洪 婷， 梅子青， 王 豐*

(1)北京理工大學生命學院，分子醫(yī)學與生物診療工業(yè)和信息化部重點實驗室， 北京 100081；2)北京科技大學化學與生物工程學院，北京 100083)

基因轉(zhuǎn)錄是指RNA聚合酶以DNA雙鏈中的一條鏈(無義鏈)為模板，以核苷三磷酸(ATP、GTP、CTP和UTP)為底物，通過堿基互補配對原則合成核糖核苷酸(RNA)過程[1-4]?；蜣D(zhuǎn)錄對于延續(xù)及維持生命活動極為重要，始終受到機體的嚴格調(diào)控[5, 6]?；蜣D(zhuǎn)錄主要包括起始、延伸和終止3個過程[4]。起始是指RNA聚合酶全酶(holoenzyme)結(jié)合在啟動子區(qū)域，形成啟動子-聚合酶復合物，打開DNA雙鏈形成轉(zhuǎn)錄泡，并以無義鏈為模板，按照5′—3′方向啟動合成RNA的過程。延伸是指RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始合成10 nt左右RNA后進行的延伸反應。RNA聚合酶全酶在此過程中需要解開下游的DNA雙鏈，并使后方的DNA恢復雙鏈狀態(tài)。終止是指轉(zhuǎn)錄完成前，RNA聚合酶全酶合成一段能形成特定結(jié)構的核苷酸序列，使轉(zhuǎn)錄停止、釋放RNA的過程[4]。

RNA聚合酶全酶是基因轉(zhuǎn)錄的主要承擔者，其亞基組成極為保守。原核細胞的RNA聚合酶全酶由RNA聚合酶核心酶(core RNA polymerase，RNAP)及可變的sigma因子組成，其中RNAP由5個固定亞基α1、α2、β、β′和ω組成[7, 8]，sigma因子則多種多樣。由于不同類型的sigma因子對應著不同基因的啟動子，所以RNAP結(jié)合不同sigma因子后會選擇性啟動其對應基因的轉(zhuǎn)錄[9-11]。

Sigma因子根據(jù)功能不同主要分為2類：一類為sigma70，識別啟動子-35 ～-10區(qū)域，主要輔助RNAP催化管家基因的自發(fā)轉(zhuǎn)錄[12, 13]；另一類為sigma54，識別啟動子-24 ～-12區(qū)域，主要輔助細菌中響應環(huán)境脅迫信號及代謝信號相關基因的轉(zhuǎn)錄[10, 14-17]。sigma54依賴的基因轉(zhuǎn)錄不能自發(fā)起始，需在感知到外界脅迫及代謝信號后才能啟動[13, 18]。感受外界信號并將其傳遞給sigma因子的蛋白質(zhì)為細菌增強子激活蛋白質(zhì)(bacterial enhancer binding protein，bEBP)，在接收到特定脅迫或者代謝信號后，結(jié)合在啟動子上游UAS(upstream activating sequence)的bEBP會與RNA聚合酶全酶相互作用[19, 20]，進而解除sigma54對RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄抑制，打開DNA雙鏈，激活下游基因轉(zhuǎn)錄[21, 22]。

近年來，對原核細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的研究大多都聚焦在起始階段，尤其是bEBP和sigma54因子所參與的基因轉(zhuǎn)錄[7]。一些關鍵的結(jié)構生物學證據(jù)已經(jīng)部分揭示出sigma54抑制RNAP、bEBP蛋白解除sigma54對RNAP的抑制，以及促進啟動子DNA雙鏈打開等不同轉(zhuǎn)錄起始階段的分子機制。本文從結(jié)構生物學角度詳述由bEBP和sigma54激活的基因轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控機制的進展。

1 Sigma54因子與轉(zhuǎn)錄起始

Sigma54是細胞內(nèi)響應脅迫信號和代謝信號的轉(zhuǎn)錄因子，由3個保守區(qū)域RⅠ、RⅡ和RⅢ組成(Fig.1)。其中，RⅠ由N端2個α螺旋構成，1～56位氨基酸，主要負責與DNA、bEBP及RⅢ的ELH結(jié)構域相互作用[23]；RⅡ由57～120位氨基酸組成，序列保守性較差，在轉(zhuǎn)錄起始的部分階段中占據(jù)了DNA及DNA/RNA通道[24]；RⅢ由121～477位氨基酸組成，由CBD、ELH-HTH和RPoN3個結(jié)構域構成。其中CBD是sigma54與RNAP相互作用的主要區(qū)域[25]；RPoN結(jié)構域負責與啟動子DNA的-24位點相互作用[26, 27]；這2個結(jié)構域中間有一段長螺旋結(jié)構(extra-long helix, ELH)，其C端緊跟著螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-turn-helix, HTH)結(jié)構域，HTH結(jié)構域結(jié)合在DNA的-12位點[1, 22, 28]。

Fig.1 Structural domain of sigma54 Structure of sigma54 derives from the structure of holoenzyme (PDB:5BYH)[1]

最近，一系列結(jié)構生物學研究揭示了sigma54依賴的基因轉(zhuǎn)錄起始過程中的部分復合物結(jié)構[1](Fig.2)，包括：RNA聚合酶全酶、封閉式復合物(RNA polymerase closed complex，RPc)、中間復合物(RNA polymerase intermediate complex，RPi)、DNA部分裝載的中間復合物(intermediate partially loaded DNA complex，RPip)和開放式啟動子復合物(RNA polymerase open complex，RPo)，這些結(jié)構解析了由bEBP激活的sigma54依賴性基因轉(zhuǎn)錄起始過程的關鍵步驟。

Fig.2 Process of transcription initiation[1] There are five structures of the transcription initiation process, which are holoenzyme (PDB:5BYH), RNA polymerase closed complex RPc (PDB:5NSR), RNA polymerase intermediate complex RPi (PDB:5NSS), intermediate partially loaded DNA complex RPip (PDB:6GH6) and RNA polymerase open complex RPo(PDB:6GH5)

1.1 結(jié)合sigma54因子的RNA聚合酶全酶

RNA聚合酶全酶由5個核心酶亞基α1、α2、β、β′和ω以及sigma54因子組成。通過組裝來自肺炎克雷伯菌的sigma54因子與大腸桿菌RNAP的5個亞基(α1、α2、β、β′和ω)以及28bp的啟動子DNA片段。研究者制備并解析了分辨率為3.76?的RNA聚合酶全酶冷凍電鏡結(jié)構[24]。結(jié)果正如Fig.3A所示，sigma54整體位于RNAP上方，鉤子狀的sigma54-RI與ELH位于RNAP裂隙正上方，RII.1的2個α螺旋占據(jù)了RNAP的DNA通道；由無規(guī)卷曲組成的sigma54-RII.2 和RII.3包埋在RNAP內(nèi)部的RNA通道位置[29]。由2個α螺旋亞結(jié)構域組成的sigma54-CBD分別與RNAP的β翼(β flap 835～937位氨基酸)、β的C端(1 267～1 320位氨基酸)、β′拉鏈(β′ zipper 35～100位氨基酸)、β′對接結(jié)構域(β′ docking domain 370～420位氨基酸)以及α亞基的C端(282～308 位氨基酸)區(qū)域發(fā)生明顯的相互作用[29]。RI的α1螺旋位于ELH結(jié)構域上方，并與其相互作用，擋在了RNAP裂隙上方[28, 29]。sigma54的C端的RPoN結(jié)構域與sigma54的其他結(jié)構域，以及RNAP并未發(fā)生相互作用[22, 29]。盡管在制樣時添加了DNA，但在此結(jié)構中未發(fā)現(xiàn)任何DNA密度。

Fig.3 Structural comparison of RPc with holoenzyme (A) In holoenzyme, sigma54-CBD binds to RNAP, and RII.1 is in the crack. (B) The DNA in RPc is twisted and interacts with sigma54-RPoN, HTH and RI. (C) Comparison between RPc and holoenzyme: RPoN turns, C-terminal of α subunit of RNAP is lost and RII.1 is unseen in RPc

1.2 封閉式復合物(RPc)

RPc是RNA聚合酶全酶結(jié)合啟動子DNA的轉(zhuǎn)錄起始早期狀態(tài)。通過組裝來自肺炎克雷伯菌的sigma54、大腸桿菌的RNAP及苜蓿中華根瘤菌的固氮酶啟動子DNA(-35—+28、其中-12/-11錯配)獲得封閉式復合物，并解析了分辨率為3.0 ?的冷凍電鏡結(jié)構[22]。將RPc與RNA聚合酶全酶進行結(jié)構對比(Fig.3)可得出如下信息：(1)sigma54-RI 是抑制RNAP轉(zhuǎn)錄起始的關鍵區(qū)域，位于DNA進入RNAP裂隙的入口處。在RPc中，sigma54-RI通過與sigma54-ELH發(fā)生相互作用，使得sigma54在RNAP裂隙上方形成空間位阻，阻礙DNA進入RNAP裂隙。已有的生化實驗顯示，將sigma54-RI刪除或者將sigma54-ELH中336位Arg突變?yōu)锳la，在預先形成轉(zhuǎn)錄泡的情況下，不需要bEBP的參與，即能自發(fā)起始轉(zhuǎn)錄[26, 29]。在RPc中，sigma54被鎖定在裂隙上方，由β和β′亞基的鉗子部分組成的RNAP裂隙處最窄只有15 ?，無法容納A型(直徑25.5 ?)、B型(直徑23.7 ?)和Z型(直徑18.4 nm)等任何雙鏈DNA的進入。與RNA聚合酶全酶不同，RPc中未觀察到sigma54-RII.1占據(jù)在RNA聚合酶的裂隙中。(2)由于裂隙不能容納DNA，在RPc中僅能看到sigma54因子與DNA相互作用；RPoN結(jié)構域相較于RNA聚合酶全酶發(fā)生了約60°的順時針旋轉(zhuǎn)，結(jié)合在DNA的-24處；sigma54-HTH與-12處DNA相互作用；sigma54-RI與-12下游處DNA也存在相互作用；位于HTH和RI之間的sigma54-ELH剛性結(jié)構會使DNA伸展，導致-12下游的DNA小溝明顯變寬，產(chǎn)生不同于B型DNA的扭曲(Fig.3B，3C)。(3)sigma54中主要的RNAP結(jié)合結(jié)構域CBD位于RNA出口處。原本在RNA聚合酶全酶中與CBD相互作用的α亞基C端，在RPc中因密度低而不可見，可能是因為結(jié)構變化導致相互作用喪失。而CBD與RNAP的β、β′亞基相互作用，依然擋在RNA出口[22]?？傊摻Y(jié)構顯示，在RPc結(jié)構中，sigma54對轉(zhuǎn)錄起始有明顯的抑制作用，主要是因為RI通過與ELH相互作用擋在了RNAP裂隙上方，阻止了DNA進入；在HTH、RI及ELH的作用下，DNA已經(jīng)開始發(fā)生扭曲[2]。

1.3 中間復合物(RPi)

RPi是指RPc向開放式啟動子復合物過渡的中間狀態(tài)，稱為中間復合物。已有生化實驗證明，在ADP·AlFx(ATP水解過渡態(tài)類似物)存在時，bEBP與sigma54相互作用較強[30]。據(jù)此，在有ADP·AlFx條件下，將PspF(1種bEBP)與RNA聚合酶全酶及啟動子DNA組裝成RPi復合物，并解析了分辨率為5.8 ?的冷凍電鏡結(jié)構[22]。結(jié)果正如Fig.4A所示，在RPi結(jié)構中，不對稱的6聚體 PspF位于RNA聚合酶全酶和DNA的上方，與DNA以及sigma54直接相互作用。其中，PspF的L1/L2 環(huán)分別與-24 — -12間的DNA骨架及-12下游的溝槽相互作用。sigma54-RⅠ是sigma54中與PspF相互作用的主要區(qū)域。在RPi中，sigma54-RⅠ的α1區(qū)域密度更清晰，長度較RPc明顯增長，并向上旋轉(zhuǎn)，與PspF的L1/L2環(huán)相互作用，形成楔子形結(jié)構插在DNA雙鏈中，幫助穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄泡形成，進而撬動DNA鏈分離(Fig.4B)[22]。與RPc相比，RPi中sigma54-RⅠ與ELH相互作用的區(qū)域隨著RⅠ的旋轉(zhuǎn)發(fā)生了位置改變，導致兩者不再完全阻擋在RNAP裂隙上方，同時DNA也隨ELH發(fā)生了偏移；RNAP裂隙頂部比在RPc中拓寬15 ?左右，更加有利于雙鏈DNA進入通道。此外，在RPi中，CBD結(jié)構域上移與RPoN相互作用，不再阻擋RNA出口。綜上，在RPi中，sigma54對轉(zhuǎn)錄起始的抑制作用已經(jīng)被bEBP基本解除[22]。但轉(zhuǎn)錄的最終啟動還需要進一步打開DNA鏈，形成轉(zhuǎn)錄泡，并將DNA載入RNAP裂隙的活性位點處。PspF可與DNA和sigma54分別相互作用，暗示著PspF等bEBP蛋白極有可能利用其水解ATP釋放的能量來改變與其相互作用的sigma54及啟動子DNA區(qū)域的雙鏈構象，以解除sigma54對RNAP的抑制，并解開DNA雙鏈，最終激活轉(zhuǎn)錄起始。

Fig.4 Structural comparison of RPi with RPc (A) PspF hexamer interacts with DNA and sigma54. (B) Comparison between RPi and RPc: The α1 of RI stretches, rotates and interacts with L1/L2 of PspF, as does DNA; ELH and DNA also shift with a certain degree, and the gap expands; CBD moves upward

1.4 DNA部分裝載的中間復合物(RPip)

RPip是指部分DNA裝載的起始復合物的中間狀態(tài)。已有研究表明，在預先形成轉(zhuǎn)錄泡的情況下，將sigma54-ELH中336位Arg(R)突變?yōu)锳la(A)，轉(zhuǎn)錄起始不再需要bEBP的參與即能自發(fā)進行[26, 29]。據(jù)此，將肺炎克雷伯菌的sigma54-ELHR336A突變體與非模板鏈上-10 — -1位完全錯配的苜蓿中華根瘤菌啟動子DNA及大腸桿菌RNAP進行組裝，捕獲到了DNA部分裝載中間復合物即RPip，并解析出其4.1 ?分辨率的冷凍電鏡結(jié)構[31]。在引入ELHR336A突變及DNA錯配的RPip結(jié)構中，sigma54的RPoN與HTH的相對位置與RPc、RPi中類似，仍分別結(jié)合在DNA的-24位點和-12位點(Fig.5A)。但相較于RPi，RPip中的sigma54和DNA的整體結(jié)構發(fā)生順時針旋轉(zhuǎn)，向RNAP裂隙偏移(Fig.5C)。值得注意的是，RPip中的RNAP裂隙比RNA聚合酶全酶、RPc和RPi中更寬闊(約56 ?)(Fig.5A，B)。與RPi相比，RPip中的DNA在-10位置發(fā)生了約30°扭轉(zhuǎn)，導致-10 — -1的DNA夾在sigma54-ELH與β葉(372～375)和β′卷曲之間。來自β葉(β lobe)(372～375)的Phe、Gly、Glu和Phe(PGEP)4個氨基酸同β′卷曲及其周圍帶有大量正電荷的結(jié)構域，通過相互作用來穩(wěn)定-10 — -1 DNA，引導DNA進入RNAP裂隙的下游DNA通道中。此外，在RPip中，ELH變短，且密度缺失，暗示ELH可能因不再與RⅠ相互作用，在DNA裝載過程中發(fā)生了構象變化(Fig.5C)。

Fig.5 Structural comparison of RPip with Rpi (A) The DNA in RPip is partially loaded, and a 30° twist is generated. (B) The cleft in RPip is further enlarged compared to RPi. (C) Compared with RPi, RPip rotates clockwise with ELH-HTH, RPoN and DNA; and the ELH domain becomes shorter

1.5 開放式啟動子復合物(RPo)

在RPo中，局部解鏈的啟動子DNA結(jié)合在RNAP裂隙中，RNAP裂隙關閉。RPo與上述RPip在同一樣品中獲得，分辨率為3.4 ?(Fig.6)。在RPo中，RNAP裂隙再次關閉，恢復到與RPc同等寬度(Fig.6B)。sigma54-ELH相較于RPip中變得更長且發(fā)生彎折，插入到NT(非模板鏈)和T(模板鏈)之間，將DNA雙鏈在-11處打開(Fig.6C)，這與sigma70依賴的基因轉(zhuǎn)錄起始過程明顯不同。在sigma70依賴的基因轉(zhuǎn)錄開放復合物中，RPo依靠sigma70中保守的Trp來穩(wěn)定-11位的核苷酸[32, 33]。結(jié)果正如Fig.6A所示，RPo中形成的轉(zhuǎn)錄泡含有13個單鏈DNA核苷酸(-11 — +2)以及1個雙鏈DNA核苷酸對(+3)。其中，非模板鏈NT位于sigma54-ELH上方，沿著由β葉和β′卷曲形成的含大量帶正電氨基酸的通道放置，而模板鏈T則處于β亞基(538～543)、β′卷曲環(huán)(318～323) 和sigma54-RII.3 (107～112) 構成的“隧道”中。與sigma54-CBD相連的sigma54-RII.3(107～112)含有較多酸性氨基酸，可能參與引導RNA從RNA出口釋放[29]。sigma54-CBD在RPo中的位置與RPc中相同，也擋在RNA出口處。此外，在轉(zhuǎn)錄泡下游雙鏈解開的位置，+2NT插入到β亞基的疏水口袋中，+1NT與β亞基的183位Trp發(fā)生疏水相互作用，這與sigma70依賴的基因轉(zhuǎn)錄中的開放式復合物十分相似[33]。

Fig.6 Structural comparison of RPo with Rpip (A)The transcription bubble is formed in RPo, and the ELH is inserted into the DNA double strand to stabilize the transcription bubble. (B) Compared to RPip, the cleft in RPo is closed again. (C) Compared with RPip, ELH in RPo bends and extends

1.6 Sigma54依賴性基因轉(zhuǎn)錄起始的裝載-解鏈耦聯(lián)模型

通過比較RPip和RPo兩個狀態(tài)的結(jié)構，英國帝國理工大學張曉東課題組提出了sigma54依賴性轉(zhuǎn)錄中DNA裝載和轉(zhuǎn)錄泡打開過程的分子機制模型[1]。結(jié)構證據(jù)顯示，RPip到RPo的轉(zhuǎn)變是由β′鉗繞夾鉗底部旋轉(zhuǎn)22°引發(fā)，這一旋轉(zhuǎn)導致與DNA鏈相互作用的β′螺旋線圈向下推動，由此產(chǎn)生的擠壓力迫使DNA雙鏈解開，并將DNA加載到裂隙的活性部位中。簡而言之，夾鉗閉合會導致DNA同步解鏈及最終裝載，即裝載與解鏈耦合機制[31, 34, 35]。該模型與sigma70依賴的基因轉(zhuǎn)錄起始過程類似，但與sigma70依賴性轉(zhuǎn)錄的“先解鏈、后裝載”模型以及“先裝載、后解鏈”模型明顯不同[36]。

2 bEBP的結(jié)構與功能

bEBP是sigma54依賴性基因轉(zhuǎn)錄起始的激活蛋白質(zhì)，通常含有3個結(jié)構域：N-端調(diào)節(jié)結(jié)構域、中間的AAA+結(jié)構域和C端DNA結(jié)合結(jié)構域。其中調(diào)節(jié)結(jié)構域可通過結(jié)合配體(各種脅迫信號分子或代謝信號分子)、被磷酸化修飾或者與其他蛋白質(zhì)相互作用等來調(diào)控bEBP的活性；AAA+結(jié)構域負責bEBP的寡聚化、水解ATP分子及通過對sigma54進行結(jié)構重塑來激活轉(zhuǎn)錄[37]；DNA結(jié)合結(jié)構域主要負責結(jié)合啟動子上游的增強子(enhancer/UAS-upstream activating sequence)，幫助bEBP靠近結(jié)合在啟動子區(qū)域的RNA聚合酶全酶[38]。并不是所有bEBP都同時包含這3個結(jié)構域，有的bEBP缺少調(diào)節(jié)結(jié)構域，有的bEBP缺少DNA結(jié)合結(jié)構域，有的bEBP例如FleT甚至會同時缺失調(diào)節(jié)結(jié)構域和DNA結(jié)合結(jié)構域，暗示bEBP生物功能在進化過程中分化出多樣性[39-41]。根據(jù)生物功能和調(diào)控模式的不同，bEBP可分為5類(Table 1)[2, 42]。

Table 1 bEBP protein classification and domain composition[2]

2.1 bEBP的AAA+結(jié)構與功能

位于bEBP序列中間的AAA+結(jié)構域是AAA超家族(ATPases associated with diverse cellular activities superfamily, AAA)成員的特征性結(jié)構域[43]。該家族成員大多借助于AAA+結(jié)構域形成寡聚體，并通過水解ATP參與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解、膜融合、DNA復制、微管運輸以及轉(zhuǎn)錄激活等多種生命事件[43, 44]。

經(jīng)典的AAA+結(jié)構域含有7個保守區(qū)域：C1-C7[45]。PspF、NtrC及ZraR等bEBP蛋白的晶體結(jié)構表明，bEBP可通過AAA+結(jié)構域以寡聚環(huán)狀形式組裝在一起來執(zhí)行功能[30, 46-48]，常以六聚或七聚狀態(tài)發(fā)揮活性[42]。寡聚化對于bEBP激活轉(zhuǎn)錄起始十分重要[49]。每1個AAA+結(jié)構域單體都含有1個α/β亞結(jié)構域和1個小的α螺旋亞結(jié)構域[49]。ATP結(jié)合位點位于寡聚物中相鄰2個單體的裂隙[48]。AAA+結(jié)構域含有2個重要的基序：Walker A和Walker B。Walker A負責結(jié)合ATP[43]，其保守序列GxxxxGK(T/S，AAA蛋白中Walker A 序列后保守的絲/蘇氨酸在EBP蛋白中全都變成了天冬/谷氨酸)形成的P-loop可與ATP分子的磷酸基團相互作用[50]，是bEBP蛋白結(jié)合ATP分子的必要條件[51, 52]。Walker B基序負責水解ATP，其保守序列為hhhhDE (h為疏水氨基酸)。Walker B是bEBP蛋白水解ATP分子所必須的基序，其保守的Asp在水解核苷酸時，負責螯合鎂離子[51, 52]。除了Walker A和Walker B外，AAA+結(jié)構域還含有sensor I 和sensor II 兩個重要保守區(qū)域，分別位于C6和C7[53]。sensor I上保守的Thr可通過1個水分子與Walker B中的Glu相互作用，推測與bEBP蛋白水解ATP分子引起L1、L2 loop的構象變化有關[54]。sensor II位于小α亞結(jié)構域的第3個α螺旋，推測與核苷酸結(jié)合有關，其附近的精氨酸手指(arginine finger)參與了ATP水解驅(qū)動的構象變化[43, 49, 53, 55-57]。在相鄰亞基間隙形成的ATP水解空腔中，一個亞基的精氨酸手指會伸入相鄰亞基的活性位點，與ATP的γ-磷酸基團相互作用[58]。綜上，AAA+結(jié)構域的寡聚化可幫助形成水解ATP分子的空腔，而ATP水解導致的構象變化對于bEBP發(fā)揮作用十分重要。

除了含有AAA+結(jié)構域的常規(guī)特征外，bEBP蛋白的AAA+結(jié)構域還有2段額外的插入序列，在AAA+結(jié)構域上形成2個暴露在外的無規(guī)卷曲環(huán)，命名為L1和L2。其中L1插在C3的C端，是bEBP蛋白的AAA+結(jié)構域中一段保守的無規(guī)卷曲環(huán)，其保守序列為GAFTGA，位于α/β亞結(jié)構域[49, 53]；L2插在C5和C6之間[42]。因此，在AAA+結(jié)構域因水解ATP發(fā)生構象變化時，L1和L2 loop很可能會發(fā)生位置變化，引發(fā)相應的生理事件。

2.2 bEBP的谷氨酸開關模型

bEBP蛋白能夠在結(jié)合與水解ATP分子的過程中，與sigma54發(fā)生相互作用，引發(fā)sigma54和RNAP構象重塑，進而啟動轉(zhuǎn)錄。研究表明，在結(jié)合ADP·AlFx時，bEBP的L1從朝向環(huán)中心轉(zhuǎn)變?yōu)橄蚬丫刍钠矫嫱馍煺?，并通過L1 loop上的GAFTGA與sigma54維持穩(wěn)定的相互作用[30, 49, 53]。這種構象變化可用bEBP蛋白的“谷氨酸開關”模型加以解釋[2]。以PspF(1～275)為例，Walker A在結(jié)合不同核苷酸時，其Walker B的E108位點會采取不同的構象，這種構象變化能夠被sensor I中的Thr148和Gln64所感應，隨后傳遞到L1和L2 loop[30, 55, 59]。許多AAA+蛋白都利用“谷氨酸開關”模型來行使功能[60]。

因此，bEBP很可能是通過其調(diào)節(jié)結(jié)構域來感知脅迫信號或者代謝分子信號的變化，然后改變自身的寡聚化狀態(tài)，利用水解ATP分子提供的能量，重塑sigma54甚至轉(zhuǎn)錄起始復合物的構象，最終調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[2](Fig.7)。

Fig.7 Schematic diagram of glutamate switch model[3] The conformation of bEBP protein changes greatly during the process of binding ATP and hydrolyzing ATP. Upon bEBP binding to ATP, L1 extends out of the oligomerization plane and can interact with sigma54. After hydrolyzing ATP to release the free phosphate group, the L1 of bEBP retracts toward the oligomerization plane. This dynamic process leads to the conformational remodeling of sigma54 and the transcription complex

2.3 bEBP在轉(zhuǎn)錄中的作用

當前已解析出結(jié)構的樣品中，只有RPi是含有bEBP的轉(zhuǎn)錄中間狀態(tài)復合物(Fig.4A)。該狀態(tài)下的bEBP分辨率低，只能從電子密度中辨別出bEBP的L1/L2結(jié)構域與DNA以及sigma54-RⅠ有相互作用。當bEBP結(jié)合到轉(zhuǎn)錄復合物上，sigma54的 RⅠ/ELH以及CBD結(jié)構域的構象發(fā)生改變，并且RNAP裂隙的寬度較RPc擴大了約15 ?。此外，RⅠ的N端明顯變長并向上偏轉(zhuǎn)，導致其可以貫穿DNA與bEBP，形成楔子樣結(jié)構，以撬動DNA解鏈。顯而易見，bEBP能夠幫助DNA雙鏈解鏈。目前的數(shù)據(jù)顯示，RNAP裂隙的擴大主要由β′鉗子移動造成(Fig.4B)，但β′鉗子的移動是否由接近它的ELH N端以及RⅠ的α1引起目前仍不清楚。刪除sigma54-RⅠ或者將sigma54-ELH 366位Arg突變?yōu)锳la，皆可去除sigma54對RNAP的抑制，在bEBP不存在的情況下也能啟動轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果提示，bEBP可以解除sigma54-RⅠ與ELH之間的相互作用。甚至bEBP主要通過與RⅠ的相互作用來改變sigma54的構像。但bEBP如何解除sigma54-RⅠ與ELH的相互作用，進而幫助轉(zhuǎn)錄起始的機制尚缺乏報道。在RPi中，sigma54-RⅠ與ELH發(fā)生整體偏移，不再完全阻擋在裂隙上方，但二者的相互作用仍然存在，暗示著bEBP與轉(zhuǎn)錄復合物的結(jié)合并未破壞RⅠ/ELH的相互作用，只是使RⅠ的構象發(fā)生變化。若要真正地破壞兩者之間相互作用，或許仍然需要bEBP通過水解ATP來將化學能轉(zhuǎn)化為機械能才得以實現(xiàn)[2]。在RPip中，不僅RNAP裂隙顯著拓寬，sigma54和DNA整體偏向裂隙，而且RⅠ不可見(Fig.5)。這些結(jié)構特征進一步提示：bEBP可以直接作用于DNA，并且會通過改變RⅠ構象來改變ELH和HTH等結(jié)構域，從而影響裂隙的開合和DNA的裝載。因此，為激活轉(zhuǎn)錄起始，bEBP還需要進一步發(fā)生結(jié)構變化，來幫助DNA解鏈并裝載入RNAP裂隙。

3 問題與展望

3.1 Sigma54與bEBP在轉(zhuǎn)錄起始中的生理角色

Sigma54的3個保守區(qū)域RⅠ、RⅡ和RⅢ在轉(zhuǎn)錄過程中均發(fā)揮著至關重要的作用。在全酶和RPc結(jié)構中，RⅠ與來自RⅢ的ELH結(jié)構域相互作用，在RNAP裂隙入口處，擔負著DNA進入開關的角色。來自RⅢ的CBD結(jié)構域與RNAP的β、β′、α亞基相互作用，位于RNA出口處，作為RNA釋放的開關[22]。而RⅡ結(jié)構域在轉(zhuǎn)錄起始的很多狀態(tài)中均處于不可見狀態(tài)，只有sigma54-RⅡ.1在RNA聚合酶全酶中占據(jù)DNA通道，阻止DNA結(jié)合[29]。

在RPi中，由bEBP引發(fā)的RⅠ/ELH整體偏移使其不再完全阻擋RNAP裂隙。此時，β′亞基鉗子也隨RⅠ/ELH發(fā)生偏移，從而擴大RNAP裂隙。β′亞基鉗子的位置變化提示其頂端可能與ELH的N端發(fā)生相互作用，但目前因電鏡結(jié)構分辨率較低，缺少可信的證據(jù)支持。裂隙打開的RPip與RPc在制樣方法上的區(qū)別僅是將sigma54的336位Arg突變?yōu)锳la，這個事實進一步支持了維持裂隙閉合的力量是由RⅠ與ELH之間的相互作用所提供這一觀點。RⅠ的N端1～15位氨基酸部分在RNA聚合酶全酶和RPc中均不可見，但是8～15位氨基酸部分在RPi中以明顯變長的α螺旋呈現(xiàn)，且向上旋轉(zhuǎn)約45°插入DNA中。因此，RⅠ很可能是bEBP蛋白質(zhì)用以撬動轉(zhuǎn)錄復合物與推動DNA雙鏈打開的一個作用支點。此外，bEBP的結(jié)合導致來自sigma54 RⅢ的CBD結(jié)構域整體向上移動，離開RNA出口。RPc、RPi、RPip和RPo等結(jié)構的對比分析結(jié)果顯示，CBD結(jié)構域的位置僅在RPi中發(fā)生上移，離開RNA出口；而在其他結(jié)構中的位置均擋在RNA出口[22, 31]。這些結(jié)果表明，使bEBP解除sigma54抑制轉(zhuǎn)錄起始發(fā)生的關鍵因素很可能是sigma54-RⅠ/ELH的移動[22]，而并不是CBD結(jié)構域的上移。

在RPip中，sigma54上1～114位氨基酸部分的密度不可見，提示RⅠ所參與的相互作用在此構象中很可能已被解除。此外，與RⅠ距離較近的ELH上293～335之間的區(qū)域在RPip中也變得柔性不可見，導致ELH變短。此時，sigma54與DNA一起發(fā)生旋轉(zhuǎn)偏移，偏向RNAP裂隙。通過比對發(fā)現(xiàn)，在整個偏移過程中，sigma54的ELH-HTH、RPoN以及DNA的相對位置并未發(fā)生改變，表明它們是以固定相互作用模式進行整體移動[22, 31]。但sigma54整體偏移方向與RPi中RⅠ/ELH偏移的方向相反，且β′亞基鉗子中距離ELH最近的2個α螺旋相對位置在RPi中發(fā)生扭曲，而在RPip中則為同步偏移[22, 31]。RPip中不僅裂隙拓寬，且DNA部分裝載，之后自發(fā)形成RPo構象；RPi的變化與RPip矛盾，提示RPi不是RNAP裂隙打開的關鍵步驟，而僅是bEBP與RⅠ和DNA相互作用引起的構象改變。真正有效的裂隙打開應該發(fā)生在RPip之前，由RPi之后RⅠ與ELH之間的相互作用解除而引發(fā)，但直接導致裂隙打開的作用力來自哪一結(jié)構域仍不清楚。從RPi中可以發(fā)現(xiàn)RⅠ與bEBP有明顯的相互作用，而且bEBP是該轉(zhuǎn)錄體系引入外力的一個重要作用點，所以目前認為，bEBP能夠通過水解ATP改變轉(zhuǎn)錄復合物的構象，尤其是破壞sigma54中RⅠ與ELH的相互作用和直接改變DNA結(jié)構來起始轉(zhuǎn)錄。

在RPo中，ELH基本恢復其在RPc中的長度，彎折且插入到DNA雙鏈中，此時RNAP的裂隙也再次關閉。此外，在RPo中，ELH由在RPip中較短且處于DNA外側(cè)，變得更長且插入到DNA雙鏈中，所以ELH更有可能是引發(fā)結(jié)構自RPip向RPo轉(zhuǎn)變的關鍵結(jié)構域。RPip中ELH變短且N端與β、β′亞基相距較遠，無明顯相互作用；而RPo中的β、β′鉗子相互靠近，ELH也延長，兩鉗子位于裂隙中的無規(guī)卷曲(β：356～385，β′：251～325)與ELH的距離非常近，認為ELH與這些卷曲有相互作用。由于RPip與RPo來自同一樣品，不會有額外的物質(zhì)造成這種結(jié)構變化。所以我們推測，RPi到RPo的結(jié)構變化來自于ELH N端的隨機擺動，以及其N端與β、β′卷曲間的相互作用，當三者發(fā)生相互作用時，兩鉗子之間的距離被拉近，并導致DNA的解鏈和裝載。但由于結(jié)構分辨率較低，與ELH相互作用的氨基酸目前仍無法確定。

3.2 展望

細菌中依賴sigma54進行轉(zhuǎn)錄的基因大多與脅迫和代謝信號相關，且無法自發(fā)起始轉(zhuǎn)錄，需要其激活蛋白質(zhì)bEBP參與才能啟動轉(zhuǎn)錄起始。細胞內(nèi)的小分子代謝物質(zhì)可結(jié)合在bEBP的調(diào)節(jié)結(jié)構域以增強其活性。例如：2-OG和NO可結(jié)合GAF結(jié)構域，黃素等分子可結(jié)合PAS結(jié)構域。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)也可通過結(jié)合bEBP調(diào)控其活性。例如：NifL與NifA結(jié)合后，會抑制NifA的活性；HrpS與HrpR結(jié)合，可共同發(fā)揮活性。此外，磷酸化修飾也能改變bEBP的活性狀態(tài)，例如：磷酸化可激活NtrC，啟動轉(zhuǎn)錄起始[42]。未來，結(jié)合小分子代謝物、配體蛋白質(zhì)或者磷酸化修飾的bEBP三維結(jié)構的解析，將極大推動我們對bEBP感受并傳遞信號分子機制的認識。

在sigma54依賴性轉(zhuǎn)錄起始方面，盡管科學家們利用冷凍電鏡技術已經(jīng)解析了一系列sigma54依賴的基因轉(zhuǎn)錄復合物的結(jié)構，在sigma54如何抑制轉(zhuǎn)錄起始、DNA如何進入RNAP裂隙、bEBP如何與sigma54相互作用，以及bEBP作用的轉(zhuǎn)錄進程等方面給出了更為清晰的答案[22, 31]。但關于sigma54依賴的轉(zhuǎn)錄起始機制仍然存在許多未解之謎。目前報道的sigma54依賴性轉(zhuǎn)錄起始相關的各種結(jié)構，都是通過組裝異源的sigma54與RNAP、啟動子DNA所得，這些結(jié)構是否能夠完全代表來自于同一物種的真正的轉(zhuǎn)錄起始過程仍有待確認。此外，當前獲得的轉(zhuǎn)錄復合物電鏡結(jié)構的分辨率普遍較低，一些關鍵的相互作用信息尚無法判斷，阻礙了對轉(zhuǎn)錄起始機制的深入理解。另一個重要問題是，目前已經(jīng)解析出的在ADP·AlFx存在下，bEBP結(jié)合的轉(zhuǎn)錄復合物結(jié)構僅能提供有限信息。在未來，來自同一物種的轉(zhuǎn)錄起始復合物的結(jié)構解析將描繪出更為準確的轉(zhuǎn)錄起始過程。而結(jié)合不同狀態(tài)核苷酸的bEBP-RNA聚合酶全酶復合物的結(jié)構解析，將有助于理解bEBP水解ATP過程中的構象變化，及其對轉(zhuǎn)錄復合物結(jié)構的重塑作用。