劉曉，王銀中，張鵬飛，焦同立，申萌萌

原發(fā)性肝癌的發(fā)病率位居我國惡性腫瘤的第4位，致死率位居第2位，其中肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占85%～90%[1]。侖伐替尼是一種多激酶抑制劑，是晚期HCC的一線治療藥物[2]。靶向治療藥物侖伐替尼能夠抑制腫瘤生長和血管生成，從而延緩HCC進(jìn)展，延長患者生存期[3-4]。然而，侖伐替尼的臨床應(yīng)用在很大程度上受到靶向耐藥性的限制[5]。因此，確定HCC對侖伐替尼耐藥的分子機(jī)制至關(guān)重要，有助于提高HCC患者的治療效果。6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶3(phosphofructokinase-2/fructose-2,6-bisphosphatase，PFKFB3)是糖酵解的有效刺激劑[6]。異常的腫瘤血管可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移并降低化療效果，阻斷PFKFB3的表達(dá)可使血管正?；瑴p少癌細(xì)胞侵襲和血管內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而增強(qiáng)化療效果[7]。研究顯示，阻斷PFKFB3的表達(dá)后可增強(qiáng)腫瘤對順鉑的敏感性[8]。然而，PFKFB3在HCC中對侖伐替尼耐藥是否發(fā)揮作用尚不清楚。因此，本研究擬探討HCC中PFKFB3的表達(dá)，觀察敲低其表達(dá)水平后，HCC對侖伐替尼的敏感性是否受影響，了解HCC對侖伐替尼的耐藥機(jī)制。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2020年8月—2021年6月行手術(shù)治療的HCC患者45例，男性27例，女性18例，年齡(45.6±8.3)歲(32～59歲)。保留患者的HCC組織和癌旁組織，-80 ℃保存。所有患者術(shù)前均未接受放化療。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號：202004125)，患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和材料 HCC細(xì)胞系Huh7、MHCC-97H、Hep3B和正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞(中國科學(xué)院典藏培養(yǎng)物保型委員會(huì)細(xì)胞庫)；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；si-NC及si-PFKFB3由廣州銳博生物技術(shù)有限公司完成；Trizol、Lipofectamine 2000(美國Invitrogen 公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×實(shí)時(shí)PCR預(yù)混液(北京天根生化科技有限公司)；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(江蘇碧云天技術(shù)有限公司)；MTT粉末(北京索萊寶公司)；PFKFB3 (D7H4Q) 兔單克隆抗體(貨號：13123)、β-actin (8H10D10)鼠單克隆抗體(貨號：3700)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗-鼠IgG抗體(貨號：7076)和辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗-兔IgG抗體(貨號：7074)(美國Cell Signaling Technology公司)。

si-NC：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’

si-PFKFB3：5’-AGCUGCCUGGACAAAACAUG-3’

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemical staining，IHC)實(shí)驗(yàn) 采用IHC檢測HCC組織和癌旁組織中PFKFB3的表達(dá)，將組織置于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)石蠟包埋后制備成厚度約4 μm的切片，經(jīng)脫蠟、水化、滲透和封閉后，滴加PFKFB3 (D7H4Q) Rabbit mAb (1∶200)，置于4 ℃冰箱孵育過夜。PBS沖洗，滴加Anti-rabbit IgG,HRP-linked 抗體(1∶400)，室溫下孵育60 min，PBS沖洗3遍。滴加顯色液，置于顯微鏡下觀察。

1.2.3 Western-blot實(shí)驗(yàn) 采用Western-blot檢測HCC組織中PFKFB3的表達(dá)，提取細(xì)胞中的總蛋白，BCA蛋白定量取30 μg蛋白，行SDS-PAGE電泳，將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用1% BSA室溫封閉2 h、之后經(jīng)anti-PFKFB3抗體孵育(1∶1 000 稀釋，4 ℃孵育過夜)、TBST洗滌3次、二抗孵育(1∶4 000 稀釋，室溫孵育1 h)、TBST洗滌3次后，在膜上滴加適量化學(xué)發(fā)光顯色液并置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 配置含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，取對數(shù)生長期Hep3B細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)的密度接種于6孔細(xì)胞板，分為si-NC組(轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒)、si-PFKFB3組(轉(zhuǎn)染PFKFB3敲低質(zhì)粒)，每組設(shè)置3個(gè)平行孔。按照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000的說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染6 h 后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，此時(shí)si-NC組細(xì)胞稱為si-NC細(xì)胞、si-PFKFB3組細(xì)胞稱為si-PFKFB3 細(xì)胞。收集si-NC細(xì)胞和si-PFKFB3細(xì)胞，采用Western-blot檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.2.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) si-NC組和si-PFKFB3組的細(xì)胞以每孔2×103個(gè)的密度接種于96孔板中，接種后分別于0、24、48、72 h進(jìn)行檢測。至檢測時(shí)間點(diǎn)在檢測孔中滴加20 μL MTT溶液，孵育4 h。去除上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)溶液，震蕩5 min使細(xì)胞充分裂解，用酶標(biāo)儀檢測570 nm 處細(xì)胞的光密度(optical density,OD)值。取對數(shù)生長期Hep3B細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)的密度接種于96孔板中，置于恒溫箱中孵育24 h，滴加侖伐 替尼，使其終濃度分別為0、5、10、15、20、25 μmol/L。同時(shí)設(shè)置陰性對照組(DMSO對照)和空白對照組(僅加培養(yǎng)基)。繼續(xù)孵育48 h，按照以上步驟檢測細(xì)胞的OD值并計(jì)算存活率。si-PFKFB3 細(xì)胞和Hep3B細(xì)胞接種于96孔板中，將其分為si-PFKFB3組、NC+侖伐替尼組、si-PFKFB3+侖伐替尼組、NC組和陰性對照組，si-PFKFB3 組為接種的si-PFKFB3 細(xì)胞、NC+侖伐替尼組為接種的Hep3B細(xì)胞并用10 μmol/L侖伐替尼處理、si-PFKFB3+侖伐替尼組為接種的si-PFKFB3 細(xì)胞并用10 μmol/L侖伐替尼處理、NC組為接種的Hep3B細(xì)胞、陰性對照組為接種Hep3B細(xì)胞并用DMSO處理。孵育48 h后，檢測每組細(xì)胞的OD值并計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率=1-[(不同濃度處理組-空白對照組)/(陰性對照組-空白對照組)]×100%

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測 采用Annexin V-FITC和PI雙染法檢測細(xì)胞的凋亡情況。si-PFKFB3和Hep3B細(xì)胞以4×105個(gè)的密度接種于6孔板中，孵育24 h后，si-PFKFB3組接種的si-PFKFB3細(xì)胞不做任何處理、侖伐替尼組為接種的Hep3B細(xì)胞并用10 μmol/L侖伐替尼處理、si-PFKFB3+侖伐替尼組為接種的si-PFKFB3細(xì)胞并用10 μmol/L侖伐替尼處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，分別加入390 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，輕輕混勻，室溫避光，在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 HCC組織和癌旁組織中PFKFB3的表達(dá) IHC結(jié)果顯示，HCC組織中PFKFB3陽性表達(dá)率為79.7%(51/64)，高于癌旁組織的18.8%(12/64)，組間比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=47.543，P<0.001，圖1)。

HCC：肝細(xì)胞癌；PFKFB3：6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶3。A：肝癌旁組織；B：肝癌組織。圖1 HCC組織和癌旁組織中PFKFB3的表達(dá)(SP染色 ×400)Fig.1 Expression of PFKFB3 in HCC tissue and para-HCC tissue (SP staining ×400)

2.2 HCC細(xì)胞系中PFKFB3的表達(dá) HCC細(xì)胞系Huh7、MHCC-97H、Hep3B和正常肝細(xì)胞L02中PFKFB3蛋白表達(dá)相對灰度值分別為(0.42±0.05)、(0.67±0.11)、(0.95±0.10)和(0.11±0.02)，4組間比較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.625，P=0.004)，且Hep3B細(xì)胞中PFKFB3蛋白相對灰度值的表達(dá)水平最高，因此選擇Hep3B細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖2)。

PFKFB3：6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶3;HCC：肝細(xì)胞癌。圖2 HCC細(xì)胞系中PFKFB3的表達(dá)Fig.2 Expression of PFKFB3 in HCC cell lines

2.3 敲低Hep3B細(xì)胞中PFKFB3的表達(dá)對細(xì)胞增殖和凋亡的影響 si-PFKFB3組細(xì)胞中PFKFB3 mRNA相對表達(dá)水平和蛋白相對灰度值分別為(0.24±0.06)和(0.31±0.02)，均顯著低于si-NC組[(0.86±0.14)和(0.97±0.16)，t=9.772、9.125，均為P<0.001]。si-PFKFB3組48、72 h的OD值分別為(0.35±0.09)和(0.42±0.10)，均低于si-NC組[(0.68±0.11)和(1.01±0.15)，t=4.415、6.351，P<0.001]。si-PFKFB3組細(xì)胞凋亡率為(39.12±5.43)%，高于si-NC組的(8.80±0.11)%(t=12.521，P<0.001，圖3)。

PFKFB3：6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶3。A：si-NC組和si-PFKFB3組PFKFB3蛋白表達(dá)；B：si-NC組和si-PFKFB3組細(xì)胞OD值；C、D：分別為si-NC組和si-PFKFB3組細(xì)胞凋亡率。組間比較，☆:P<0.001。圖3 敲低Hep3B細(xì)胞中PFKFB3的表達(dá)對細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.3 Effects of knockdown of PFKFB3 expression in Hep3B cells on cell proliferation and apoptosis

2.4 敲低Hep3B細(xì)胞中PFKFB3后對侖伐替尼抗腫瘤活性的影響 侖伐替尼10 μmol/L時(shí)，Hep3B細(xì)胞的存活率為(63.34±5.32)%，接近50%，選擇此濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。72 h時(shí)si-PFKFB3 組、侖伐替尼組和si-PFKFB3+侖伐替尼組細(xì)胞存活率分別為(65.2±5.3)%、(48.3±4.7)%和(6.2±1.4)%，si-PFKFB3+侖伐替尼組細(xì)胞存活率低于si-PFKFB3組和侖伐替尼組(t=23.625、16.854，均P<0.001)。si-PFKFB3組、侖伐替尼組和si-PFKFB3+侖伐替尼組細(xì)胞凋亡率分別為(34.2±4.9)%、(45.6±5.0)%和(81.9±6.8)%，si-PFKFB3+侖伐替尼組細(xì)胞凋亡率高于si-PFKFB3組、侖伐替尼組(t=28.514、21.325，P<0.001，圖4)。

PFKFB3：6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶3。A：侖伐替尼對Hep3B細(xì)胞的增殖抑制作用；B：si-PFKFB3組、侖伐替尼組和si-PFKFB3+侖伐替尼組細(xì)胞增殖情況；C：si-PFKFB3組、侖伐替尼組和si-PFKFB3+侖伐替尼組細(xì)胞凋亡情況。圖4 敲低Hep3B細(xì)胞中PFKFB3的表達(dá)后增強(qiáng)侖伐替尼抗腫瘤活性Fig.4 Knockdown of PFKFB3 in Hep3B cells enhances lenvatinib antitumor activity

3 討 論

HCC是癌癥相關(guān)死亡的常見原因，即使進(jìn)行肝切除和肝移植，其5 a復(fù)發(fā)率也高達(dá)70%[9]。由于缺乏有效的治療，晚期HCC患者的預(yù)后較差，中位總生存期不到1 a。索拉非尼是第一個(gè)在晚期HCC中顯示出總體生存獲益的全身治療藥物，并被批準(zhǔn)為晚期HCC患者的一線治療藥物[10]。索拉非尼的臨床應(yīng)用成功，增加了人們對HCC新藥開發(fā)的興趣。然而在隨機(jī)對照Ⅲ期試驗(yàn)中，許多一線藥物(如利尼伐尼[11]、舒尼替尼[12]、厄洛替尼[13]、布立尼布[14])和二線藥物(如依維莫司[15])在HCC治療中失敗。侖伐替尼是一種酪氨酸激酶抑制劑，在Ⅲ期REFLECT 臨床試驗(yàn)中，對未經(jīng)治療的晚期HCC患者的總生存期的改善不遜于索拉非尼，并被推薦為治療晚期HCC的另一種一線藥物[16]。盡管侖伐替尼對晚期HCC的客觀緩解率有顯著益處，但這種益處并不能持續(xù)，部分接受侖伐替尼治療的晚期HCC患者出現(xiàn)耐藥性，這一現(xiàn)象促使臨床醫(yī)生探索侖伐替尼耐藥的潛在機(jī)制。因此，探討增強(qiáng)HCC對侖伐替尼的敏感性、降低耐藥發(fā)生的可能機(jī)制，具有重要的臨床價(jià)值。

本研究首先檢測到HCC組織中PFKFB3的表達(dá)水平增加，在HCC細(xì)胞中依然檢測到PFKFB3呈高表達(dá)的狀態(tài)。為探索PFKFB3在HCC細(xì)胞中可能的作用，筆者利用轉(zhuǎn)染技術(shù)將Hep3B細(xì)胞中PFKFB3水平敲低，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖能力減弱，凋亡的細(xì)胞增加，推測PFKFB3在HCC中可能具有促瘤作用。有氧糖酵解可消耗葡萄糖并引起乳酸堆積，腫瘤中的乳酸堆積可致糖酵解限速酶磷酸果糖激酶-1的表達(dá)增加，促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，另外糖酵解的其他產(chǎn)物亦可驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞的生長[17]。PFKFB3是糖酵解過程中的關(guān)鍵限速酶，在多種癌癥中高表達(dá)[18-20]。研究顯示，阻斷PFKFB3后可減少病理性血管生成，促進(jìn)正常血管的形成和降低糖酵解，從而改善化療藥的遞送和療效[21-22]。CANTELMO 等[23]研究顯示，在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞中表現(xiàn)出高糖酵解代謝，阻斷PFKFB3后可減弱腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲，并提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。而減弱HCC細(xì)胞中PFKFB3的表達(dá)是否可增強(qiáng)細(xì)胞對侖伐替尼的敏感性，繼而進(jìn)行了以下研究。

首先確定侖伐替尼作用于Hep3B細(xì)胞的IC50接近于10 μmol/L，選擇這個(gè)濃度對Hep3B細(xì)胞進(jìn)行處理。si-PFKFB3+侖伐替尼組細(xì)胞存活率為(6.2±1.4)%，顯著低于si-PFKFB3組和侖伐替尼組。另外，凋亡實(shí)驗(yàn)顯示，si-PFKFB3+侖伐替尼組凋亡率顯著高于si-PFKFB3組和侖伐替尼組，提示降低Hep3B細(xì)胞中PFKFB3的表達(dá)，可增強(qiáng)Hep3B細(xì)胞對侖伐替尼的敏感性。HCC中的缺氧通過產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的過程和激活缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)來驅(qū)動(dòng)血管生成。因此，侖伐替尼因通過阻斷HIF-1α/VEGF通路發(fā)揮抗血管生成作用。持續(xù)侖伐替尼治療會(huì)抑制腫瘤的抗血管生成活性和隨后的腫瘤內(nèi)缺氧，有利于選擇耐藥細(xì)胞克隆以適應(yīng)氧氣和營養(yǎng)不足，從而限制了侖伐替尼的療效[5]。MATSUKI等[24]研究報(bào)道，靶向腫瘤成纖維生長因子和抗血管生成活性是侖伐替尼抗HCC腫瘤活性的基礎(chǔ)。因此，降低Hep3B細(xì)胞中PFKFB3的表達(dá)，增強(qiáng)對侖伐替尼的敏感性，是否跟成纖維生長因子或血管生成有關(guān)，可作為后續(xù)研究的方向。

綜上所述，HCC組織和細(xì)胞中PFKFB3的表達(dá)水平增加，降低PFKFB3的表達(dá)可增強(qiáng)Hep3B細(xì)胞對侖伐替尼的敏感性。