朱 琪，吳雅雯，王曉慧，李庚喜

（湘西南中藥開發(fā)利用湖南省工程研究中心，邵陽學院，邵陽 422000）

過量飲酒導(dǎo)致的酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）已成為全球性的醫(yī)療保健問題［1］。研究表明，酒精誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、谷胱甘肽（glutathione，GSH）耗竭和促炎細胞因子在ALD的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用［2，3］。此外，細胞內(nèi)活性氧含量的增加促進脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的形成。而MDA沉積又可刺激炎性細胞因子的分泌，加速受損肝組織的病變［4］。核因子E2相關(guān)因子（NF-E2-related factor 2，Nrf2）是一種與氧化還原失衡相關(guān)的敏感轉(zhuǎn)錄因子［5，6］。在應(yīng)激條件下，過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）破壞胞漿蛋白Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1）-Nrf2的相互作用，啟動Nrf2的有效核轉(zhuǎn)位，提高抗氧化酶活性，抵御有害刺激產(chǎn)生的不利影響［7］。這提示作為機體內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化Nrf2/Keap1通路可為抗酒精性肝毒性的治療提供策略［8］。

目前針對ALD患者一般干預(yù)措施包括肝病并發(fā)癥住院管理、酒精戒斷管理、感染監(jiān)測和早期有效的抗生素治療以及營養(yǎng)補充，其中實施戒酒管理或早期營養(yǎng)補充可能是早期抵御ALD病變發(fā)展的有效措施［1，9］。來源于天然產(chǎn)物的多糖是一類已被證實具有抗氧化、調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)和抑制細胞凋亡等活性，兼具高效、無毒或低副作用等優(yōu)點的潛在抵御酒精性肝損傷保健功能食品或藥物制劑資源［10，11］。玉竹多糖（Polygonatum odoratum polysaccharides，POP）是來源于藥膳同源植物玉竹［Polygonatum odoratum（Mill.）Druce］干燥根莖中的活性成分。最新的玉竹研究發(fā)現(xiàn)，玉竹多糖在體外可以清除自由基，在體內(nèi)可以提高機體抗氧化酶活性、抑制炎性因子和MDA的含量［12，13］。這些活性都有助于肝細胞抵御酒精脅迫所產(chǎn)生的逆應(yīng)激，但目前缺乏相關(guān)的實驗研究。因此，本研究通過Nrf2/Keap1抗氧化信號通路檢測玉竹多糖對酒精誘導(dǎo)人肝癌細胞（HepG2）氧化應(yīng)激、GSH耗竭、炎癥因子以及細胞凋亡水平的影響，探討玉竹多糖對酒精誘導(dǎo)HepG2細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

玉竹多糖購自蘭州沃特萊斯科技有限公司（批號：WTLS-010），采用苯酚-硫酸法測定玉竹多糖的質(zhì)量分數(shù)58%；95%醫(yī)用酒精（批號：20210207）購于潤玲科技集團有限公司；人源性肝細胞系（HepG2；批號：CX0004），HepG2細胞專用培養(yǎng)基（批號：ZYPYG0004），3-（4，5-二甲基-噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化銨（MTT）試劑（批號：AR1156）購于武漢博士德生物公司；ROS（批號：E004-1-1）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT，批號：C009-3-1）、MDA（批號：A003-2-1）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST，批號：C010-3-1）和GSH（批號：A006-1-1）等生化試劑盒購于南京建成生物工程研究所；白介素-1β（IL-1β，批號：CSB-E08053h）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α，批號：CSB-E09315h）購于武漢華美生物工程有限公司；RIPA裂解液（批號：P0013E）和硝酸纖維素膜（批號：FFN02）購于碧云天生物技術(shù)公司；10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠（批號：MA0159）購于大連美侖生物技術(shù)公司；ECL顯色液（批號：K-12045-D50，美國advansta），Keap1（批號：ab119403，英 國abcam）、p-Nrf2（批 號：ab237464，英國abcam）、磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化還原酶-1（NQO1，批號：ab97385，英國abcam）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax，批號：ab182733，英國abcam）、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2，批號：ab196495，英國abcam）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleavedcaspase-3，批號：ab2302，英國abcam）等抗體由邵陽杏匯科技有限公司代購。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

EPOCH-2多功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；5810型臺式冷凍離心機（德國Eppndorf公司）；LRH-500細胞生化培養(yǎng)箱（上海篤特科學儀器有限公司）；FluorChem FC2化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（南京非同科學儀器有限公司）；電泳槽（北京龍方科技有限公司）；電子天平（梅特勒托利多科技（中國）有限公司）。

1.2 細胞的培養(yǎng)和處理以及細胞存活率檢測

參閱文獻［14］，HepG2肝細胞在RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。實驗分為空白組、不同濃度（3%、4%、5%和6%）酒精組和不同濃度（100μg/L、200 μg/L、400μg/L和600μg/L）玉竹多糖處理組，每組設(shè)3復(fù)孔，24 h后加入MTT試劑，37℃孵育4 h，抽提培養(yǎng)液。用DMSO溶解紫甲瓚晶體后，于550nm處測量吸收強度。采用MTT法計算HepG2細胞存活率。細胞存活率=A（處理組）/A（對照組）×100%。

1.3 玉竹多糖的干預(yù)對酒精誘導(dǎo)Hep G2細胞存活率的影響

96孔板上培養(yǎng)的HepG2細胞分別用不同濃度（100μg/L、200μg/L、400μg/L和600μg/L）的玉竹多糖預(yù)處理1 h，并設(shè)未處理的空白組，再用1.2步驟選用的酒精濃度處理24 h，計算細胞存活率。

1.4 細胞內(nèi)ALT和AST活性

參閱試劑盒廠家說明書，測定HepG2細胞內(nèi)ALT和AST活性。

1.5 細胞內(nèi)ROS、MDA和GSH水平

參閱試劑盒廠家說明書，測定HepG2細胞內(nèi)ROS、MDA和GSH水平。

1.6 細胞內(nèi)IL-1β和TNF-α水平

用酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒評估HepG2細胞內(nèi)IL-1β和TNF-α水平。

1.7 Western Blot分析

用RIPA裂解液提取細胞裂解產(chǎn)物，測定蛋白濃度。參閱文獻［15］，將蛋白質(zhì)用SDS-PAGE凝膠上樣，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。用5%脫脂牛奶在磷酸鹽吐溫緩沖液中封閉膜，將膜與磷酸鹽吐溫緩沖液中的一抗孵育過夜，洗膜后，經(jīng)辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗體孵育，ECL孵育顯色后，暗盒內(nèi)固定顯影，于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)觀察目標蛋白表達。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 不同處理方式下Hep G2細胞的存活率

不同濃度的酒精處理HepG2細胞后，細胞存活率呈劑量依賴性下降，與空白組比較，3%濃度的酒精即可顯著影響HepG2細胞存活率為90.33%±2.52%（P＜0.05）。其中4%濃度的酒精誘導(dǎo)HepG2細胞生存率在77.33%±6.43%左右，且與空白組比較具有極顯著性（P＜0.01），因此在所有后續(xù)實驗中都使用4%的酒精濃度。同時加入不同濃度（100μg/L、200μg/L、400μg/L和600μg/L）的玉竹多糖，并設(shè)未處理的空白組。24 h后，測試結(jié)果顯示，600μg/L以內(nèi)濃度的玉竹多糖均不影響HepG2細胞的存活率（P＞0.05）。與4%酒精誘導(dǎo)的HepG2細胞對照組相比，預(yù)先給予玉竹多糖（200 μg/L、400μg/L和600μg/L）預(yù)處理的細胞存活率分別為（86.67±2.52）%、（89.67±2.52）%和（97.67±2.08）%，可顯著降低4%酒精誘導(dǎo)的細胞毒性（P＜0.05），提示玉竹多糖對酒精性肝損傷有保護作用。且隨著玉竹濃度增加，細胞存活率明顯提高。雖然100μg/L玉竹多糖可提高4%乙醇誘導(dǎo)的HepG2細胞的存活率，細胞存活率為（82.00±2.65）%，無明顯影響（P＞0.05）。因此，后續(xù)實驗中都使用200μg/L、400μg/L和600μg/L玉竹多糖預(yù)處理，進一步研究不同濃度的玉竹多糖對酒精誘導(dǎo)HepG2細胞生化指數(shù)的影響。

2.2 玉竹多糖對酒精處理Hep G2細胞ALT和AST活性的影響

如表1所示，4%酒精處理后的HepG2細胞與空白組相比，可顯著地誘導(dǎo)ALT和AST滲漏（P＜0.01），而不同濃度玉竹多糖的預(yù)處理能顯著降低4%酒精誘導(dǎo)HepG2細胞的ALT和AST釋放（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.1 Effects of POP on alcohol-induced ALT and AST production in HepG2 cells（mU/ml，±s，n=3）

Tab.1 Effects of POP on alcohol-induced ALT and AST production in HepG2 cells（mU/ml，±s，n=3）

#P＜0.05，##P＜0.01 vs the untreated blank group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs the control group treated with 4%ethanol

Group AST ALT Blank group 3.68±0.04 1.79±0.07 4%ethanol 4.83±0.03## 2.72±0.03##200μg/LPOP+4%ethanol 4.71±0.02** 2.55±0.06*400μg/LPOP+4%ethanol 4.55±0.03** 2.27±0.02**600μg/LPOP+4%ethanol 4.18±0.02** 2.02±0.05**

2.3 玉竹多糖對酒精處理Hep G2細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響

如表2所示，4%酒精處理的HepG2細胞與空白組相比，顯著誘導(dǎo)ROS上升（P＜0.01），而玉竹多糖的預(yù)處理能顯著降低4%酒精誘導(dǎo)HepG2細胞內(nèi)ROS水平（P＜0.01）。此外，玉竹多糖可有效抑制4%酒精誘導(dǎo)的肝HepG2細胞MDA水平（P＜0.05），顯著提高4%酒精誘導(dǎo)HepG2細胞內(nèi)GSH水平（P＜0.01）。

Tab.2 Effects of POP on alcohol-induced oxidative stress in HepG2 cells（±s，n=3）

Tab.2 Effects of POP on alcohol-induced oxidative stress in HepG2 cells（±s，n=3）

#P＜0.05，##P＜0.01 vs the untreated blank group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs the control group treated with 4%ethanol

Group ROS（%）MDA（nmol/mg prot）GSH（nmol/mg prot）Blank group 100.00±0.03 0.16±0.01 8.83±1.10 4%ethanol 167.33±18.15##0.35±0.03##2.59±0.14##200μg/LPOP+4%ethanol 149.00±14.11 0.32±0.03 4.59±0.17**400μg/LPOP+4%ethanol 126.33±9.45**0.26±0.02* 6.73±0.39**600μg/LPOP+4%ethanol 121.00±8.72**0.21±0.01**7.52±0.66**

2.4 玉竹多糖對酒精處理Hep G2細胞炎性反應(yīng)的影響

結(jié)果表明（表3），與空白組相比，4%酒精處理顯著增加HepG2細胞內(nèi)IL-1β和TNF-α的生成量（P＜0.01），而200μg/L玉竹多糖的預(yù)處理即可顯著減少4%酒精誘導(dǎo)的HepG2細胞中促炎因子IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生（P＜0.05）。

Tab.3 Effects of POP on the contents of IL-1βand TNF-α in HepG2 cells induced by alcohol（pg/ml，±s，n=3）

Tab.3 Effects of POP on the contents of IL-1βand TNF-α in HepG2 cells induced by alcohol（pg/ml，±s，n=3）

#P＜0.05，##P＜0.01 vs the untreated blank group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs the control group treated with 4%ethanol

Group IL-1β TNF-α Blank group 31.75±1.36 316.23±13.93 4%ethanol 82.07±2.67## 827.63±25.71##200μg/L POP+4%ethanol 73.45±5.90* 765.73±36.69*400μg/L POP+4%ethanol 61.61±2.70** 669.30±14.98**600μg/L POP+4%ethanol 50.11±3.89** 544.77±27.42**

2.5 玉竹多糖對酒精處理Hep G2細胞相關(guān)信號通路的調(diào)控

如圖1、表4和表5所示，4%酒精處理的HepG2細胞與空白組相比，顯著地上調(diào)Keap1和cleaved-caspase-3的蛋白表達水平以及Bax/Bcl-2蛋白表達比率水平（P＜0.01），而玉竹多糖的預(yù)處理能顯著降低4%酒精誘導(dǎo)HepG2細胞內(nèi)Keap1和cleaved-caspase-3的蛋白表達水平以及Bax/Bcl-2蛋白指數(shù)（P＜0.05）。此外，玉竹多糖有效抵御4%酒精誘導(dǎo)的肝HepG2細胞p-Nrf2和NQO-1水平下降（P＜0.05）。

Fig.1 Effects of POP on the expressions of Keap1，p-Nrf2，NQO-1，Bax，Bcl-2 and cleaved-caspase-3 in HepG2 cells induced by alcohol（±s，n=3）

Tab.4 Relative expression levels of Keap1，p-NrF2 and NQO-1，Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 in HepG2 cells（±s，n=3）

Tab.4 Relative expression levels of Keap1，p-NrF2 and NQO-1，Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 in HepG2 cells（±s，n=3）

#P＜0.05，##P＜0.01 vs the untreated blank group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs the control group treated with 4%ethanol

Group Keap1 p-Nrf2 NQO-1 Blank group 0.16±0.04 0.40±0.12 0.49±0.03 4%ethanol 0.47±0.06##0.22±0.08#0.04±0.01##200μg/LPOP+4%ethanol 0.38±0.05 0.32±0.02 0.08±0.03 400μg/LPOP+4%ethanol 0.25±0.03**0.50±0.03**0.32±0.04**600μg/LPOP+4%ethanol 0.23±0.03**0.55±0.04**0.29±0.03**

Tab.5 Relative expression levels of Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 in HepG2 cells（±s，n=3）

Tab.5 Relative expression levels of Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 in HepG2 cells（±s，n=3）

#P＜0.05，##P＜0.01 vs the untreated blank group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs the control group treated with 4%ethanol

Group Bax Bcl-2 Bax/Bcl-2 cleaved-caspase-3 Blank group 0.08±0.03 0.33±0.02 0.23±0.08 0.06±0.02 4%ethanol 0.36±0.01## 0.10±0.04## 3.50±0.78## 0.22±0.04##200μg/LPOP+4%ethanol 0.30±0.03* 0.15±0.04 2.25±0.46* 0.18±0.03 400μg/LPOP+4%ethanol 0.24±0.02** 0.20±0.04 1.70±0.24** 0.14±0.02*600μg/LPOP+4%ethanol 0.17±0.02** 0.24±0.06* 1.53±0.18** 0.12±0.02**

3 討論

在ALD的發(fā)病機制中，酒精誘導(dǎo)的氧化脅迫會促進肝細胞內(nèi)的ROS升高［1，9］。細胞內(nèi)自由基的過度累積可以引發(fā)細胞膜中脂質(zhì)的氧化，導(dǎo)致MDA的升高［2，4］。肝細胞中MDA水平反映酒精誘導(dǎo)的肝損傷中的脂質(zhì)過氧化程度。抗氧化劑包括酶促和非酶促抗氧化劑，其中細胞內(nèi)清除ROS的非酶抗氧化劑防御主要通過非酶抗氧化劑實現(xiàn)［16］。而非酶促抗氧化劑GSH是哺乳動物中含量最豐富的非蛋白硫醇，人類早已認識其在解毒和抵御氧化劑方面的核心作用［14］。酒精誘導(dǎo)的肝細胞會耗盡有助于細胞內(nèi)抗氧化的GSH水平［17，18］。因此，通過檢測培養(yǎng)基中HepG2細胞的ROS、MDA和GSH的含量可考察玉竹多糖對酒精處理HepG2細胞氧化應(yīng)激的影響。而氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞反應(yīng)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［5］。在酒精介導(dǎo)的肝臟損傷過程中，較高的ROS和MDA水平可誘導(dǎo)促炎細胞因子如IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生，并參與急性酒精性肝損傷［19］。因此，抑制炎癥也是治療慢性酒精肝損傷的方案之一［20］。以IL-1β和TNF-α水平為指標，我們考察了玉竹多糖對酒精誘導(dǎo)HepG2細胞的炎癥反應(yīng)的影響。而AST和ALT活性被公認為是酒精性肝細胞損傷的可靠和敏感的生理標志物［21］。我們的實驗結(jié)果表明，玉竹多糖不僅抑制酒精誘導(dǎo)的HepG2細胞氧化損傷，還可以抑制炎性因子水平的上升，保護肝細胞。

Nrf2是細胞內(nèi)調(diào)控氧化還原平衡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。當細胞暴露在與氧化應(yīng)激相關(guān)的因素（如ROS）中時，Nrf2會從Nrf2/Keap1復(fù)合體中釋放出來，磷酸化后從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核中啟動抗氧化酶磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化還原酶-1（NADPH quinineoxidoreductase-1，NQO-1）等的抗氧化毒性［7］。有報道稱，Nrf2/Keap1通路在阻止ALD發(fā)生的防御系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用［22］。在本研究中，通過檢測Nrf2核轉(zhuǎn)位和Keap1水平，研究玉竹多糖對Nrf2/Keap1信號通路激活的影響。結(jié)果表明，與酒精處理的細胞相比，玉竹多糖的預(yù)處理顯著提高細胞質(zhì)中Keap1和細胞核中p-Nrf2和NQO-1的蛋白表達水平。這提示，Nrf2/Keap1途徑的激活可能是玉竹多糖抗酒精肝損傷的細胞保護作用的潛在途徑之一。大量研究表明，酒精誘導(dǎo)的肝細胞凋亡與氧化應(yīng)激有關(guān)，添加抗氧化劑對酒精誘導(dǎo)的肝細胞凋亡具有保護作用［19］。已有研究證實，Bax、Bcl-2和cleaved-caspase-3是細胞凋亡過程中的重要蛋白，抑制cleaved-caspase-3蛋白表達和下調(diào)Bax/Bcl-2比率可抑制細胞的非正常凋亡［23］。實驗結(jié)果顯示，與酒精處理的細胞相比，玉竹多糖的預(yù)處理也顯著下調(diào)cleaved-caspase-3蛋白表達和Bax/Bcl-2指數(shù)，這表明玉竹多糖能減輕酒精誘導(dǎo)的氧化損傷所致細胞凋亡和肝毒性。

綜上，玉竹多糖能夠減少酒精誘導(dǎo)HepG2細胞應(yīng)激損傷的同時抑制促炎因子的釋放，保護肝細胞，其機制可能與玉竹多糖能激活Nrf2/Keap1信號通路，Nrf2磷酸化核轉(zhuǎn)位后上調(diào)NQO-1蛋白表達，使HepG2細胞免受酒精誘導(dǎo)的氧化損傷的同時還減輕炎性反應(yīng)，進而下調(diào)Bax/Bcl-2指數(shù)和cleavedcaspase-3蛋白表達，抵御細胞凋亡。然而Nrf2/Keap1通路是否是玉竹多糖調(diào)節(jié)減輕酒精誘導(dǎo)HepG2細胞損傷的唯一機制還待進一步實驗驗證。我們將在今后結(jié)合動物實驗、基因組學和代謝組學等實驗技術(shù)進一步探討基于Nrf2/Keap1信號通路保護酒精誘導(dǎo)肝細胞損傷，防治ALD的作用機制。