于Chow組和S組(P值均<0.05)。見表1。

表1 不同干預(yù)因素對大鼠體重糖、脂代謝指標(biāo)的影響

2.2 葡萄糖耐量和鉗夾試驗(yàn)對不同干預(yù)因素組大鼠糖代謝的影響 在高胰島素正葡萄糖鉗夾穩(wěn)態(tài)期，機(jī)體整體胰島素敏感性由GDR判定。干預(yù)后，HFD組大鼠GDR(7.87 mg·kg-1·min-1)低于Chow組(10.45 mg·kg-1·min-1)，P<0.05；S組高于HFD組(12.39 mg·kg-1·min-1)，提示葡萄糖清除率升高，胰島素敏感性改善(P值分別<0.01和<0.05)。

2.3 不同干預(yù)因素對大鼠骨骼肌組織胰島素信號通路蛋白表達(dá)的影響 圖1顯示了不同干預(yù)因素對大鼠骨骼肌組織IRS1、IRS1-Tyr、IRS1-Ser表達(dá)的影響，結(jié)果表明HFD、S組間IRS1表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，S組IRS1-Tyr表達(dá)水平顯著高于HFD組而IRS1-Ser較HFD組有下降趨勢。

圖1 不同干預(yù)因素對大鼠骨骼肌IRS1、IRS1-Tyr、IRS1-Ser表達(dá)的影響

3 討論

胰島素抵抗是糖尿病的重要發(fā)病機(jī)制之一，炎癥導(dǎo)致胰島素抵抗的分子機(jī)制是近幾年研究的熱點(diǎn)[7-8]。生理情況下，胰島素與胰島素受體結(jié)合后，胰島素受體磷酸化導(dǎo)致胰島素受體底物的酪氨酸磷酸化，激活其下游底物，將胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至效應(yīng)器[9]。炎癥因子激活的一系列激酶也可以使胰島素受體底物發(fā)生磷酸化，但是作用部位在酪氨酸附近的絲氨酸/蘇氨酸上，一旦絲氨酸/蘇氨酸磷酸化就會干擾酪氨酸的磷酸化，導(dǎo)致胰島素受體底物和胰島素受體的結(jié)合松散，激活下游底物磷脂酰肌醇-3激酶的能力下降或可促進(jìn)胰島素受體底物的降解，從而減弱了胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起胰島素抵抗[10]。

近年來研究顯示抑制炎癥反應(yīng)可以改善胰島素抵抗。有研究報道大劑量阿司匹林治療可使代謝綜合征患者空腹血糖降低25%，CRP和總膽固醇降低約15%，三酰甘油降低近50%，可使肝臟葡萄糖輸出減少約20%，同時增加胰島素介導(dǎo)的周圍組織葡萄糖攝取達(dá)30%[11]。本研究觀察了另一種非甾體類抗炎藥舒林酸對高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗的作用。本研究應(yīng)用高胰島素-正葡萄糖鉗夾技術(shù)對模型動物進(jìn)行胰島素敏感性的評價，高胰島素-正葡萄糖鉗夾技術(shù)是評估胰島素抵抗的金標(biāo)準(zhǔn)[12]。本研究結(jié)果顯示，HFD組大鼠GDR較Chow組顯著下降(P<0.05)，提示高脂飼養(yǎng)胰島素抵抗肥胖大鼠建模成功。進(jìn)一步觀察舒林酸干預(yù)的高脂大鼠GDR的變化，發(fā)現(xiàn)舒林酸組(S組)的GDR水平較HFD組明顯升高，提示舒林酸干預(yù)后大鼠胰島素抵抗得到了改善。

IRS家族是參與胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白，其中IRS1及其磷酸化水平在胰島素受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中對胰島素生物學(xué)效應(yīng)起到重要作用[13]。IRS1絲氨酸(Ser307)磷酸化在介導(dǎo)胰島素生物學(xué)效應(yīng)負(fù)反饋調(diào)節(jié)方面起重要作用，是目前糖尿病和肥胖狀態(tài)下IR的主要分子水平指標(biāo)[14]。本研究用Western blot方法檢測了各組大鼠骨骼肌組織IRS1酪氨酸、絲氨酸的磷酸化水平。結(jié)果顯示，舒林酸組(S組)大鼠肝臟IRS1酪氨酸磷酸化表達(dá)水平上調(diào)，IRS1絲氨酸磷酸化表達(dá)水平較HFD組有下降趨勢。提示舒林酸可能通過調(diào)節(jié)大鼠IRS1酪氨酸、絲氨酸的磷酸化水平來改善高脂引起的胰島素抵抗。既往研究人員發(fā)現(xiàn)舒林酸可調(diào)節(jié)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性[15]。在脂肪細(xì)胞中抑制NF-κB的活性可減少腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6等炎癥因子的釋放，TNF-α等炎癥因子能造成IRS1在胰島素刺激下其酪氨酸磷酸化能力降低[16]。故推測舒林酸是通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路改善炎癥狀態(tài)進(jìn)而影響到胰島素信號通路。此外，舒林酸是過氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPARγ)的配體之一[17]。PPARγ是調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化、脂質(zhì)代謝、葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素敏感性的主要調(diào)節(jié)因子。PPARγ的配體如吡格列酮、羅格列酮等都可有效增加2 型糖尿病患者的胰島素增敏作用并改善血糖控制。舒林酸及其衍生物也可能通過調(diào)節(jié)PPARγ起到改善胰島素抵抗的作用[18]。本研究為舒林酸干預(yù)與胰島素敏感性相關(guān)關(guān)系的初步探索，仍有一定的局限性：研究樣本量較小，未來需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證該結(jié)論。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)試驗(yàn)中舒林酸可通過調(diào)節(jié)IRS1 Ser /Tyr殘基的磷酸化水平從而改善高脂飲食引起的胰島素抵抗。這為舒林酸在臨床中應(yīng)用于改善胰島素抵抗提供了理論基礎(chǔ)，但舒林酸改善胰島素抵抗的分子機(jī)制仍未明確，未來有待更進(jìn)一步的臨床和基礎(chǔ)研究探討和闡明。