張炳輝， 江銘婷， 鄭 敏

(福建醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院， 福州 350108)

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是一種神奇的小分子活性肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成。谷胱甘肽在生物體內(nèi)發(fā)揮解毒排毒和抗氧化等重要的作用。當前，對谷胱甘肽的合成代謝已較為明確，但對谷胱甘肽的分解代謝仍不明了。之前的研究認為，只有一種酶可以降解谷胱甘肽，即γ-谷胺酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyltransferase，GGT)。該酶定位于哺乳動物和細菌的質(zhì)膜上。因而，谷胱甘肽的降解長期以來一直被認為不會發(fā)生在細胞質(zhì)中。近年發(fā)現(xiàn)，一些可以在細胞質(zhì)內(nèi)降解谷胱甘肽的酶，例如酵母與真菌中的Dug酶(deficient in utilization of glutathione)和高等真核生物中的ChaC1。

最初，ChaC1基因由Aldons J.Lusis團隊于2006年在研究人主動脈內(nèi)皮細胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因時被發(fā)現(xiàn)，當時命名為MGC4504[1]。該團隊在2009年發(fā)現(xiàn)，哺乳動物中的MGC4504基因與細菌的cha操縱子(負責Ca2+和H+的逆向轉(zhuǎn)運)中的ChaC基因是同源物，故最終命名為ChaC1[2]。2012年，Kumar A研究團隊通過序列分析和生化實驗證實，ChaC1是哺乳動物中一類新的谷胱甘肽分解代謝酶[3]。

1 ChaC1基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特征

人的ChaC1基因位于15號染色體，而鼠的ChaC1基因位于2號染色體。人源ChaC1(NM_024111)是由4個外顯子，共222個氨基酸組成的25 kD的蛋白質(zhì)。人源ChaC1的mRNA有2種亞型,分別是isoform 1 (GenBank: NM_024111.3)和isoform 2 (GenBank: NM_001142776.1)。而鼠源ChaC1(GenBank: NM_026929)是由3個外顯子共223個氨基酸組成的25 kD的蛋白質(zhì)。到目前為止，鼠源ChaC1只有1種mRNA (GenBank: NM_026929.4)。

ChaC1基因的氨基酸序列高度保守。在哺乳動物和細菌之間，ChaC1的氨基酸序列約有30%同源性[2]。而人源和鼠源ChaC1的氨基酸序列則約有88%的相似性(Fig.1)。ChaC1蛋白質(zhì)包含1個從第30位氨基酸到第210位氨基酸的高度保守結(jié)構(gòu)域(ChaC樣結(jié)構(gòu)域)，該結(jié)構(gòu)域已在酵母蛋白質(zhì)At5g39720.1和大腸桿菌蛋白質(zhì)Ytfp中被解析[2]。ChaC1是γ-谷氨酰環(huán)轉(zhuǎn)移酶(γ-glutamylcyclotransferase，γ-GCT，GGCT)家族的一員，具有與其他GGCT家族成員相似的BtrG/γ-GCT折疊，該折疊的特征性結(jié)構(gòu)是擁有1個α螺旋圍繞的β桶形結(jié)構(gòu)[3]。

Fig.1 Amino acid sequence alignment between Homo sapiens and Mus musculus ChaC1 Human ChaC1 and mouse ChaC1 amino acid sequences are aligned with the basic local alignment search tool (BLAST). The alignment shows that human ChaC1 and mouse ChaC1 share a 88% similarity

2 ChaC1的催化活性

GGCT可以催化γ-谷氨酰氨基酸分解為5-氧脯氨酸(L-焦谷氨酸)和氨基酸。有趣的是，ChaC1作為GGCT家族成員，可以將還原型谷胱甘肽(GSH)分解成半胱氨酰甘氨酸(Cys-Gly)和5-氧脯氨酸(Fig.2)[3]，而不作用于氧化型谷胱甘肽(GSSG)。人源ChaC1蛋白的第115位谷氨酸或鼠源ChaC1蛋白的第116位谷氨酸突變，會導(dǎo)致ChaC1喪失降解谷胱甘肽的活性[3]。

Fig.2 Enzymatic activity of ChaC1 ChaC1 catalyzes degradation of glutathione and production of Cys-Gly and 5-oxoproline

2.1 ChaC1的底物

研究結(jié)果顯示，ChaC1的主要底物是還原型谷胱甘肽。體外研究發(fā)現(xiàn)，ChaC1還會分解某些特異的氨基酸與谷氨酸的γ羧基形成的氨酰鍵，例如ChaC1能分解γ-谷氨酰丙氨酸(γ-Glu-Ala)[4]。此外，ChaC1在有機硫營養(yǎng)缺陷型菌株中會特異地分解γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-Glu-Cys)，但它對甲硫氨酸與谷氨酸形成的γ-谷氨酰甲硫氨酸(γ-Glu-Met)缺乏活性[3]。體外研究發(fā)現(xiàn)，ChaC1分解谷胱甘肽的活性顯著高于γ-Glu-Ala、γ-Glu-Cys以及一些其他的γ-谷氨酰二肽，表明ChaC1對谷胱甘肽的親和性要高于γ-谷氨酰二肽[3]。

谷胱甘肽是活細胞內(nèi)含量最豐富的小分子硫醇化合物，其在細胞內(nèi)的濃度可以達到10 mmol/L。因為γ-谷氨酰鍵的存在，使得谷胱甘肽在細胞內(nèi)尤其穩(wěn)定[5]。在小鼠或大鼠的肝組織以及腎組織中，谷胱甘肽的半衰期是1～5 h[6,7]。除了少數(shù)原生動物，谷胱甘肽在真核生物中是必不可少的。在動植物胚胎期中，破壞谷胱甘肽的合成會導(dǎo)致其胚胎期死亡[8, 9]。谷胱甘肽在清除自由基、維持細胞氧化還原平衡和調(diào)節(jié)細胞存活等方面發(fā)揮重要作用。原先認為，谷胱甘肽參與的γ-谷氨酰循環(huán)，能夠促進氨基酸通過質(zhì)膜運輸，但是近期研究發(fā)現(xiàn)，其作用并不明顯[5]。

2.2 ChaC1催化反應(yīng)的產(chǎn)物

ChaC1催化還原型谷胱甘肽分解成Cys-Gly和5-氧脯氨酸[3]。Cys-Gly被二肽酶降解成游離的Cys和Gly，隨后被細胞再利用。而另一種產(chǎn)物5-氧脯氨酸的積累通常導(dǎo)致新生兒低血糖、小細胞低色素性貧血和智力障礙[10]。2017年，Peter van der Meer研究團隊在心衰動物模型中研究發(fā)現(xiàn)，編碼5-氧脯氨酸酶(5-oxoprolinase，OPLAH)的基因表達水平下降，導(dǎo)致5-氧脯氨酸的含量增加，進而引起氧化應(yīng)激[11]；體外給予心肌細胞5-氧脯氨酸也得到了相似的結(jié)果[12]。該團隊又繼續(xù)對535位急性心衰患者進行了檢測，發(fā)現(xiàn)在心衰患者的血液中5-氧脯氨酸的含量與患者預(yù)后較差有關(guān)[12]。

3 ChaC1的表達及其調(diào)控

3.1 ChaC1基因表達的空間特異性

ChaC1基因在小鼠的心血管，腦，肝組織以及卵巢組織中均有表達[13]，主要定位于細胞質(zhì)內(nèi)[2]。通過對HEK293細胞以及來自胚胎期14.5 d的原代神經(jīng)元前體培養(yǎng)物進行高分辨率共聚焦免疫組化觀察，發(fā)現(xiàn)ChaC1蛋白與反式高爾基體標記物(TGN38)共定位，而不是與順式高爾基體標記物(GM130)共定位，說明ChaC1蛋白可能定位在胞質(zhì)中的反式高爾基體上[13]。

3.2 ChaC1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

目前研究較為明確了ChaC1基因的轉(zhuǎn)錄因子是激活轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4, ATF4)，它能識別并結(jié)合ChaC1基因啟動子上的ATF/cAMP響應(yīng)元件(ATF/cAMP response element，CRE)、ATF/CRE修飾(ATF/CRE modifier，ACM)元件和CEBP-ATF響應(yīng)元件(CEBP-ATF response element，CARE)。其中，CRE是ATF4調(diào)控ChaC1基因表達的關(guān)鍵序列(Fig.3)[14]。在過表達Cyp2e1基因的肝癌細胞株HepG2中，用乙醇處理后會引起ChaC1基因表達水平升高。同時也發(fā)現(xiàn)，ATF4基因表達水平升高[15]。另外的研究使用青蒿琥酯(artesunate)處理CA-46細胞株(人Burkitt’s淋巴瘤細胞)，發(fā)現(xiàn)ChaC1的mRNA被顯著誘導(dǎo)，相應(yīng)地ATF4基因表達上調(diào)[16]?；蚯脺pATF4，可阻斷上述藥物對ChaC1基因的誘導(dǎo)作用，提示在上述應(yīng)激反應(yīng)中，ATF4基因參與ChaC1基因的誘導(dǎo)表達。

Tribbles假激酶3(tribbles pseudokinase 3，TRIB3)，可被亞砷酸鹽誘導(dǎo)表達。其高表達會抑制ChaC1蛋白表達水平，從而使得細胞內(nèi)存在一個較高含量的谷胱甘肽。有意思的是，ATF4基因可直接激活TRIB3和ChaC1基因的表達。這提示，TRIB3基因可能是ATF4基因誘導(dǎo)ChaC1基因表達的負調(diào)控機制[17](Fig.3)。

Fig.3 Regulation of ChaC1 expression by ATF4 and TRIB3 ATF4 directly binds to the promoters of ChaC1 on ATF/CRE, ACM and CARE sites to activate ChaC1 transcription. Meanwhile, TRIB3 could also be induced by ATF4 and suppresses the ChaC1 transcription, serving as a negative feedback of ATF4-mediated ChaC1 expression. (TSS：transcription start site)

在神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤中，Temozolomide(一種臨床用于治療神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤的藥物)可以通過JNK1/c-Jun誘導(dǎo)ChaC1基因表達上調(diào)[18]。ChaC1基因還會在氨基酸缺乏[19]、癌癥[20,21]、糖尿病腎病炎癥[22]、病毒或細菌感染[23,24]、神經(jīng)生長發(fā)育[13]、動脈粥樣硬化、肝代謝[15,25]以及視網(wǎng)膜軸突損傷[26]中表達上調(diào)。然而，熱激或者短暫的紫外(UV)線照射，并不能引起ChaC1的mRNA表達上調(diào)。

3.3 ChaC1蛋白的降解

蛋白酶體抑制劑MG132可以顯著增加細胞內(nèi)ChaC1蛋白的穩(wěn)定性。在應(yīng)用轉(zhuǎn)錄抑制劑——放線菌酮(cycloheximide，CHX)處理細胞時，ChaC1蛋白含量呈現(xiàn)劑量依賴性下降；而用CHX和MG132共處理時，細胞內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)ChaC1蛋白含量降低。這表明，ChaC1蛋白的降解依賴于蛋白酶體。然而，將ChaC1基因與泛素分子共同轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)ChaC1蛋白確實可以和泛素分子結(jié)合，但是結(jié)合了泛素分子的ChaC1蛋白在細胞內(nèi)更穩(wěn)定。所以，細胞內(nèi)ChaC1蛋白的降解可能是通過非泛素依賴的蛋白酶體降解途徑進行的[27]。

4 ChaC1的功能

4.1 ChaC1在個體發(fā)育中的作用

在斑馬魚中，將ChaC1基因敲除會引起斑馬魚死亡。且回補實驗證實，野生型ChaC1基因可逆轉(zhuǎn)上述表型[28]。同樣，在小鼠中，ChaC1基因的敲除也會導(dǎo)致小鼠胚胎期死亡[29,30]。這說明了ChaC1基因在個體生長發(fā)育中發(fā)揮了極其重要的功能。

在小鼠的神經(jīng)發(fā)育過程中，ChaC1被鑒別為一種明顯上調(diào)的蛋白質(zhì)。當Notch1的第1 669位點的谷氨酸中的γ-羧基結(jié)合了甘氨酸后，ChaC1便可以發(fā)揮GGCT酶活性，將甘氨酸從谷氨酸上移除，從而抑制了蛋白酶對Notch1蛋白的剪切，進而抑制Notch1的初始成熟過程，使得Notch1處于未成熟狀態(tài)，最終阻礙了Notch1信號通路和神經(jīng)發(fā)育[4,13]。當然，這種說法還是頗具爭議的，因為蛋白質(zhì)上的谷氨酸缺乏具有去質(zhì)子化的游離的α-氨基，因此還需要更多的證據(jù)來證明這一觀點[31]。

4.2 ChaC1在細胞應(yīng)激與死亡中的作用

志賀氏菌屬(Shigella)感染細胞時會導(dǎo)致細胞膜通透性增加。其導(dǎo)致細胞處于氨基酸(尤其是亮氨酸、異亮氨酸、半胱氨酸)缺乏的狀態(tài)，從而激活GCN2-eIF2-ATF4-ChaC1信號通路，進而引起細胞自噬[19](Fig.4)。在使用鐵死亡激活劑Erastin，或臨床抗癌藥物Sorafenib處理纖維肉瘤HT-1080細胞株時，細胞的Xc-系統(tǒng)(非Na+依賴性逆向轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì))明顯被抑制，導(dǎo)致細胞內(nèi)的半胱氨酸含量下降，最終激活了ChaC1并引起細胞鐵死亡[32](Fig.4)。在三陰性乳腺癌細胞中，胱氨酸缺乏導(dǎo)致細胞內(nèi)的谷胱甘肽含量降低，超氧化物(reactive oxygen species, ROS)含量升高。這一現(xiàn)象引起了細胞內(nèi)的綜合應(yīng)激反應(yīng)(integrated stress response，ISR)，從而激活了GCN2-eIF2-ATF4-ChaC1信號通路，進而引起了細胞死亡。在三陰性乳腺癌細胞系中，敲減ChaC1基因或者補充谷胱甘肽，可以降低因胱氨酸缺乏而導(dǎo)致的細胞死亡[33]。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽，ChaC1能分解谷胱甘肽產(chǎn)生半胱氨酰甘氨酸二肽和5-氧脯氨酸。所以上述現(xiàn)象提示，氨基酸缺乏誘導(dǎo)ChaC1基因表達并分解谷胱甘肽，為細胞提供氨基酸(Fig.4)。同時這也引起了谷胱甘肽水平的下降和ROS的升高，從而誘發(fā)了細胞的死亡。

Fig.4 The role of ChaC1 in cell death Shigella, erastin or sorafenib-induced amino acid starvation activates the GCN2 kinase, which phosphorylates eukaryotic initiation factor 2α, leading to activation of the ATF4-ChaC1 pathway. The upregulation of ChaC1 depletes GSH, increases intracellular ROS and finally results in cell death

在HEK293細胞系中，ChaC1基因過表達會引起凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)和多聚ADP核糖聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase，PARP)轉(zhuǎn)位到細胞核，剪切DNA并最終導(dǎo)致細胞凋亡。有趣的是，高表達ChaC1基因的細胞并未發(fā)現(xiàn)胱天蛋白酶3(caspase-3)蛋白的激活。這一結(jié)果說明，在HEK細胞系中，ChaC1基因的高表達誘導(dǎo)細胞死亡并不依賴于胱天蛋白酶3信號通路[2]。但是，在神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤中，ChaC1基因高表達可以激活胱天蛋白酶3/9信號通路[18]。這一現(xiàn)象說明了在不同的細胞系中，ChaC1基因引起細胞死亡的方式不同。

4.3 ChaC1在腫瘤中的作用

幽門螺桿菌感染胃壁細胞過程中，ChaC1基因高表達，這被認為與幽門螺桿菌誘導(dǎo)胃壁細胞突變和胃癌發(fā)生有關(guān)[34]。在人乳腺癌細胞株(Hs578 T)中，敲減ChaC1基因會減弱細胞的遷移和增殖[20]。此外，在乳腺癌患者和卵巢癌患者病人中，ChaC1的mRNA水平與腫瘤復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險呈正相關(guān)。在葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma，UM)和腎透明腎細胞癌(kidney renal clear cell carcinoma，KIRC)患者中也發(fā)現(xiàn)，ChaC1的mRNA高表達與預(yù)后差成正相關(guān)[35,36]。這些研究均提示，ChaC1的mRNA水平很有可能是腫瘤患者預(yù)后的一個重要指標。

5 問題與展望

近些年，隨著ChaC1基因研究的不斷深入，人們對于谷胱甘肽的分解代謝過程及其在細胞生長、存活、應(yīng)激和個體發(fā)育中的作用逐步有所了解，但仍有許多未解之謎。盡管大量研究顯示，ChaC1基因受外界刺激誘導(dǎo)表達，但ChaC1在上述刺激物致病機制中的作用仍不明了。主要的原因是由于無法獲得ChaC1基因全身敲除的小鼠。因而，構(gòu)建ChaC1條件性基因敲除小鼠，結(jié)合各種疾病的小鼠模型，可進一步解析ChaC1基因的病理生理功能。此外，目前的觀點認為，ChaC1主要是通過耗竭谷胱甘肽來發(fā)揮作用，往往忽略了其催化產(chǎn)物5-氧脯氨酸的作用。有趣的是，臨床上會出現(xiàn)5-氧脯氨酸血癥(5-oxoprolinemia)[37]。ChaC1是否與之有關(guān)有待研究。最后，ChaC1是哺乳動物體內(nèi)細胞質(zhì)中谷胱甘肽分解代謝通路的關(guān)鍵基因，它在體內(nèi)的生理和病理功能的深入研究將有助于人們了解谷胱甘肽分解代謝異常在疾病中的作用，為解析相關(guān)疾病的發(fā)病機制及尋找治療策略提供新思路。