鄭為超,王 嵐，方 葉，尤佳鋒，梁倩倩

(1.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽 淮南 232001；2.上海市中醫(yī)藥研究院脊柱病研究所，上海 200032；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫性疾病，受累關(guān)節(jié)處疼痛并伴有畸形，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)[1]。炎癥水平與RA的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，因此控制炎癥是防治RA的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。目前控制RA炎癥水平的常用藥物包括非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素，但副作用明顯，價(jià)格昂貴，難以長(zhǎng)期服用。因此，尋找簡(jiǎn)便廉效的治療藥物已成為亟待解決的重要問(wèn)題[3]。

淋巴系統(tǒng)具有回流炎癥物質(zhì)[4]和調(diào)節(jié)免疫的重要作用[5]。促進(jìn)淋巴管新生，可以保持組織液滲透壓的平衡，加速局部水腫消退，回流聚集的炎癥因子可減輕炎癥反應(yīng)[6]。文獻(xiàn)[7]研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)內(nèi)注射(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C，VEGF-C)可增加淋巴管新生，改善炎癥性關(guān)節(jié)的淋巴回流，減輕關(guān)節(jié)炎癥。TNF-Tg小鼠腹腔內(nèi)注射(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子R-3，VEGF-R3)中和性抗體抑制淋巴回流，會(huì)加重關(guān)節(jié)炎癥[8]；應(yīng)用炎癥信號(hào)通路抑制劑，可以改善關(guān)節(jié)疼痛情況[9]，但影響淋巴回流減輕炎癥的機(jī)制尚不明確。免疫系統(tǒng)內(nèi)M1型巨噬細(xì)胞分泌的促炎因子和趨化因子可導(dǎo)致RA的慢性滑膜炎癥[10]。因此，通過(guò)調(diào)控淋巴管系統(tǒng)，促進(jìn)淋巴管新生和抑制M1型巨噬細(xì)胞，從而抑制炎癥反應(yīng)，可能是防治RA的潛在靶點(diǎn)。

獨(dú)活寄生湯出自《備急千金藥方》，具有補(bǔ)血益氣、驅(qū)邪扶正之功效，是臨床上防治RA的經(jīng)典方劑，對(duì)治療RA的效果顯著，在臨床上已被廣泛應(yīng)用[11]。獨(dú)活寄生湯能否通過(guò)促進(jìn)淋巴管回流和抑制M1型巨噬細(xì)胞，抑制關(guān)節(jié)滑膜炎癥防治RA尚不清楚。因此本研究以TNF-Tg小鼠建立炎癥性關(guān)節(jié)病模型，從淋巴管系統(tǒng)角度探討?yīng)毣罴纳鷾乐蜶A的藥效與藥理研究，以期為中醫(yī)藥調(diào)節(jié)淋巴系統(tǒng)防治類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供新思路。

1 材料

1.1 動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)所用TNF-Tg小鼠由G.Kollias博士贈(zèng)與，并與C57BL/6小鼠回交以保持雜合子，這一品系的TNF-Tg小鼠攜帶一份人類(lèi)TNF轉(zhuǎn)基因表型，并發(fā)展出一種與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)非常相似的疾病，其特征是自發(fā)的、慢性的、進(jìn)行性的炎癥性侵蝕性關(guān)節(jié)疾病，小鼠交予上海南方模式動(dòng)物公司飼養(yǎng)繁育(SPF級(jí)，自由飲水?dāng)z食)。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬)2017-0010。動(dòng)物操作過(guò)程符合國(guó)際、國(guó)內(nèi)相關(guān)生物醫(yī)學(xué)研究倫理規(guī)范，做到善待動(dòng)物，防止或減少動(dòng)物的應(yīng)激、痛苦和傷害。

1.2 儀器

ASP300s全自動(dòng)組織脫水機(jī)，德國(guó)LEICA公司；EG1150C石蠟包埋機(jī)，德國(guó)LEICA公司；HI1210組織展片機(jī)，德國(guó)LEICA公司；RM2135石蠟切片機(jī)，德國(guó)LEICA公司；VS120-SL全片掃描儀，日本OLYMPUS公司

1.3 藥物

獨(dú)活寄生湯藥物組成包括：獨(dú)活9g、桑寄生6g、杜仲6g、牛膝6g、細(xì)辛6g、秦艽6g、茯苓6g、肉桂6g、防風(fēng)6g、川芎6g、人參6g、甘草6g、當(dāng)歸6g、芍藥6g、地黃6g。所有中藥均購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房。將中藥煎煮濃縮成1.2kg/L，儲(chǔ)存于-20℃保存。

1.4 試劑

焰紅燃料B(Phloxine B，sigma，P2759-25G)，無(wú)水冰醋酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，10018818),橙黃G(Orange G，O3756-25G),蘇木精(Hematoxylin，sigma，H3136-25G),阿爾新藍(lán)(Alcian blue 8GX，sigma，A5268),伊紅(Eosin Y，sigma，E4009-5G),中性樹(shù)膠(中國(guó)上海標(biāo)本模型廠),胰蛋白酶抗原修復(fù)液(雷根生物，IH0310)，抗淋巴內(nèi)皮透明質(zhì)酸抗體(Abcam,ab14917),抗平足蛋白抗體(Abcam，ab11936)，Alexa Fluor? 488熒光Anti-F4/80抗體(Abcam，ab204266)，重組Alexa Fluor? 647熒光Anti-iNOS抗體(Abcam,ab209027)，Anti-rat IgG(H+L)，(cell signaling，#4417s)，Anti-rabbit IgG (H+L),(cell signaling，#4412s)，免疫熒光封片劑(vector vectashield，H1200)

2 方法

2.1 分組及給藥

3月齡TNF-Tg轉(zhuǎn)基因小鼠10只用作RA動(dòng)物模型，將小鼠隨機(jī)分為T(mén)NF-Tg組和DHJST治療組，5只/組，另取5只同窩生野生型小鼠作為Control組。根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藥理學(xué)》，將小鼠(20g)與人(70kg)的中藥劑量進(jìn)行換算(換算系數(shù)9.01)，獨(dú)活寄生湯組以12g/kg；對(duì)照組與模型組給予相同體積的生理鹽水，每天灌胃1次，連續(xù)12周。

2.2 標(biāo)本處理

小鼠連續(xù)給藥3個(gè)月后采用放血法將小鼠處死，取完整踝關(guān)節(jié)，將標(biāo)本置于10%福爾馬林固定液中24h，清水沖洗30min，14%EDTA脫鈣4周，每2d更換脫鈣液，取出踝關(guān)節(jié)，流水沖洗2h將組織脫水后，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片。

2.3 踝關(guān)節(jié)組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)

取石蠟標(biāo)本進(jìn)行阿爾新藍(lán)-蘇木精形態(tài)學(xué)染色(ABOG染色)，石蠟切片脫蠟至水，阿爾新藍(lán)-蘇木精浸染40min，2%鹽酸乙醇分化5s，0.5%氨水返藍(lán)15s，水洗，橙紅染液浸染1min，不水洗后乙醇梯度脫水至透明，二甲苯透片，中性樹(shù)膠封片。VS120全片掃描儀掃描，觀察踝關(guān)節(jié)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

2.4 M1型巨噬細(xì)胞免疫熒光染色

石蠟切片脫蠟至水；37℃胰蛋白酶抗原修復(fù)15min，水洗3遍，4%BSA室溫封閉60min，一抗(F4/80)1∶400，一抗(iNOS)1∶200比例稀釋混合，4℃避光孵育過(guò)夜，BSA浸洗3次，熒光封片劑封片，即刻VS120全片掃描儀(熒光模式)掃描，觀察踝關(guān)節(jié)周?chē)鶰1型巨噬細(xì)胞分布情況。

2.5 淋巴管免疫熒光染色

石蠟切片脫蠟至水；37℃胰蛋白酶抗原修復(fù)15min，水洗3遍，4%BSA室溫封閉60min，一抗(LYVE-1和Podoplanin)均以1∶500比例稀釋混合，4℃孵育過(guò)夜，PBS浸洗3遍；二抗1∶400避光孵育1h，PBS洗3遍；熒光封片劑封片，即刻VS120全片掃描儀(熒光模式)掃描，觀察踝關(guān)節(jié)淋巴管分布情況。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述，多組間比較采用單因素方差分析(oneway ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。散點(diǎn)圖由GraphPad Prism 8繪制完成。

3 結(jié)果與分析

3.1 獨(dú)活寄生湯對(duì)TNF-Tg小鼠骨與軟骨影響

ABOG染色結(jié)果顯示，Control組距骨形態(tài)完整，軟骨表面光滑且連續(xù)，TNF-Tg組距骨形態(tài)和軟骨結(jié)構(gòu)均被破壞， DHJST組距骨形態(tài)和軟骨有一定程度恢復(fù)， 如圖1(a)所示。在軟骨結(jié)構(gòu)方面，與Control組比較，TNF-Tg組小鼠踝關(guān)節(jié)軟骨減少(P<0.01)；與TNF-Tg組對(duì)比， DHJST組軟骨結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)(P<0.01)， 如圖1(b)所示。 骨形態(tài)方面， 與Control組比較， TNF-Tg組距骨侵蝕嚴(yán)重， 形態(tài)和完整性被破壞(P<0.01)； 與TNF-Tg組比較， DHJST組踝關(guān)節(jié)距骨形態(tài)及完整性有一定程度恢復(fù)(P<0.05)，如圖1(c)所示。組織炎癥浸潤(rùn)分析顯示,與Control組相比，TNF-Tg組炎癥浸潤(rùn)面積顯著增加(P<0.01)；與TNF-Tg組比較，DHJST組炎癥浸潤(rùn)面積減少(P<0.01)，如圖1(d)所示。

(a)小鼠踝關(guān)節(jié)ABOG染色圖

3.2 獨(dú)活寄生湯對(duì)TNF-Tg小鼠淋巴管影響

抗淋巴內(nèi)皮透明質(zhì)酸抗體(Anti-LYVE-1)和抗平足蛋白抗體(Anti-Podoplanin)雙染則表示毛細(xì)淋巴管，抗平足蛋白抗體(Anti-Podoplanin)單染則為集合淋巴管，如圖2(a)所示。淋巴管免疫熒光染色結(jié)果顯示，與Control組比較，TNF-Tg組毛細(xì)淋巴管生成增加(P<0.01)，集合淋巴管覆蓋面積增多(P<0.01)；與TNF-Tg組比較，DHJST組毛細(xì)淋巴管顯著增多(P<0.01)，集合淋巴管覆蓋面積更廣(P<0.01)，如圖2(b)～(c)所示。

(a)小鼠踝關(guān)節(jié)淋巴管免疫熒光染色圖

3.3 獨(dú)活寄生湯對(duì)TNF-Tg小鼠巨噬細(xì)胞影響

Anti-F4/80抗體和Anti-iNOS抗體雙染所示M1型巨噬細(xì)胞，如圖3(a)所示。組織免疫熒光染色結(jié)果顯示，與Control組比較，TNF-Tg組M1型巨噬細(xì)胞染色面積增大，細(xì)胞數(shù)量增多，炎癥在關(guān)節(jié)處浸潤(rùn)情況嚴(yán)重(P<0.01)；與TNF-Tg組相比，DHJST組M1型巨噬細(xì)胞減少，炎癥在關(guān)節(jié)的浸潤(rùn)情況改善(P<0.01)，如圖3(b)所示。

(a)小鼠踝關(guān)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫熒光染色圖

4 討論

RA在中醫(yī)屬“痹證”范疇，痹即有閉阻不通之意。中醫(yī)中“痹癥”不通則痛的特點(diǎn)與淋巴回流功能受阻導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎的癥狀極為相似。中醫(yī)認(rèn)為，引起RA發(fā)病的機(jī)理是由于正氣不足，風(fēng)、寒、濕、暑等外邪侵入人體使臟腑功能失調(diào)，加上氣血不足導(dǎo)致體質(zhì)虛弱，從而引起皮肉不堅(jiān)而痹癥發(fā)[12]。獨(dú)活寄生湯出自唐代孫思邈的《備急千金要方》，是中醫(yī)臨床治療RA的經(jīng)典方[13]，具有祛風(fēng)濕、止痹痛、益肝腎、補(bǔ)氣的功效。前期研究發(fā)現(xiàn)，獨(dú)活寄生湯可以降低RA大鼠體內(nèi)白細(xì)胞介素-1(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥因子水平，緩解炎癥情況[14]。

本研究采用TNF-α轉(zhuǎn)基因(TNF-Tg)小鼠模型，觀察獨(dú)活寄生湯對(duì)RA炎癥免疫反應(yīng)及淋巴回流功能的影響。本實(shí)驗(yàn)ABOG染色結(jié)果顯示，TNF-Tg小鼠軟骨及骨侵蝕嚴(yán)重，炎癥浸軟面積增大，DHJST組軟骨結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，炎癥面積減少，說(shuō)明獨(dú)活寄生湯干預(yù)后可逆轉(zhuǎn)TNF-Tg小鼠骨及軟骨形態(tài)，減輕炎癥浸潤(rùn)，減緩類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎進(jìn)程。

RA的發(fā)生發(fā)展伴有關(guān)節(jié)組織損傷、強(qiáng)烈的炎癥免疫反應(yīng)及淋巴循環(huán)功能障礙。炎癥初始階段，外周和引流淋巴結(jié)之間通過(guò)擴(kuò)張的淋巴管網(wǎng)和分子運(yùn)輸功能，代償調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)程度，保護(hù)機(jī)體免受?chē)?yán)重?fù)p傷[8]。隨著病程的進(jìn)一步發(fā)展，大量炎癥因子聚集在受累關(guān)節(jié)處，使得淋巴管的收縮功能受到損傷，淋巴回流功能障礙。炎癥誘導(dǎo)的淋巴管生成是慢性關(guān)節(jié)炎病程中限制關(guān)節(jié)炎癥的重要補(bǔ)償機(jī)制，改善和維持足夠的淋巴引流可能代表慢性炎癥性疾病的新治療策略。

淋巴管影響外滲液體、炎癥介質(zhì)和白細(xì)胞的排出，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[15]。淋巴管免疫熒光染色顯示，TNF-Tg小鼠滑膜中淋巴管新生。獨(dú)活寄生湯干預(yù)后，毛細(xì)淋巴管生成增多，集合淋巴管分布更廣。結(jié)果表明,獨(dú)活寄生湯可能通過(guò)促進(jìn)淋巴新生，增強(qiáng)淋巴回流功能，加快局部炎癥介質(zhì)和外滲液體回流，進(jìn)而減輕炎癥及水腫情況。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因(TNF-α)是影響RA的重要炎癥因子，主要由滑膜產(chǎn)生[16]。TNF-α在滑膜處大量積聚，促進(jìn)周?chē)馨凸艿男律鰪?qiáng)淋巴回流功能，可以加快周?chē)装Y因子的清除，緩解RA的炎癥反應(yīng)。

巨噬細(xì)胞對(duì)RA的炎癥免疫反應(yīng)及骨量的變化也有影響。影響炎癥方面，眾所周知M1型巨噬細(xì)胞主要分泌促炎因子，加重RA關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)。M2型巨噬細(xì)胞分泌抗炎因子，可以抑制RA的發(fā)展進(jìn)程[17]。影響骨量方面，M1型或M2型單核細(xì)胞失衡促進(jìn)RA患者的破骨細(xì)胞生成，滑膜中激活的巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的相互作用驅(qū)動(dòng)滑膜肥大，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨的進(jìn)行性破壞。本實(shí)驗(yàn)顯示，TNF-Tg小鼠M1型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加，而DHJST組M1型巨噬細(xì)胞減少、炎癥改善。這說(shuō)明獨(dú)活寄生湯干預(yù)可以減少M(fèi)1型巨噬細(xì)胞在TNF-Tg小鼠踝關(guān)節(jié)處的浸潤(rùn)，減輕炎癥免疫反應(yīng)。有研究報(bào)告指出，在RA患者和小鼠關(guān)節(jié)炎模型中發(fā)現(xiàn)滑膜中M1/M2比例增加，促進(jìn)破骨細(xì)胞形成[18]。此外，淋巴管的生成也與巨噬細(xì)胞有關(guān)，巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF-C)為淋巴管新生提供微環(huán)境[19]?？梢?jiàn)巨噬細(xì)胞極化水平對(duì)RA的炎癥發(fā)生和骨量的變化以及淋巴管的新生關(guān)系密切。

本研究發(fā)現(xiàn)獨(dú)活寄生湯有促進(jìn)TNF-Tg小鼠淋巴管的新生及回流功能，減少M(fèi)1型巨噬細(xì)胞數(shù)量，減輕炎癥反應(yīng)的效果。因此，獨(dú)活寄生湯可以應(yīng)用到相關(guān)中西醫(yī)結(jié)合治療RA的臨床和基礎(chǔ)研究中。本研究的局限性在于，獨(dú)活寄生湯抗類(lèi)風(fēng)濕作用的機(jī)制尚未完全闡明，因此無(wú)法確定獨(dú)活寄生湯影響的靶點(diǎn),不能對(duì)特定的靶點(diǎn)進(jìn)行針對(duì)性的調(diào)節(jié)。雖然獨(dú)活寄生湯的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還有待探索，但單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是RA的相關(guān)治療靶點(diǎn)，今后可針對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行深入研究。