高敏 趙璐 陳思思 魏瑞華 粘紅

天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼科研究所 國(guó)家眼耳鼻喉疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心天津市分中心 天津市視網(wǎng)膜功能與疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384

干燥綜合征(Sj?gren syndrome，SS)相關(guān)干眼是常見(jiàn)的自身免疫性干眼，嚴(yán)重者可繼發(fā)角膜潰瘍，造成視力損傷[1]。由于SS發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，臨床上仍缺乏有效的治療方案[2-3]。輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)是自身免疫性干眼中關(guān)鍵的致炎細(xì)胞群[4]，研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞在SS患者外周血中比例上調(diào)，并且與SS疾病活動(dòng)指數(shù)ESSDAI密切相關(guān)[5]。多項(xiàng)研究證實(shí)微小RNA(microRNA，miRNA)參與調(diào)控Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)，進(jìn)而影響自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展[6]。miR-31-5p是一種進(jìn)化高度保守的miRNA，在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮免疫調(diào)控作用。研究表明miR-31可通過(guò)促進(jìn)T細(xì)胞中白細(xì)胞介素2(interleukin-2，IL-2)的異常表達(dá)參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病[7]，或通過(guò)抑制Gprc5a影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的炎癥反應(yīng)[8]；但其在自身免疫性干眼中的調(diào)控作用及機(jī)制尚不明確。本課題組前期研究結(jié)果表明，miR-31-5p在兔自身免疫性干眼模型淚腺以及外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中表達(dá)顯著下調(diào)[9]。本研究進(jìn)一步探討miR-31-5p對(duì)兔自身免疫性干眼模型外周血Th17細(xì)胞的免疫調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用SPF級(jí)成年雌性新西蘭大白兔4只，體質(zhì)量為2.5～3.0 kg(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供)，實(shí)驗(yàn)前排除眼部炎癥及其他異常。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用及喂養(yǎng)嚴(yán)格遵循國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，研究方案通過(guò)天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(批文號(hào)：TJYY20201221036)。

1.1.2主要試劑及儀器 慢病毒包裝細(xì)胞人胚腎293T細(xì)胞株(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))；輔助包裝質(zhì)粒pSPAX2和pMD2.G，LipoFiterTM(上海漢恒生物有限公司)；大腸桿菌菌株DH5α(美國(guó)Invitrogen公司)；Ⅰ型膠原酶、DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、聚乙二醇8000(美國(guó)Gibco公司)；Ficoll粉(美國(guó)Sigma公司)；淋巴細(xì)胞分離液(美國(guó)GE公司)；RNA提取試劑盒(美國(guó)ZScience Biotechnology公司)；限制性?xún)?nèi)切酶、T4連接酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green 2倍Master Mix(美國(guó)Thermo公司)；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(北京康為世紀(jì)有限公司)；小鼠抗兔IL-17抗體(MAA063Rb21，美國(guó)Cloud-Clone公司)；鼠抗兔β-actin抗體(TA-09，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；馬抗小鼠IgG二抗(7076s，美國(guó)Cell Signaling Technology公司)。BioSpectrum410凝膠成像儀(美國(guó)UVP公司)；BX53型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；Light Cycler PCR儀(瑞士Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1miR-31-5p過(guò)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)GeneBank提供的miR-31-5p前體序列設(shè)計(jì)引物，并在其中引入Xho I酶切位點(diǎn)，正向引物序列：5'-TGTGGAGAGGAGGCAAGATGCTGGC-3'；反向引物序列：5'-CCGCTCGAGAAAAAAAAGATGGCAATATGTTG GC-3'(下劃線(xiàn)標(biāo)注部分為酶切位點(diǎn))。以兔脾臟cDNA為模板行PCR擴(kuò)增miR-31-5p前體序列，反應(yīng)體系為：cDNA模板1.0 μl，正向引物和反向引物各0.6 μl，2倍pfu PCR mix 5.0 μl，超純水2.8 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，64.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，連續(xù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃保溫5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后純化。慢病毒空載體pLL3.7經(jīng)Xho I和Hpa I雙酶切，目的片段經(jīng)Xho I單酶切后瓊脂糖凝膠電泳純化，用T4連接酶將酶切后載體和目的片段進(jìn)行連接反應(yīng)。取10 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)菌，在含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日挑取單克隆菌落，37 ℃、250 r/min搖菌16 h后進(jìn)行菌液PCR鑒定，提取陽(yáng)性克隆菌中質(zhì)粒送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞行慢病毒包裝 將質(zhì)粒進(jìn)行高純度無(wú)內(nèi)毒素抽提，轉(zhuǎn)染前一天將培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期、狀態(tài)良好的293T細(xì)胞用胰蛋白酶消化并接種于100 mm培養(yǎng)皿中，次日待細(xì)胞融合密度達(dá)70%～80%時(shí)用于慢病毒包裝。轉(zhuǎn)染時(shí)，取2支滅菌離心管，將重組載體質(zhì)粒分別與包裝質(zhì)粒遵循摩爾比1∶ 1∶ 1混合(pSPAX2、pMD2.G、pLL3.7/pLL3.7-miR-31-5p，共24 μg)，另取DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基與LipoFiterTM(30 μl)混合并于室溫孵育5 min。將質(zhì)粒混合溶液與LipoFiterTM溶液混合均勻，室溫孵育20 min后共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。6 h后移去混合液并更換為含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的完全培養(yǎng)基。于轉(zhuǎn)染后48 h及72 h收集細(xì)胞上清，離心半徑16.8 cm，4 ℃條件下3 000 r/min離心15 min，去除細(xì)胞碎片，0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾上清液后加入5倍聚乙二醇8000 NaCl母液，4 ℃搖床過(guò)夜。次日6 500×g離心20 min，1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸沉淀并取EP管分裝，-80 ℃儲(chǔ)存。

1.2.3miR-31-5p重組慢病毒滴度檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的293T細(xì)胞用胰蛋白酶消化法計(jì)數(shù)，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板(總體積為100 μl)。次日細(xì)胞融合達(dá)30%～50%，取10個(gè)無(wú)菌EP管分別加入90 μl含10% FBS的完全培養(yǎng)基，將10 μl重組慢病毒原液加入第1個(gè)EP管中，混合均勻后吸取10 μl加入第2個(gè)EP管中，重復(fù)操作直至最后1個(gè)EP管。移去孔中培養(yǎng)基，將梯度稀釋的病毒加入293T細(xì)胞中并孵育24 h，加入100 μl完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，于熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。對(duì)熒光比例為20%～40%的孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光表達(dá)比例，計(jì)算病毒原液滴度：滴度(TU/ml)=細(xì)胞數(shù)×熒光百分比×103/病毒原液體積(μl)。

1.2.4自身免疫性兔干眼模型的建立 參照前期研究方法[10-11]，分離提純兔淚腺上皮細(xì)胞及PBMC，構(gòu)建細(xì)胞混合培養(yǎng)體系。將實(shí)驗(yàn)兔全身麻醉后摘取左下淚腺，分離并提純淚腺上皮細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并以1×106/孔細(xì)胞接種于24孔板，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，25 Gy γ射線(xiàn)照射去除其增生能力，保留抗原提呈功能。利用靜脈采血針于兔耳中動(dòng)脈采血，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)稀釋4倍后緩慢加到淋巴細(xì)胞分離液上方，20 ℃條件下2 000 r/min離心20 min，離心后吸取中間白色云霧狀單個(gè)核細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并以相同的密度(1×106/孔)與經(jīng)γ射線(xiàn)照射的淚腺上皮細(xì)胞混合培養(yǎng)。混合培養(yǎng)5 d后，收集激活的淋巴細(xì)胞，用PBS配制成2×106/ml細(xì)胞懸液1 ml，經(jīng)耳緣靜脈輸注體內(nèi)。依照文獻(xiàn)[10]評(píng)估方法，于輸注前及輸注后每2周檢測(cè)干眼臨床相關(guān)指標(biāo)，確定模型成功建立。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-31-5p及Th17細(xì)胞相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量 分離模型兔PBMC，分為miR-31-5p過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組，分別感染miR-31-5p過(guò)表達(dá)及其對(duì)照慢病毒72 h，以U6為內(nèi)參照，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-31-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，62 ℃退火及延伸40 s，40個(gè)循環(huán)。病毒感染后24 h收集2個(gè)組PBMC，換液后與經(jīng)γ射線(xiàn)照射的淚腺上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，72 h后收集PBMC。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)引物序列見(jiàn)表1，引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成，反應(yīng)體系：SYBR Green ⅠMaster 4 μl，正反向引物各1 μl，cDNA模板2 μl；以GAPDH為內(nèi)參照，檢測(cè)IL-17、維甲酸相關(guān)孤兒核受體(retinoic acid-receptor-related orphan receptor C,RORC)、IL-1β、IL-6、IL-23 mRNA相對(duì)表達(dá)量，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火及延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。2個(gè)組相對(duì)定量結(jié)果分析采用2-ΔΔCt法。每次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)中設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取平均值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果獨(dú)立重復(fù)3次以上。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for quantitative real-time PCR基因引物序列(5'-3')擴(kuò)增片段長(zhǎng)度(bp)IL-17正向:GGAATGAGGACCACCA-CATGA61反向:CTGCGTAGGACCAG-GATCTCTTRORC正向:GGCCTACCACGCCGA57反向:TCCATGCCACCGTATTTGCIL-1β正向:CTCCTGCCAACCCTACAA-CAA60反向:TCCAGAGCCACAACGACT-GAIL-6正向:GCAGAAAAACCAGTGGCT-GAA53反向:GGCCGCGCAGGATGAIL-23正向:AGGAGTGTCTTGCGAAT-GTGAT148反向:AGCAGGAGCAGGGTTGATGGAPDH正向:GGGTGGTGGACCTCATGGT58反向:CGGTGGTTTGAGGGCTCT-TAmiR-31-5p正向:CGAGGCAAGATGCTGGCAT60反向:AGTGCAGGGTCCGAGG-TATTU6正向:CGCTTCGGCAGCACATAT-AC87反向:TTCACGAATTTGCGTGT-CATC 注:PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);IL:白細(xì)胞介素;RORC:維甲酸相關(guān)孤兒核受體C;GAPDH:磷酸甘油醛脫氫酶;miR:微小RNA;U6:U6核小RNA Note:PCR:polymerase chain reaction;IL:interleukin;RORC:retinoic acid-receptor-related orphan receptor C;GAPDH:glyceraldehyde phos-phate dehydrogenase;miR:microRNA;U6:U6 small nuclear RNA

1.2.6Western blot法檢測(cè)IL-17蛋白相對(duì)表達(dá)量 miR-31-5p過(guò)表達(dá)組及對(duì)照組PBMC與經(jīng)γ射線(xiàn)照射的淚腺上皮細(xì)胞體外共培養(yǎng)72 h，收集PBMC，加入RIPA裂解液、PMSF、磷酸酶抑制劑(體積比100∶ 1∶ 1)提取細(xì)胞總蛋白。用BCA試劑盒檢測(cè)相對(duì)蛋白濃度，將蛋白與上樣緩沖液混合均勻并于100 ℃高溫變性10 min。取80 μg等量蛋白樣品加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠孔，100 V恒壓電泳60 min后，在65 V條件下將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入相應(yīng)的鼠抗兔IL-17(1∶ 667)和小鼠抗兔β-actin(1∶ 2 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。1倍TBST緩沖液洗滌10 min，共3次，加入馬抗小鼠IgG二抗(1∶ 2 000)，室溫下孵育2 h。經(jīng)1倍TBST緩沖液再次洗滌，按體積比1∶ 1混合加入ECL發(fā)光液，采用化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀采集圖片信息，采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算IL-17蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-31-5p重組慢病毒載體的鑒定

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增miR-31-5p前體序列的片段大小為83 bp，目的片段大小與預(yù)期結(jié)果相符。將目的片段克隆至pLL3.7慢病毒過(guò)表達(dá)載體后，測(cè)序分析結(jié)果顯示插入片段序列與目的序列一致，miR-31-5p重組慢病毒載體構(gòu)建成功(圖1)。

圖1 miR-31-5p重組慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定 A：PCR擴(kuò)增miR-31-5p前體片段瓊脂糖凝膠電泳圖 B：miR-31-5p重組慢病毒載體測(cè)序圖 miR：微小RNA

2.2 miR-31-5p重組慢病毒滴度

熒光顯微鏡下可見(jiàn)轉(zhuǎn)染后48 h miR-31-5p重組慢病毒及對(duì)照病毒中表達(dá)GFP蛋白的綠色熒光細(xì)胞約占細(xì)胞總數(shù)的90%(圖2)；293T細(xì)胞熒光強(qiáng)度隨病毒的稀釋逐漸減弱(圖3)。miR-31-5p重組慢病毒及對(duì)照病毒滴度分別為3.82×107TU/ml和3.50×107TU/ml，滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。

圖2 miR-31-5p重組慢病毒和對(duì)照病毒感染293T細(xì)胞48 h GFP表達(dá)情況(標(biāo)尺=500 μm) A：對(duì)照病毒 B：miR-31-5p重組慢病毒

圖3 不同濃度病毒感染293T細(xì)胞后72 h GFP熒光表達(dá)情況(標(biāo)尺=100 μm) A～F所含病毒體積百分比分別為10%、1%、1×10-1%、1×10-2%、1×10-3%、1×10-4%

2.3 2個(gè)組PBMC中miR-31-5p相對(duì)表達(dá)量比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，miR-31-5p過(guò)表達(dá)組miR-31-5p相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-9.696，P<0.001)(表2)。

表2 2個(gè)組PBMC中miR-31-5p相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)Table 2 Comparison of miR-31-5p relative expressionlevel in PBMC between two groups (x±s)組別樣本量miR-31-5p對(duì)照組41.02±0.03miR-31-5p過(guò)表達(dá)組42.58±0.32t值-9.696P值<0.001 注:(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)) PBMC:外周血單個(gè)核細(xì)胞;miR:微小RNA Note:(Independent samples t test) PBMC:peripheral blood mononucle-ar cell;miR:microRNA

2.4 2個(gè)組RORC及IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，miR-31-5p過(guò)表達(dá)組PBMC中RORC、IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量均較對(duì)照組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表3)。

表3 2個(gè)組PBMC中RORC和IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)Table 3 Comparison of RORC and IL-17 mRNA relativeexpression level in PBMC between two groups (x±s)組別樣本量RORC mRNAIL-17 mRNA對(duì)照組31.00±0.001.00±0.00miR-31-5p過(guò)表達(dá)組30.33±0.030.28±0.09t值46.25613.810P值<0.0010.005 注:(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)) PBMC:外周血單個(gè)核細(xì)胞;RORC:維甲酸相關(guān)孤兒核受體C;IL:白細(xì)胞介素;miR:微小RNA Note:(Independent samples t test) PBMC:peripheral blood mononu-clear cell;RORC:retinoic acid-related orphan receptor C;IL:interleu-kin;miR:microRNA

2.5 2個(gè)組PBMC中IL-17蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

Western blot結(jié)果顯示，miR-31-5p過(guò)表達(dá)組IL-17蛋白條帶較對(duì)照組明顯減弱，其相對(duì)表達(dá)量為0.30±0.05，明顯低于對(duì)照組的0.66±0.15，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.977，P=0.008)(圖4)。

圖4 2個(gè)組PBMC中IL-17蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 A：Western blot電泳圖 B：IL-17蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與對(duì)照組相比，aP<0.01(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，n=3) 1：對(duì)照組；2：miR-31-5p過(guò)表達(dá)組 IL：白細(xì)胞介素；β-actin：β-肌動(dòng)蛋白

2.6 2個(gè)組PBMC中Th17細(xì)胞極化相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-23和IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

miR-31-5p過(guò)表達(dá)組PBMC中IL-6、IL-23、IL-1β mRNA表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表4)。

表4 2個(gè)組PBMC中IL-6、IL-23和IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)Table 4 Comparison of IL-6,IL-23 and IL-1β mRNArelative expression levels in PBMC between two groups (x±s)組別樣本量IL-6 mRNAIL-23 mRNAIL-1β mRNA對(duì)照組31.00±0.001.03±0.061.00±0.00miR-31-5p過(guò)表達(dá)組30.51±0.000.47±0.110.60±0.05t值220.0766.64113.271P值<0.0010.0220.006 注:(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)) PBMC:外周血單個(gè)核細(xì)胞;IL:白細(xì)胞介素;miR:微小RNA Note:(Independent samples t test) PBMC:peripheral blood mononucle-ar cell;IL:interleukin;miR:microRNA

3 討論

SS相關(guān)干眼主要由CD4+Th細(xì)胞介導(dǎo)，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，了解其發(fā)病機(jī)制有助于探索新的治療策略[12]。miRNA能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)并廣泛作用于多種生物學(xué)過(guò)程[13]，是目前自身免疫性疾病領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。研究表明，miRNA的異常表達(dá)與SS相關(guān)干眼的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[14-16]，明確miRNA的相關(guān)調(diào)控機(jī)制可以為疾病提供新的治療靶點(diǎn)和干預(yù)策略。miR-31-5p是一種高度保守的微小RNA，其基因位于染色體9p21.3位點(diǎn)。已有研究證明，miR-31-5p可以靶向抑制濾泡Th細(xì)胞中BTLA、SAP和CD40L等基因的表達(dá)，從而抑制其與B細(xì)胞的相互作用，是治療自身免疫性疾病的一個(gè)潛在靶點(diǎn)[17]。Johansson等[18]研究發(fā)現(xiàn)在SS患者T細(xì)胞中miR-31-5p表達(dá)水平顯著下調(diào)。本課題組前期研究結(jié)果表明，miR-31-5p在自身免疫性干眼模型兔淚腺和PBMC中表達(dá)顯著降低，提示miR-31-5p可能參與自身免疫性干眼的發(fā)生和發(fā)展[9]。本研究探討miR-31-5p過(guò)表達(dá)對(duì)兔自身免疫性干眼外周血Th17細(xì)胞的免疫調(diào)控作用，以期為探索自身免疫性干眼發(fā)病機(jī)制以及優(yōu)化治療方案提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

Th17細(xì)胞是一種表達(dá)特異性轉(zhuǎn)錄因子RORC和標(biāo)志性細(xì)胞因子IL-17的CD4+輔助T細(xì)胞亞群。RORC可以調(diào)控初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，是誘導(dǎo)IL-17分泌的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[19]；IL-17參與中性粒細(xì)胞的增生、成熟和遷移過(guò)程，加劇組織炎癥反應(yīng)[20]。研究表明，Th17細(xì)胞是介導(dǎo)自身免疫性干眼的主要致病細(xì)胞群[21]，與健康對(duì)照者相比，SS患者淚液中IL-17A、IL-6和IL-23等Th17相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)明顯上調(diào)[22]；IL-17A基因敲除可以有效改善實(shí)驗(yàn)性SS模型鼠的疾病癥狀和病理改變[23]。目前，越來(lái)越多的證據(jù)顯示miRNA可參與Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)，調(diào)控自身免疫性干眼的發(fā)生和發(fā)展[24]。例如，Wang等[25]研究發(fā)現(xiàn)miR-146a-5p在SS患者PBMC中表達(dá)顯著上調(diào)，并且通過(guò)負(fù)調(diào)控金屬蛋白酶17促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化。然而，在自身免疫性干眼中，miR-31-5p對(duì)Th17細(xì)胞的調(diào)控作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中觀察miR-31-5p在PBMC中過(guò)表達(dá)對(duì)兔自身免疫性干眼中外周血Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，miR-31-5p過(guò)表達(dá)后RORC及IL-17 mRNA表達(dá)下調(diào)；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示IL-17蛋白相對(duì)水平顯著降低，這說(shuō)明miR-31-5p過(guò)表達(dá)可能通過(guò)抑制兔自身免疫性干眼外周血Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)，參與自身免疫性干眼的發(fā)病進(jìn)程。

多項(xiàng)研究表明，免疫微環(huán)境參與調(diào)控Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)。其中，IL-6、IL-1β和IL-23是影響Th17細(xì)胞極化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，IL-6能夠通過(guò)抑制T細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)，解除其對(duì)RORγt的抑制作用，促進(jìn)Th17細(xì)胞活化[26]；IL-1β參與Th17細(xì)胞的早期分化，促進(jìn)Th17細(xì)胞的分泌功能[27-28]；IL-23則主要通過(guò)活化STAT3維持Th17細(xì)胞穩(wěn)定和分泌功能，加劇組織炎癥反應(yīng)[29]。近期研究表明，miRNA可以通過(guò)調(diào)控免疫微環(huán)境參與Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)。例如，Wei等[30]研究表明在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎中，樹(shù)突狀細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-223-3p可以顯著增強(qiáng)Th17極化相關(guān)細(xì)胞因子IL-23和IL-1β的分泌，進(jìn)而促進(jìn)致病性Th17細(xì)胞極化。Yan等[31]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用miR-155抑制劑治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎可以引起脾臟CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞分泌的Th17極化相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-23、IL-1β、TNF-α顯著降低，抑制Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)，緩解心臟損傷。本研究中結(jié)果顯示，miR-31-5p過(guò)表達(dá)組PBMC中Th17細(xì)胞極化相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和IL-23 mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯降低，提示miR-31-5p過(guò)表達(dá)可能創(chuàng)造了一個(gè)抑制Th17細(xì)胞極化的免疫微環(huán)境，進(jìn)而抑制了Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)。由于目前缺少I(mǎi)L-1β、IL-6和IL-23等商用抗兔的單克隆抗體，故本研究中僅對(duì)其mRNA水平進(jìn)行了檢測(cè)。

綜上所述，本研究表明miR-31-5p過(guò)表達(dá)可能通過(guò)下調(diào)免疫微環(huán)境中IL-6、IL-23、IL-1β等細(xì)胞因子的表達(dá)負(fù)向調(diào)控Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)，為進(jìn)一步探索miR-31-5p對(duì)自身免疫性干眼的保護(hù)作用及機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究?jī)H探討了在體外PBMC中miR-31-5p過(guò)表達(dá)對(duì)Th17細(xì)胞的免疫調(diào)控及部分機(jī)制，關(guān)于miR-31-5p如何影響Th17細(xì)胞極化以及在體內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-31-5p是否能夠抑制自身免疫性干眼的發(fā)病進(jìn)程，仍需進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明高敏：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析數(shù)據(jù)、起草文章；趙璐、陳思思：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施研究、文章修改；魏瑞華：參與選題、研究設(shè)計(jì)及文章定稿；粘紅：參與選題、研究設(shè)計(jì)、文章修改及定稿