耿錦楠張雅青張煦 陸濱

1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2.西北民族大學(xué)，甘肅 蘭州 730030；3.蘭州大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；4.蘭州市第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

食管癌（esophageal carcinoma，EC）是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在惡性腫瘤中居第九位，病死率居第六位[1-2］，嚴(yán)重威脅人類生命安全。中國是EC高發(fā)國家，全球每年約50%的新發(fā)EC病例在我國，其中食管鱗癌（esophageal squamous cell cancer，ESCC）是其最常見的病理亞型[3］，約占EC的90%[3，4］。進(jìn)行性咽下困難是ESCC的典型臨床癥狀，但該病早期進(jìn)展緩慢，偶有不適感或癥狀輕重不一，因而發(fā)病早期通常無法及時(shí)察覺，確診時(shí)多數(shù)患者已處于中晚期，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移造成死亡率較高，給患者及其家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。因此，有必要探尋一種可用于食管癌早期診斷、靶向治療、復(fù)發(fā)監(jiān)測及預(yù)后判斷的高效能手段。

近年來，高通量測序技術(shù)的發(fā)展速度很快，非編碼RNA的應(yīng)用逐漸受到關(guān)注。長鏈非編碼RNA（LncRNA）普遍存在于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核，它是一類長度＞200個核苷酸的RNA，且無法編碼蛋白質(zhì)[5］。有證據(jù)表明LncRNA具有廣泛的生物學(xué)作用，其異常表達(dá)可能與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6］，但現(xiàn)階段人們對LncRNA的具體機(jī)制及相關(guān)功能所知甚少。癌癥相關(guān)區(qū)域長鏈非編碼RNA5（CARLo-5）最初發(fā)現(xiàn)于結(jié)腸癌中，后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)于肝癌、肺癌等惡性腫瘤[7］，但其在EC組織中表達(dá)及臨床意義的研究報(bào)道較少。本研究采用Realtime-PCR法檢測患者癌組織及對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本CARLo-5表達(dá)水平，分析CARLo-5在EC組織中的表達(dá)情況及其與EC患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年3月至2016年10月行食管癌根治術(shù)的食管癌患者58例，每例患者均取癌組織及非癌組織（距癌組織＞5cm）標(biāo)本，上述標(biāo)本均有詳細(xì)完整的臨床資料及組織病理診斷。采集標(biāo)本后存于離心管中（無RNA酶），置-80℃冰箱保存。58例患者中男性41例，女性17例，年齡42～78歲，平均（59.87±8.76）歲。參照2017年國際抗癌聯(lián)盟（union for interna tional cancer control，UICC）和美國癌癥聯(lián)合會（American joint committee on cancer，AJCC）發(fā)布的食管癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)（第8版）進(jìn)行分期，依據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）病理分級標(biāo)準(zhǔn)[8］確定分化程度（1級：高度分化；2級：中度分化；3級：低度分化）。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)。①術(shù)后病理證實(shí)為食管鱗癌，均行根治性切除術(shù)；②均為原發(fā)性食管鱗癌，術(shù)前未行放化療；③本研究經(jīng)蘭州大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)；④標(biāo)本采集獲得患者及家屬同意，均簽署知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)。①心、肝、腎等重要臟器功能不全者；②合并自身免疫疾病或精神疾病者；③食管腺癌（EAC）或并發(fā)其他惡性腫瘤者。

1.3 主要儀器及試劑 光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司，BX41型）、倒置相差顯微鏡（日本Niko公司，TS100型）、生物安全柜（山東濟(jì)南鑫貝西公司，BSC-1500ⅡA型）、PCR儀（美國ABI公司，ABI5700型）、Realtime-PCR（Applied Biosystems公司，7500型）、高速低溫離心機(jī)（TTICH-400型）、無菌培養(yǎng)瓶（美國Costar公司）、TRIzolR試劑（美國Invitrogen Life Technologies公司）、SYBR Real-Time PCR試劑盒（美國Thermo公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Invitrogen公司）、細(xì)胞裂解液（北京索萊寶科技有限公司）、PCR引物（上海生工技術(shù)有限公司）等。

1.4 檢測方法 ①總RNA提取及鑒定：a.實(shí)驗(yàn)前制冰，以離心機(jī)預(yù)冷20min；固體組織置于培養(yǎng)皿，以手術(shù)剪剪成小塊（約3mm×3mm）后置于研磨器中，加入TRIzol裂解液，充分研磨后將組織勻漿液移至1.5mLEP管；加200μL氯仿至EP管，手動震蕩12s，后冰上靜置10min，4℃下12000rpm離心30min；吸取無色液相置入新EP管（取上層，500μL即可），后加異丙醇500μL，混勻后冰上靜置10min，4℃下離心30min；棄上清見RNA沉入管底，加75%乙醇1mL至EP管中后溫和震蕩，使RNA再度懸浮，4℃下離心5min；棄上清，以槍頭吸取剩余乙醇，室溫下晾干；RNA沉淀與焦碳酸二乙酯（DEPC）水相溶后，-80℃下保存待用。b.RNA檢測：以0.1%DEPC水調(diào)零檢測儀，取1μL RNA稀釋液測定濃度、純度，A260/A280介于1.8～2.0時(shí)視為純度合格，無污染。即刻讀取濃度，其濃度介于500～1000ng/μL間最為適宜，酌加0.1%DEPC水調(diào)整。②Realtime-PCR法檢測CARLo-5表達(dá)水平：a.反轉(zhuǎn)錄合成cDNA：采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成RNA至cDNA制備，于-20℃下保存?zhèn)溆茫籦.PCR擴(kuò)增：PCR引物：設(shè)計(jì)合成后引物呈粉末狀，以離心機(jī)高速離心，參照摩爾數(shù)適量添加DEPC水，配制儲存液（濃度為100mmol/L）后保存，工作液濃度10mmol/L，引物序列見表1；PCR反應(yīng)條件：CARLo-5/GAPDH：95℃預(yù)變性5min，設(shè)定循環(huán)參數(shù)（95℃15s、60℃30s、72℃30s，共40次），72℃延伸5min。c.目的基因鑒定：取DNAladder、目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各5μL，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參照，分析灰度值比或以2-ΔΔCT表示各目的基因相對表達(dá)量。根據(jù)EC組織中CARLo-5相對表達(dá)倍數(shù)（癌/癌旁組織）之中位數(shù)分化低表達(dá)組（癌/癌旁組織＜2.80，24例）和高表達(dá)組（癌/癌旁組織＞2.80，34例）。以EC組織中CARLo-5相對表達(dá)量平均數(shù)4.25為分界點(diǎn)，分為CARLo-5高表達(dá)組和低表達(dá)組。

表1 引物序列及擴(kuò)增條件

1.5 隨訪 以門診和電話隨訪等方式開展術(shù)后隨訪，隨訪截止日期為2019年11月10日。以手術(shù)開始至死亡或末次隨訪時(shí)間定義總生存期（overall survival，OS），分析其術(shù)后生存情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用（±s）表示，以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以%表示，予χ2檢驗(yàn)；以COX分析法分析影響EC患者生存情況的相關(guān)因素，以Kaplan-Meier曲線分析生存情況，組間行Log-Rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EC組織及癌旁組織中CARLo-5表達(dá)水平比較Realtime-PCR檢測結(jié)果顯示，EC組織中CARLo-5相對表達(dá)量上調(diào)（4.25±9.02）明顯高于配對癌旁組織（1.09±0.95），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.653，P＜0.05）。見圖1，2。

圖1 LncRNA CARLo-5在食管癌和癌旁組織中的表達(dá)水平

2.2 CARLo-5與EC患者臨床病理特征的關(guān)系 食管癌組織中CARLo-5表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤分化程度、位置和大小無關(guān)（P＞0.05），與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)（P＜0.05）。見表2。

表2 CARLo-5與EC患者臨床病理特征的關(guān)系（例）

2.3 EC患者CARLo-5表達(dá)與生存情況的關(guān)系CARLo-5高表達(dá)組生存率顯著低于CARLo-5低表達(dá)組（χ2=6.941，P＜0.05，高表達(dá)組平均生存期為（24.39±1.68）月，低表達(dá)組平均生存期為（31.42±1.48）月，高表達(dá)組生存期顯著短于低表達(dá)組（t=2.653，P＜0.05）。見圖2。

圖2 EC患者CARLo-5表達(dá)與生存情況的關(guān)系

2.4 EC患者OS影響因素的Cox分析 單因素分析顯示TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CARLo-5表達(dá)水平為影響EC患者OS的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表3。COX多因素回歸分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CARLo-5表達(dá)水平是影響OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表4。

表3 影響EC患者OS的單因素分析

表4 影響EC患者OS的Cox多因素回歸分析

3 討論

EC主要有ESCC和EAC兩種組織學(xué)形式，前者多因食管鱗狀上皮細(xì)胞不典型增生演變發(fā)展而來，后者則由食管下段復(fù)層上皮緩慢演變或腸上皮細(xì)胞化生而來，近年來其發(fā)生率呈不斷升高態(tài)勢。我國北方地區(qū)是EC高發(fā)地區(qū)，其中主要為ESCC。據(jù)報(bào)道[9-10］，與EC死亡相關(guān)病例約50%以上發(fā)生于中國，防治形勢十分嚴(yán)峻。

近年來，轉(zhuǎn)錄組學(xué)及高通量測序技術(shù)的研究獲得較大進(jìn)展，人們發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)基因被轉(zhuǎn)錄成ncRNA，且上述基因在漫長的生物進(jìn)化過程中得以保留，這對傳統(tǒng)基因表達(dá)及調(diào)控模式提出了新的挑戰(zhàn)?，F(xiàn)有研究證實(shí)轉(zhuǎn)錄成LncRNA的ncRNA占76%[11-12］，且具備組織特異性，能在表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[13］。隨著臨床研究的進(jìn)一步深入，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)LncRNA異常表達(dá)于多種惡性腫瘤，可同時(shí)作為癌基因或抑癌基因，并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，被認(rèn)為是相關(guān)腫瘤潛在的診斷、預(yù)后判斷標(biāo)志物乃至治療靶點(diǎn)[14］。EC的發(fā)病機(jī)制目前仍未完全闡明，其發(fā)展過程同時(shí)也是一種復(fù)雜的生物學(xué)過程，遺傳及表觀遺傳學(xué)被認(rèn)為參與了該病的發(fā)生發(fā)展。現(xiàn)有研究證實(shí)LncRNA與EC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA被證實(shí)在絕大多數(shù)ESCC中呈異常表達(dá)，是癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力得以增強(qiáng)的重要驅(qū)動因素，同時(shí)也是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[15］。

CARLo-5是一種近年來研究較多的LncRNA，相繼被學(xué)者發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌、肝癌、肝內(nèi)膽管癌、肺癌等多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)。管群等[16］指出，CARLo-5在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)水平異常升高，與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后密切相關(guān)。Dou C等[17］經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，CARLo-5可作為肝癌治療的新靶點(diǎn)，該基因敲除能明顯抑制腫瘤生長。本研究采用Realtime-PCR檢測58例EC組織及癌旁組織CARLo-5情況，結(jié)果顯示EC組織中CARLo-5表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，提示EC組織中CARLo-5表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CARLo-5表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，其高表達(dá)多見于TNM分期Ⅲ、Ⅳ期患者和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中，推測其可能在該病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，隨著EC患者病情進(jìn)展CARLo-5表達(dá)量亦隨之升高，這與管群等[16］關(guān)于CARLo-5在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)情況的相關(guān)研究結(jié)論一致。但EC組織中CARLo-5表達(dá)上調(diào)的具體機(jī)制及生物學(xué)功能尚不明確，可能與CARLo-5能抑制細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)EC細(xì)胞增殖有關(guān)。研究認(rèn)為[18］，癌癥的易感性增加與CARLo-5的表達(dá)水平有關(guān)，推測其可能在腫瘤發(fā)生及進(jìn)展中起一定作用。此外，本研究經(jīng)隨訪發(fā)現(xiàn)CARLo-5高表達(dá)組患者的生存率及生存期均較低表達(dá)組差，提示CARLo-5高表達(dá)可能與EC患者預(yù)后相關(guān)，可能在預(yù)后評估中有重要價(jià)值。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)單因素及Cox多因素回歸分析結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CARLo-5表達(dá)水平是影響OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這進(jìn)一步揭示CARLo-5表達(dá)可能在EC患者預(yù)后評估中有一定價(jià)值。

綜上所述，CARLo-5在食管癌組織中較癌旁組織顯著上調(diào)，其表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征有關(guān)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CARLo-5表達(dá)水平是影響食管癌患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其中CARLo-5表達(dá)水平可能與食管癌發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系，并可能成為該病預(yù)后評估的重要生物標(biāo)志物。本研究主要存在以下不足：①僅納入58例EC患者，樣本量較少，后期需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)CARLo-5在EC患者中的臨床價(jià)值；②癌組織中CARLo-5表達(dá)上調(diào)的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。目前對于LncRNA的功能人們?nèi)运邢蓿蚪M研究發(fā)現(xiàn)LncRNA是一種具備復(fù)雜調(diào)控機(jī)制的分子，其可能延伸范圍目前尚不確定。盡管LncRNA無法編碼蛋白質(zhì)，但可向下游傳遞相關(guān)信息，并在調(diào)控基因表達(dá)方面發(fā)揮重要作用，因而作為一種信息傳導(dǎo)分子其在疾病診治方面可能較傳統(tǒng)意義上的蛋白質(zhì)更具特異性和敏感性。目前LncRNA及CARLo-5的研究尚處于初始階段，相信隨著相關(guān)研究的進(jìn)一步深入，人們會逐步揭示CARLo-5等LncRNA與食管癌以及其他惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，并逐漸加深理解和認(rèn)識，最終在食管癌等惡性腫瘤的診斷和治療中發(fā)揮其作用。