紀(jì)剛劍，林 雯，史瓊枝，李銀科

（1.湖北省武漢市第三醫(yī)院·武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院，湖北 武漢430060；2.黃石愛康醫(yī)院，湖北 黃石435000；3.中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，湖北 武漢430070）

全球第1個(gè)核糖核酸（RNA）干擾藥物patisiran（商品名Onpattro）于2018年10月8日獲得美國食品藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)上市［1］，小干擾核糖核酸（siRNA）目前已成為生物技術(shù)藥物研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。但裸露的siRNA易被血清中的核酸酶降解，且易被腎臟快速清除［2］。siRNA相對(duì)分子質(zhì)量較大（約14 000），所攜帶的負(fù)電荷制約其穿越體內(nèi)多種生物屏障［3］。因此，實(shí)現(xiàn)siRNA的有效遞送須構(gòu)建高效的載體遞送系統(tǒng)。原癌基因c-myc的活性改變是啟動(dòng)和維持細(xì)胞癌變狀態(tài)的重要因素，在體內(nèi)正常環(huán)境下的表達(dá)是被嚴(yán)格控制的。研究表明，抑制c-myc基因可產(chǎn)生顯著的抗癌效果。針對(duì)性抑制c-myc基因的siRNA應(yīng)用前景極好［4］。微泡與超聲技術(shù)相結(jié)合可提供一種非侵入式的藥物靶向遞送方法，通過增加腫瘤部位的血管通透性而提高藥物載體（微泡）的遞送效率［5］。但微泡被超聲激發(fā)破壞后，其中包載的藥物瞬間釋放完畢，難以實(shí)現(xiàn)藥物在靶部位的持續(xù)釋放［6］。聚乳酸-羥基乙酸共聚物-b-聚乙二醇（PLGA-b-PEG）是由聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）和聚乙二醇（PEG）構(gòu)成的雙單元共聚物，具有兩親性、生物相容易降解性、長循環(huán)性等特點(diǎn)。本研究中制備以PLGA-b-PEG為基質(zhì)的納米粒，包載可抑制c-myc基因的siRNA（5′-AACGUUAGCUUCACCAACAUU-3′）作為模型藥物［7］。將該納米粒與微泡一同注入體內(nèi)，納米粒和微泡將隨著血液循環(huán)流經(jīng)腫瘤部位，在體外的局部定點(diǎn)超聲作用下，微泡發(fā)生的空化作用暫時(shí)打開腫瘤血管壁屏障，納米粒借機(jī)進(jìn)入腫瘤部位釋放包載的siRNA；持續(xù)的局部超聲刺激可加快藥物在病灶部位的釋放速率，實(shí)現(xiàn)深部位腫瘤的siRNA定向、定速釋放。研究表明，在超聲波刺激誘導(dǎo)微泡的慣性空化作用下，腫瘤局部的血管通透性增加，搭載siRNA的PLGA-b-PEG納米粒更易透過血管壁，進(jìn)入腫瘤部位釋藥［8］，可增強(qiáng)腫瘤部位對(duì)納米粒子的實(shí)體瘤高通透性和滯留效應(yīng)（EPR），從而實(shí)現(xiàn)藥物的靶向遞送。目前，關(guān)于c-myc基因的siRNA遞送方案尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本研究中探討了載siRNA的PLGA-b-PEG納米粒的制備工藝，并對(duì)其進(jìn)行初步體外評(píng)價(jià)，以期為c-myc基因表達(dá)異常的相關(guān)實(shí)體瘤的基因治療提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與細(xì)胞

1.1 儀器

RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；3K15型冷凍離心機(jī)（美國Sigma公司）；AH100D型脂質(zhì)體擠出器（加拿大Avestin公司）；JY92-ⅡD型細(xì)胞超聲破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）；7500型透射電子顯微鏡（日本日立公司）；NanoWizarc?型原子力顯微鏡（德國JPK Instruments AG公司）；NICOMP 380ZLS型Zeta電位/粒度分析儀（美國Santa Barbara公司）；RF-5301型熒光分光光度計(jì)（日本島津公司）；Bio-rad680型酶標(biāo)儀（美國伯樂公司）；Intelect?2776型超聲波治療儀（美國Chattanooge公司，頻率為1 MHz，功率為4.5 W）。

1.2 試藥

PLGA-b-PEG（LA/GA=50/50，相對(duì)分子質(zhì)量為5 000，西安瑞喜生物科技有限公司，批號(hào)為BV2032）；siRNA和FAM-siRNA（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，批號(hào)均為20160613）；胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司，批號(hào)為20170118）；RPMI-1640培養(yǎng)基（批號(hào)為8119064），DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)為8117167），均購于美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，美國Sigma公司，批號(hào)為M-2128）；其余試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 細(xì)胞

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7與結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院惠贈(zèng)，分別傳代于第3代、第4代。

2 方法與結(jié)果

2.1 納米粒制備

采用復(fù)乳法制備納米粒［6］。取PLGA-b-PEG 100 mg，精密稱定，置30 mL燒杯中，加入10 mL二氯甲烷（含3%司盤-80，m/V）溶解基質(zhì)材料，磁力攪拌，緩慢滴加2 mL siRNA液［2 μmol/mL，使用前15 min配制，由經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）處理的含亞精胺水溶液配制，氮磷比為15∶1］，冰浴條件下超聲乳化（功率為30 W，工作2 s，停止2 s）120 s制備初乳；將初乳倒入60 mL 1%吐溫-80（m/V）水溶液中，冰浴條件下超聲乳化（功率為100 W，工作2 s，停止2 s）120 s制備復(fù)乳；磁力攪拌4 h，揮盡有機(jī)溶劑，固化，0.45 μm聚碳酸酯膜濾過，超濾管（截留相對(duì)分子質(zhì)量100 000）離心（3 000g）過濾純化，經(jīng)DEPC處理的純化水洗滌3遍，所得混懸液密封儲(chǔ)存于4℃冰箱。將siRNA液換成FAM-siRNA液，同法制備FAM-siRNA納米粒。

2.2 理化表征

形態(tài)：分別采用透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡對(duì)所制備的siRNA納米粒進(jìn)行形態(tài)觀察［7］。取少量納米粒樣品，經(jīng)蒸餾水適當(dāng)稀釋，滴加于電鏡專用樣品銅網(wǎng)，1%磷鎢酸染色，自然干燥，采用透射電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察。另取納米粒樣品少量，用蒸餾水稀釋，滴加于云母片，自然干燥，采用原子力顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察。由圖1可知，制備的載藥納米?；拘螒B(tài)均勻，外形為球形，粒子直徑為100 nm。

圖1 不同顯微鏡下siRNA納米粒形態(tài)觀察A.TEM B.AFM（fast）Fig.1 Morphological observation of nanoparticles loading the siRNA with different microscopes

粒徑分布和Zeta電位：采用Zeta電位/粒度分析儀測(cè)定。儀器參數(shù)設(shè)置，激光掃描波長639 nm，入射光與散射光的夾角90°，測(cè)定溫度23℃。由圖2可知，所制備納米粒的平均粒徑為（101.5±6.3）nm，多分散系數(shù)（PDI）為0.095±0.008，Zeta電位為-（31.7±4.5）mV。粒徑儀測(cè)定的粒徑結(jié)果與透射電子顯微鏡、原子力顯微鏡的結(jié)果一致。

圖2 siRNA納米粒粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of nanoparticles loading the siRNA

包封率：用TE緩沖液［10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA］配制系列FAM-siRNA標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度為0.03～0.27 μg/mL），采用熒光分光光度法進(jìn)行測(cè)定，設(shè)置儀器參數(shù)Ex/Em為490/515 nm［9］，以熒光強(qiáng)度（F）對(duì)樣品濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程F=0.449 11C+0.396 34（R2=0.999 7）。結(jié)果表明，F(xiàn)AM-siRNA濃度在2～20 nmol/L范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度線性關(guān)系良好。冷凍干燥納米粒樣品混懸液，精密稱定，加入乙腈溶解，TE緩沖液稀釋，測(cè)定熒光強(qiáng)度，代入回歸方程，計(jì)算總體載藥量（L總）；用超濾管（截留相對(duì)分子質(zhì)量100 000）離心（3 000g）分離納米粒懸液，測(cè)定游離的藥物量（L游），計(jì)算納米粒的包封率。包封率=（L總-L游）/L總×100%。結(jié)果FAM-siRNA納米粒的包封率為（57.6±4.8）%。

2.3 穩(wěn)定性考察

取FAM-siRNA納米粒樣品懸液0.5 mL，置10 mL磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）中，混合，密封，置4℃冰箱，第0天和制備后第30天取樣，測(cè)定粒徑、電位和包封率，考察4℃條件下的制劑穩(wěn)定性［9］。結(jié)果在4℃條件下放置30 d，納米粒的粒徑為（103.3±5.7）nm，PDI為0.097±0.009，Zeta電位為-（32.5±5.2）mV，包封率為（55.2±5.7）%；4℃條件下第0天，粒徑為（101.5±6.3）nm，PDI為0.095±0.008，Zeta電位為-（31.7±4.5）mV，包封率為（57.6±4.8）%?？梢姡?天與第30天測(cè)定結(jié)果基本一致，表明4℃環(huán)境下納米粒在PBS中的穩(wěn)定性良好。

2.4 體外釋藥考察

采用透析袋法考察。精密量取樣品懸液1.0 mL，置透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量100 000）中，兩端夾緊，置100 mL PBS（pH 7.4）中，37℃恒溫?fù)u床（轉(zhuǎn)速為75 r/min）振搖。平行配制12份，分為超聲組和未超聲組。超聲組在1 h時(shí)利用Intelect?2776型超聲波治療儀超聲（頻率為1 MHz，功率為1 W/cm2）處理20 min。分別于0，1，2，4，6，8，12，24，48 h時(shí)取樣，同時(shí)補(bǔ)加釋放介質(zhì)［9］，參照包封率測(cè)定項(xiàng)下測(cè)定釋放的FAM-siRNA濃度，計(jì)算累積釋放率，繪制釋藥曲線。由圖3可知，納米粒在體外模擬條件下釋藥平穩(wěn)、持續(xù)。前24 h的累積釋放量為載藥量的65%～75%，余下部分于后續(xù)24 h內(nèi)基本釋放完畢。超聲組FAM-siRNA于處理后2 h的累積釋放量較未超聲組高10%，表明制備的納米粒具有一定的超聲刺激釋藥特性，結(jié)合聲敏微泡可能促進(jìn)在靶部位的釋藥。

圖3 FAM-siRNA納米粒的體外釋藥曲線Fig.3 Profiles of drug release in vitro of FAM-siRNA nanoparticles

2.5 MTT法檢測(cè)載體對(duì)細(xì)胞增殖的影響

將MCF-7與HT-29細(xì)胞以1.0×104個(gè)/孔的密度分別接種于48孔板中，37℃及5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h［10-11］。分別設(shè)立空白對(duì)照組（Blank）、超聲空白對(duì)照組（Blank+US）、siRNA組（siRNA）、空白納米粒組（Blank NP）、siRNA納米粒組（siRNA NP）、siRNA納米粒超聲組（siRNA NP+US）。加樣體積為25 μL，含藥組的每孔siRNA濃度為25 nmol/L。超聲處理（功率為1 W/cm2，頻率為1 MHz）siRNA NP+US。加樣后繼續(xù)培養(yǎng)60 h，棄去原培養(yǎng)液，加入培養(yǎng)液［含20 μL MTT（5 mg/mL）］200 μL培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，加入200 μL二甲基亞砜（DMSO）溶解，采用酶標(biāo)儀于540 nm波長處測(cè)定吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。由圖4可知，載藥納米粒組（siRNA NP，siRNA NP+US）與其他組（Blank，Blank+US，siRNA，Blank NP）之間的（MCF-7，HT-29）細(xì)胞存活率有顯著差異（P＜0.05）；載藥納米粒組和其他組（MCF-7，HT-29）組內(nèi)無顯著差異（P＞0.05）。從趨勢(shì)上看，siRNA的存活率略低于Blank，siRNA NP和siRNA NP+US均低于siRNA。

圖4 體外細(xì)胞活性（n=6）Fig.4 Cell viability in vitro（n=6）

3 討論

納米粒的基質(zhì)材料PLGA-b-PEG具有兩親性，而siRNA親水性強(qiáng)，難以直接包裹進(jìn)入納米粒的內(nèi)部疏水區(qū)域，故本研究中采用復(fù)乳法制備納米粒，以提高藥物包封率。處方中采用了2種乳化劑，根據(jù)乳化劑的親水/親油平衡系數(shù)（HLB），親油性的司盤80（HLB=4.3）用于穩(wěn)定初乳W/O，親水性的吐溫80（HLB=15.0）用于復(fù)乳W/O/W的穩(wěn)定［12-13］。為了提高siRNA的穩(wěn)定性和包封率，處方中的siRNA先用帶正電的亞精胺中和，再包載入納米粒，將減少乳化超聲過程中產(chǎn)生的熱量對(duì)siRNA的破壞，于冰浴條件下超聲乳化吸收多余熱量［14-16］。此外，為減少環(huán)境中核酸酶對(duì)藥物的降解作用，使用前均用RNA酶滅活劑DEPC對(duì)試驗(yàn)器具進(jìn)行預(yù)處理［9］。

考慮縮短制備工藝的過濾時(shí)間，本研究中采用0.45 μm濾膜進(jìn)行初濾，超濾管進(jìn)行納米粒的過濾純化，未采用脂質(zhì)體制備中常用的100～200 nm濾膜進(jìn)行過濾。納米粒的剛性比脂質(zhì)體大，過膜阻力大于脂質(zhì)體，故采用預(yù)過濾后再超濾。粒徑100 nm的納米粒常用于體內(nèi)藥物的靶向遞送［17-19］，故選擇納米粒的粒徑為100 nm。試驗(yàn)制備的空白納米粒的Zeta電位為-22 mV，而含siRNA的納米粒的Zeta電位為-31 mV，這可能與部分未包封的siRNA吸附在納米粒表面有關(guān)［20］。由于基質(zhì)材料PLGA-b-PEG和模型藥物均帶負(fù)電，根據(jù)同種電荷相斥的原理，可能導(dǎo)致siRNA藥物在PLGA-b-PEG材料中的包封率較低。

由于目前直接測(cè)定樣品中siRNA含量的方法較復(fù)雜，本研究中采用標(biāo)記后的FAM-siRNA代替siRNA進(jìn)行包封率和釋放度的考察。但這種熒光標(biāo)記的siRNA可能并不能完全反映實(shí)際的siRNA情況，最終應(yīng)以凝膠電泳法測(cè)定結(jié)果為準(zhǔn)［21］。由圖3可知，siRNA的釋放速率前快后慢，可能與在納米粒內(nèi)部的藥物需通過一段時(shí)間的擴(kuò)散才能釋放到粒子表面有關(guān)。在超聲作用下，超聲組FAM-siRNA于處理后2 h的累積釋放率較未超聲組高10%，提示超聲作用有助于藥物釋放。本研究中制備的納米粒在超聲作用下可加快藥物釋放，且具有緩釋效果，可確保載體在進(jìn)入位點(diǎn)后持續(xù)釋藥一段時(shí)間，延長藥物的靶向治療效果。

由圖4可知，超聲作用、空白載體與游離的siRNA幾乎均不影響MCF-7和HT-29腫瘤細(xì)胞的活性，游離的siRNA對(duì)2種腫瘤細(xì)胞存在一定抑制作用，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。可能與游離的siRNA在培養(yǎng)基中易被降解，且穿透細(xì)胞膜的能力低有關(guān)。載有siRNA的納米?？杀患?xì)胞攝入，顯現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞抑制作用。在超聲波作用下，siRNA NP+US顯現(xiàn)出較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞活性抑制作用，這可能與超聲波可臨時(shí)打開細(xì)胞膜屏障有關(guān)［22］。此外，預(yù)試驗(yàn)中，細(xì)胞培養(yǎng)48 h時(shí)各組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而培養(yǎng)60 h才表現(xiàn)出顯著差異，提示細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)長對(duì)結(jié)果有很大影響。

本研究中意圖構(gòu)建的siRNA遞送策略是通過超聲刺激腫瘤局部的聲敏微泡產(chǎn)生空化作用而提高腫瘤部位的血管通透性，進(jìn)而提高納米粒在腫瘤部位的EPR效應(yīng)而進(jìn)入靶部位釋放siRNA，涉及超聲波功率、頻率、作用時(shí)長及微泡的理化特性等因素。本研究結(jié)果僅限于載體的制備方法和初步的體外評(píng)價(jià)，后續(xù)研究將作深入探討。

綜上所述，PLGA-b-PEG包裹的siRNA納米粒具有超聲刺激靶向釋藥特性，在siRNA腫瘤靶向給藥應(yīng)用方面具有較好的潛力。