張 寧，丁培陽，任東娜，陳藝蘭，李雪洋，常澤杰，李青梅，張改平*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室，河南鄭州 450002；3.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州 450001；4.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450046)

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的非洲豬瘟(ASF)具有高發(fā)病率和高病死率的特征[1]。家豬和野豬均為易感動物，軟蜱可作為自然宿主和傳播途徑[2]。2018年我國首次暴發(fā)ASF，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重打擊[3]。非洲豬瘟病毒(ASFV)屬非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)、非洲豬瘟病毒屬(Asfivirus)[4]。ASFV是一種巨大且復(fù)雜的正20面體病毒，直徑約260 nm，具有獨特的5層復(fù)雜結(jié)構(gòu)，包括外膜、衣殼、雙層內(nèi)膜、核心殼層和基因組[5-6]。H240R蛋白是位于ASFV衣殼頂點上的一個五聚體結(jié)構(gòu)，有研究表明該蛋白對ASFV 20面體衣殼的形成至關(guān)重要[7-8]。研究制備出ASFV H240R蛋白多克隆抗體，但H240R抗體是否具有中和作用還有待進(jìn)一步研究[9]。本試驗對ASFV H240R基因進(jìn)行原核表達(dá)，成功制備出針對H240R蛋白的單克隆抗體，旨在為下一步鑒定H240R蛋白抗原表位提供材料，有利于深入了解該蛋白的結(jié)構(gòu)與功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級6周齡～8周齡Balb/c雌鼠5只，購自鄭州大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 異丙基-β-D-硫代半乳糖甘(IPTG)、1640培養(yǎng)基，北京索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品；胎牛血清(FBS)，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT、HT等，Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 PCR儀，德國耶拿分析儀器股份有限公司生產(chǎn)；恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn)；恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn)；離心機，美國賽默飛公司生產(chǎn)；核酸電泳儀，美國伯樂公司生產(chǎn)；CO2培養(yǎng)箱，日本三洋公司生產(chǎn)；-80冰箱，長虹美菱股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)菌株的構(gòu)建 根據(jù)NCBI GenBank公布的ASFV流行株DB/LN/2018 H240R基因序列(GenBank：MK333181.1)進(jìn)行大腸埃希氏菌密碼子優(yōu)化，設(shè)計上、下游引物H240R-F和H240R-R，分別在上、下游引物5′端引入NdeⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點(下劃線部分)，H240R-F序列：GGGAATCCATATGGCGGCGAACATC，H240R-R序列：CCCGCTCGAGGCTACCACCTTTGCTGGTTTTCAGAG，由上海生工生物工程有限公司合成。以H240R質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行PCR擴增，回收后的PCR產(chǎn)物和pET-29b載體用NdeⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切后連接。轉(zhuǎn)化至Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR鑒定篩選陽性重組質(zhì)粒后送由上海生工生物工程有限公司測序，將測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET-29b-H240R。

1.2.2 pET-29b-H240R重組質(zhì)粒的表達(dá)與純化 將pET-29b-H240R重組質(zhì)粒和pET-29 b空載體分別轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，于LB/K+培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)；將菌液轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)至OD600nm值為0.6～0.8時加入終濃度為0.2 mmol/L IPTG，16℃、160 r/min誘導(dǎo)表達(dá)18 h。收集菌體，超聲破碎，SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況。H240R重組蛋白表達(dá)成功后，擴大培養(yǎng)，收集破碎菌體上清，用鎳柱進(jìn)行初步純化，再用凝膠過濾預(yù)裝柱Superdex 200 Increase 10/300 GL進(jìn)一步純化，SDS-PAGE分析蛋白純度，并分別以ASFV陽性血清和抗His-tag鼠單克隆抗體為一抗進(jìn)行Western blot鑒定。

1.2.3 檢測H240R蛋白的間接ELISA方法 純化后的H240R重組蛋白用pH 9.6碳酸鹽緩沖液(CBS)稀釋至1 mg/L，100 μL/孔包被于酶標(biāo)板，4℃過夜孵育；PBST洗滌3次，50 g/L脫脂奶粉37℃封閉2 h；PBST洗滌3次，將稀釋后的樣品加到包被有抗原的酶標(biāo)板，并設(shè)置陰性對照，37℃孵育1 h；PBST洗滌3次，加入1∶1 000 HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，100 μL/孔，37℃孵育1 h；PBST洗滌3次，100 μL/孔四甲基聯(lián)苯胺(TMB)避光顯色12 min，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀測定OD450nm吸光度值，陰性對照OD450nm值<0.2時，試驗成立。

1.2.4 免疫小鼠及血清抗體效價的測定 將6周齡Balb/c小鼠采用皮下多點注射方法按常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫，共免疫4次，間隔21 d，免疫劑量為10 μg/只，間接ELISA方法檢測小鼠血清抗體效價，選1只抗體效價最高的小鼠進(jìn)行融合，融合前3 d腹腔注射重組蛋白H240R 10 μg。

1.2.5 細(xì)胞融合及單克隆抗體的篩選 常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合[10]。9 d～12 d用間接ELISA方法對雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行檢測，并用本實驗室前期用大腸埃希氏菌體系表達(dá)的PCV2 Cap蛋白作為反篩抗原[11]，肉眼判斷顏色變化，篩選出抗H240R蛋白陽性孔，抗PCV2 Cap蛋白陰性孔的雜交瘤細(xì)胞。通過有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆，直至雜交瘤細(xì)胞上清陽性率為100%。

1.2.6 腹水的制備 取6周齡～12周齡Balb/c小鼠，腹腔注射500 μL高壓滅菌石蠟，7 d后小鼠腹腔注射2×106～5×106個雜交瘤細(xì)胞。1周后可觀察到小鼠腹腔明顯變大，用9#針頭采集腹水。將收集到的腹水10 000 r/min離心10 min后收集上清液。

1.2.7 單克隆抗體腹水效價的測定 參考1.2.3步驟間接ELISA法檢測單克隆抗體效價。當(dāng)P/N(單抗OD450nm值/陰性對照OD450nm值)≥2.1，判為陽性；P/N<2.1，判為陰性；以陽性孔對應(yīng)樣品最高稀釋度，作為單抗效價。

1.2.8 單克隆抗體亞型鑒定 按照武漢華美生物小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒說明書操作，鑒定單抗亞型。

1.2.9 Western blot鑒定單克隆抗體特異性 將純化后的H240R重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉封閉，以雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清為一抗，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗，ECL發(fā)光成像系統(tǒng)顯色。

1.2.10 Dot blot鑒定單克隆抗體特異性 取1 μL重組蛋白H240R點至硝酸纖維素(NC)膜，用PCV2 Cap蛋白作陰性對照。待NC膜干燥后，用50 g/L脫脂奶粉于4℃過夜封閉；以單克隆抗體細(xì)胞上清為一抗，室溫孵育1 h；PBST洗滌3次，以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，室溫孵育1 h；PBST洗滌3次，用ECL試劑在化學(xué)成像儀中曝膜。

1.2.11 間接免疫熒光試驗反應(yīng)性鑒定 參照ASFV流行株DB/LN/2018 H240R基因序列，將H240R基因進(jìn)行人源偏嗜性密碼子優(yōu)化，送上海生工生物工程有限公司合成。構(gòu)建PCAGGS-HA-H240R表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞，用HA標(biāo)簽的羊抗鼠單抗進(jìn)行Wesrern blot鑒定蛋白表達(dá)情況。將HEK293T細(xì)胞鋪至12孔板，約12 h后，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%～80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。36 h后收樣，用提前預(yù)冷的甲醇固定，進(jìn)行免疫熒光試驗。以雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清為一抗，37℃孵育1 h；Alexa-Fluor-488山羊抗小鼠IgG為熒光二抗，37℃孵育1 h；DAPI染色液染細(xì)胞核5 min，在顯微鏡下觀察，拍照保存。

2 結(jié)果

2.1 H240R重組蛋白的表達(dá)與純化

2.1.1 重組質(zhì)粒pET-29b-H240R的構(gòu)建 H240R基因PCR擴增后，大小約723 bp，與預(yù)期大小一致(圖1)。對構(gòu)建好的重組子進(jìn)行菌液PCR鑒定，凝膠電泳結(jié)果表明構(gòu)建的載體中含有H240R蛋白基因(圖2)，測序結(jié)果進(jìn)一步證實了重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.H240R PCR產(chǎn)物M.DNA Maker DL 2 000；1.H240R PCR products

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1.pET-29b-H240R；2.陰性對照

2.1.2 H240R重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將陽性重組子菌液進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，同時以未誘導(dǎo)和空載體作為陰性對照，SDS-PAGE結(jié)果表明誘導(dǎo)后的H240R蛋白上清和沉淀中均出現(xiàn)一大小約為27 ku的明顯條帶(圖3)，與預(yù)期大小一致。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.誘導(dǎo)后的pET-29b空載全菌；2.未誘導(dǎo)的pET-29b-H240R全菌；3.誘導(dǎo)后的pET-29b-H240R菌體超聲破碎液上清；4.誘導(dǎo)后的pET-29b-H240R菌體超聲破碎液沉淀

2.1.3 重組蛋白的純化及鑒定 重組蛋白H240R純化后， SDS-PAGE 電泳檢測，蛋白純度約為90%(圖4A)；Western blot鑒定H240R蛋白可與His標(biāo)簽鼠單克隆抗體和ASFV陽性血清反應(yīng)，并出現(xiàn)兩條特異性條帶約在27 ku和63 ku下方(圖4B、圖4C)。通過串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，確定了在63 ku下方出現(xiàn)的條帶為H240R蛋白，說明H240R蛋白存在更高級的結(jié)構(gòu)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化后的H240R蛋白；2.His標(biāo)簽鼠單克隆抗體檢測H240R蛋白；3.ASFV陽性血清檢測H240R蛋白

2.2 小鼠血清抗體效價測定

第4次免疫1周后用間接ELISA方法檢測5只小鼠血清抗體效價，選擇效價最高的4號小鼠進(jìn)行融合，效價可達(dá)1∶12 800(圖5)。

圖5 H240R蛋白四免后小鼠血清效價檢測

2.3 單克隆抗體生物學(xué)特性的鑒定

2.3.1 單克隆抗體效價的測定 用間接ELISA方法篩選并經(jīng)過3次亞克隆后獲得4株能夠穩(wěn)定分泌H240R蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為12D6、21G3、13D2、8G7。用這4株陽性雜交瘤細(xì)胞制備小鼠腹水，腹水效價均大于1∶40 000(圖6)。

圖6 單克隆抗體腹水效價的測定

2.3.2 H240R蛋白單克隆抗體亞類鑒定、Western blot鑒定和 Dot blot分析 將4株單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定，結(jié)果顯示12D6、21G3、8G7重鏈亞類為IgG2b，13D2重鏈亞類為IgG1，輕鏈亞類均為k。以4株單克隆抗體為一抗，進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果表明只有2株單克隆抗體21G3、13D2與變性的H240R重組蛋白發(fā)生較強反應(yīng)(圖7)；而12D6、8G7株單克隆抗體不能識別變性條件下的H240R蛋白。

將H240R重組蛋白點至NC膜上，PCV2 Cap蛋白作為陰性對照，以12D6、8G7株單克隆抗體細(xì)胞上清為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，檢測單克隆抗體與H240R重組蛋白的反應(yīng)性。結(jié)果顯示，12D6、8G7株單克隆抗體與H240R重組蛋白反應(yīng)良好(圖8)。

圖8 Dot blot鑒定單克隆抗體12D6 、8G7與H240R蛋白的反應(yīng)性

2.3.3 單克隆抗體的IFA鑒定 將重組質(zhì)粒PCAGGS-HA-H240R轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞，Western blot鑒定蛋白表達(dá)情況。在約27 ku處出現(xiàn)一特異性條帶(圖9)，與目的條帶大小一致，說明PCAGGS-HA-H240R質(zhì)粒表達(dá)成功。以4株單克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清為一抗進(jìn)行IFA檢測。4株單克隆抗體均出現(xiàn)熒光，而對照組無熒光信號(圖10)，說明篩選到的單克隆抗體均能與真核表達(dá)的H240R蛋白反應(yīng)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.PCAGGS-HA空載體；2.PCAGGS-HA-H240R重組蛋白

圖10 單克隆抗體的IFA鑒定

3 討論

H240R蛋白是ASFV的一個次要衣殼蛋白，對ASFV組裝至關(guān)重要。目前，關(guān)于該蛋白的抗原表位研究存在空白，而基于病毒蛋白的單克隆抗體是對蛋白進(jìn)行基礎(chǔ)與應(yīng)用研究的重要生物材料。單克隆抗體作為疾病診斷的一個重要工具，已利用單克隆技術(shù)建立了一些ASFV檢測方法，主要集中于p54和p30[12-13]，但關(guān)于H240R蛋白單克隆抗體方面的研究尚未見報道。

本試驗構(gòu)建了pET-29b-H240R重組質(zhì)粒進(jìn)行原核表達(dá)，通過鎳親和層析和凝膠過濾層析兩步純化得到純度約為90%的重組蛋白H240R。對純化后的蛋白經(jīng)過質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)H240R蛋白單體之間存在二硫鍵結(jié)構(gòu)。Western blot鑒定結(jié)果表明，重組蛋白H240R有良好的反應(yīng)原性。本試驗共制備出4株針對ASFV H240R蛋白的單克隆抗體，腹水效價均高于1∶40 000，最高的一株效價為1∶1 280 000。4株單克隆抗體亞型分別為IgG2b和IgG1，輕鏈亞型均為κ。對4株單克隆抗體進(jìn)行Western blot、Dot blot及IFA鑒定，發(fā)現(xiàn)均可與H240R蛋白特異性結(jié)合。且21G3、13D2株單抗能與變性的H240R重組蛋白發(fā)生反應(yīng)，而12D6、8G7株單抗不能鑒定出變性條件下的H240R蛋白。因此,得出12D6、8G7株單克隆抗體識別的表位為線性表位，而21G3和13D2識別的是構(gòu)象表位，這將為ASFV H240R蛋白結(jié)構(gòu)、功能研究以及抗原表位的分析和精確定位起到了促進(jìn)作用。