張偉杰，詹家奇，朱炳旺，張偉生，涂文劭，鄭曉春

隨著人口老齡化趨勢的發(fā)展，其相關內(nèi)分泌疾病——老年糖尿病(diabetes mellitus,DM)的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，成為嚴重影響患者生活質(zhì)量、增加家庭和社會負擔的重要代謝紊亂性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，DM代謝異?？梢l(fā)全身各系統(tǒng)嚴重的并發(fā)癥，除了直接損傷周圍神經(jīng)外，血糖波動異?？赡茉黾覦M患者罹患認知功能障礙的風險[1-2]，該類患者臨床早期多表現(xiàn)為記憶和學習能力下降[3]，尤其在老年患者中已成為一個不容忽視的醫(yī)學和社會問題。但其發(fā)病機制至今尚未完全明確，也缺乏有效的預防和治療方法。

近年，研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-451抑制劑可通過增強腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)的活性，從而抑制糖氧剝奪所誘導的內(nèi)皮細胞程序性壞死[4]，通過靶向上調(diào)miRNA-451的表達可加重帕金森病(Parkinson’s disease，PD)小鼠認知功能障礙的發(fā)生和發(fā)展[5]。而老年DM患者學習記憶功能障礙發(fā)展至晚期更易發(fā)生阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)或PD。據(jù)此，筆者推斷miRNA-451的表達水平與老年DM相關學習記憶功能障礙的嚴重程度密切相關。

本研究擬通過建立老年DM大鼠模型，探討miRNA-451的表達水平與老年DM相關學習記憶功能障礙嚴重程度之間的關系，以期為進一步揭示老年DM相關學習記憶功能障礙發(fā)生和發(fā)展的機制提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選擇18～20月齡的雄性SD清潔級大鼠40只，體質(zhì)量(375±75)g，由福建醫(yī)科大學動物實驗中心提供[動物許可證號：SYXK(閩)2016-0010]。大鼠12 h/12 h晝夜適應性喂養(yǎng)1周，采用電刺激方法，篩選出反應靈敏的大鼠，測定空腹血糖，以空腹血糖為4～6 mmol/L作為入選標準。

1.1.2 主要試劑 鏈脲菌素(streptozotocin，STZ)、檸檬酸和檸檬酸鈉(廈門泰京生物技術有限公司)；生物化學制品磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(廈門鷺隆生物科技發(fā)展有限公司)；miRNA Purification Kit試劑盒(中國康為世紀公司)。

1.1.3 儀器和設備 Morris水迷宮(KW-MWM，南京卡爾文生物科技有限公司)；動物行為視頻跟蹤分析系統(tǒng)(上海吉量軟件科技有限公司)；Biosystems 7500實時聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)系統(tǒng)及SDS軟件2.1版(Applied Biosystem，美國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建老年DM大鼠模型 采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)(含10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、1%膽酸鹽)1個月誘導胰島素抵抗，期間自由飲水，1個月后禁食禁飲24 h，向腹腔內(nèi)注射用檸檬酸-檸檬酸鈉溶液溶解稀釋的STZ 35 mg/kg，注射后12 h恢復原飲食方案，3 d后測定空腹尾靜脈血糖濃度，超過≥16.7 mmol/L 即為建模成功。

1.2.2 分組 符合入選標準的老年大鼠連續(xù)進行Morris水迷宮訓練3 d，每日4次。Morris水迷宮訓練結(jié)束后，將老年大鼠隨機分為兩組：(1)對照組(C組)10只，采用普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，喂養(yǎng)1周稱取體質(zhì)量并記錄，而后禁食禁飲24 h，根據(jù)體質(zhì)量向腹腔內(nèi)注射與實驗組相同濃度的等容量檸檬酸-檸檬酸鈉溶液，注射完畢后繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)3 d。(2)實驗組(T組)30只，均為建模成功的老年DM大鼠，根據(jù)成模后高血糖持續(xù)時間進一步隨機分為3個亞組，即T1(1周)、T2(3周)和T3(6周)亞組，每個亞組10只，分別繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)1、3和6周。

1.3 測定指標

1.3.1 Morris水迷宮測試評估學習記憶能力 Morris水迷宮直徑150 cm，高度60 cm，水深40 cm。水中加入適量牛奶，使水池呈現(xiàn)不透明的乳白色。將直徑12 cm的圓柱形實驗平臺置于任一象限的中間水面下1 cm，水溫保持在23～25 ℃。將大鼠面朝池壁分別從4個入水點放入水池，記錄大鼠從入水到找到并站上水下隱蔽平臺所需的時間，作為潛伏期。大鼠找到平臺后，讓其在平臺上站立10 s。若大鼠入水后120 s仍未找到平臺，則由實驗員將其輕輕從水中引導上平臺，并停留10 s，然后進行下一次訓練。每只大鼠從4個入水點分別放入水池為一次訓練，2次訓練間隔30 s。連續(xù)訓練3 d，每日4次。大鼠Morris水迷宮測試采用動物行為視頻跟蹤分析系統(tǒng)記錄和分析：(1)定位航行實驗，將各組大鼠從同一入水點放入水池，觀察和記錄大鼠尋找到平臺的路線圖和所需時間，即為潛伏期時間。(2)空間探索實驗，定位航行實驗結(jié)束后，撤去平臺，將各組大鼠從同一入水點放入水池中，觀察和記錄120 s內(nèi)的運動軌跡和穿越原平臺位置的次數(shù)。

1.3.2 miRNA提取 每組大鼠完成Morris水迷宮測試后處死取腦脊液(cerebrospinal fluid,CSF)0.1 mL凍存。選用miRNA Purification Kit試劑盒提取miRNA。室溫下解凍CSF樣品，取200 μL CSF樣品，加入5倍體積TRIzon Reagent反復吹打，使蛋白核酸復合物完全分離，離心5 min，取上層無水相于離心管中，加入1/3無水乙醇，過柱，洗柱2次。向吸附柱RS中加入700 μL Buffer RWT，離心后棄廢液，重新向吸附柱RS中加入500 μL Buffer RWT，離心后棄廢液，重復2次，向得到的吸附柱中間部位加入30～50 μL RNase-Free Water，離心后收集miRNA液，-80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 熒光實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測 根據(jù)miRNA cDNA Sythesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行RT-PCR檢測。采用RT-PCR儀擴增目的基因片段，反應條件：95 ℃預變性10 min→95 ℃變性10 s→56 ℃復性1 min，共40個循環(huán)。設計miRNA-451的反轉(zhuǎn)錄引物和RT-PCR擴增序列(5’-3’)(PCR檢測時上下游引物成對)引物如下，miRNA-451相對表達量用2-△△Ct表示。每個樣本獨立實驗3次。

內(nèi)參U6：

反轉(zhuǎn)錄引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’

RT-PCR引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’

miRNA-451：

反轉(zhuǎn)錄引物：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTCAC-3’

RT-PCR引物：5’-AACATTCAACCTGTCGGTGAGT-3’

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮測試前大鼠血糖水平比較 與C組比較，T組各亞組的血糖均升高，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；T組各亞組組內(nèi)比較，差別均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。表明老年DM大鼠建模成功且血糖濃度穩(wěn)定，具有可比性。

2.2 大鼠Morris水迷宮測試結(jié)果、運動軌跡及CSF中miRNA-451相對表達量比較 與C組比較，T組各亞組逃避潛伏期時間顯著延長、穿越原平臺次數(shù)顯著減少、miRNA-451相對表達量顯著增加，組間比較差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；T組各亞組組內(nèi)比較，隨著DM持續(xù)時間的延長，各亞組逃避潛伏期時間顯著延長、穿越原平臺次數(shù)顯著減少、miRNA-451相對表達量顯著增加，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。具體見表1及圖1。各組大鼠Morris水迷宮運動軌跡見圖2。

表1 各組大鼠空腹血糖、Morris水迷宮測試結(jié)果及CSF中miRNA-451相對表達量比較Tab.1 Comparisons of fasting blood glucose,Morris water maze test results and relative expression of miRNA-451 in CSF in each group

A：逃避潛伏期時間；B：穿越原平臺次數(shù)。與C組比較，☆：P<0.05；與T1組比較，▲：P<0.05；與T2組比較，#：P<0.05。圖1 Morris水迷宮測試結(jié)果Fig.1 Test results of Morris water maze

圖2 各組大鼠Morris水迷宮運動軌跡Fig.2 Morris water maze motion trajectory of rats in each group

2.3 Pearson相關性分析結(jié)果 CSF中miRNA-451表達水平與Morris水迷宮測試成績中的逃避潛伏期的相關系數(shù)r值為0.997(>0.8)，兩者顯著正相關(P=0.003)；與穿越原平臺次數(shù)相關系數(shù)r值為-0.975(<-0.8)，兩者顯著負相關(P=0.025)。

3 討 論

研究表明，與DM患者認知功能障礙密切相關的年齡為60～80歲[6]。此年齡段患者常伴有其他基礎疾病，導致臨床癥狀隱匿，診斷較為困難。因此，通過尋找靈敏度和特異度較高的指標來診斷該類患者的早期認知功能障礙及嚴重程度，是目前國內(nèi)外研究的熱點。

miRNA是由21～23個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，存在于機體各種體液中，包括CSF、唾液和血液等，可與mRNA結(jié)合沉默基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮生物學效應。既往研究證明，血清miRNA可作為疾病相關的診斷和預后標記物，如AD診斷標準和血管損傷生物標志物相組合可增加AD的敏感性和特異性[7]。miRNA-451是一種多功能的miRNA，目前證實其在很多方面均具有重要作用，例如血液系統(tǒng)疾病、神經(jīng)發(fā)育、心血管疾病等方面[5]。大量研究數(shù)據(jù)顯示，巨噬細胞移動抑制因子(macrophagemigration inhibitor factor，MIF)可能是miRNA-451一個重要的靶標基因[8]。miRNA-451通過靶向負性調(diào)控MIF基因的表達，抑制腦微血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移能力以及血管形成能力，從而造成血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)的損傷，導致BBB滲透性增加。臨床影像學研究表明，PD患者基底節(jié)區(qū)BBB滲透性增加[9]。

本研究結(jié)果顯示，隨著老年DM大鼠高血糖持續(xù)時間的延長，其水迷宮潛伏期時間逐漸延長，目標象限穿越次數(shù)逐漸減少，表明維持長期高血糖狀態(tài)下，老年DM大鼠的學習記憶力開始下降并逐漸加重。既往研究發(fā)現(xiàn)，DM前期的人群，大約42%在4 a 內(nèi)發(fā)生認知功能下降，大約54%在8 a內(nèi)發(fā)生血管性癡呆[10]，表明隨著DM病程的進展，其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)認知功能的損害程度逐漸加重，本研究結(jié)果與之一致。為進一步探索其發(fā)病機制，本研究通過收集和分析DM持續(xù)過程的不同時間點CSF中miRNA-451 表達水平發(fā)現(xiàn)，其增加的程度與老年DM大鼠學習記憶功能損害的嚴重程度變化趨勢相關，進一步采用Pearson相關性分析發(fā)現(xiàn)，兩者之間成顯著正相關關系，表明長期高血糖狀態(tài)可誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)miRNA-451表達水平增加，進而導致認知功能下降。推測與長期高血糖誘發(fā)miRNA-451表達升高，并通過抑制MIF的表達抑制細胞增殖、遷移和血管生成，從而導致老年DM大鼠BBB損傷有關，這可能是引起老年DM相關血管性認知功能損害的重要機制。

MIF是集細胞因子、生長因子、激素和酶特性于一身的多效能蛋白分子，能夠阻止巨噬細胞從毛細血管中促炎遷移，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)行使重要的作用。陳嘉寧等[11]研究顯示，通過下調(diào)miRNA-451表達，增加MIF的表達對PD模型小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元和海馬區(qū)細胞具有明顯的保護作用，這種保護作用可有效改善PD小鼠認知功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著DM病程的進展，C、T1、T2和T3 4組大鼠CSF中miRNA-451的表達水平逐漸上升，大鼠的認知功能障礙程度逐漸加重，表明隨著DM持續(xù)時間的增加，miRNA水平的上升在一定程度上抑制MIF的表達，造成DM大鼠神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元和海馬區(qū)細胞的損傷。進一步研究發(fā)現(xiàn)，當MIF被活化后可通過激活下游IL-8、VCAM-1和ICAM-1等細胞因子的表達升高調(diào)節(jié)血管新生[12]。在促進新生微血管生成方面，MIF呈劑量依賴性上調(diào)21個內(nèi)皮細胞血管生成基因，特別是VEGF165和Smadl基因的表達，這是MIF參與大血管病變、DM相關的微血管病變、血管新生等過程的重要機制[13]，這些調(diào)節(jié)機制與老年DM相關認知障礙中關于腦微血管損傷導致的學習記憶功能障礙的理論依據(jù)一致。因此，可推測，在miRNA-451參與DM患者早期認知功能障礙損傷的機制中，miRNA-451表達的動態(tài)變化在預測老年DM相關學習記憶功能障礙的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的臨床意義。但本實驗未進一步探討miRNA-451下游分子的變化情況，將在今后進一步研究。另外，該結(jié)論是否也適用于老年DM患者，需在今后臨床工作中進一步驗證。

綜上所述，隨DM持續(xù)時間的延長，老年DM大鼠的學習記憶功能障礙逐漸加重，其嚴重程度與CSF中miRNA-451表達水平的升高程度成正相關。miRNA-451可能通過抑制MIF的表達，抑制細胞增殖、遷移和血管生成等機制導致老年DM大鼠BBB損傷，從而引起老年DM相關血管性認知功能損害。