施若云，王珺嵐，張真真

胃癌是全球最常見的5種癌癥之一，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，內(nèi)鏡診治早期篩查可提高胃癌的治愈率，晚期胃癌患者易在根治性切除術(shù)后出現(xiàn)腹膜播散轉(zhuǎn)移，提示預(yù)后不良[1]。腹膜播散轉(zhuǎn)移是胃癌相關(guān)的死亡原因，且化療、腹腔內(nèi)灌注或姑息手術(shù)的療效均有限[2]。此外，當(dāng)腹水量少或轉(zhuǎn)移灶隱匿時，影像學(xué)檢查或活檢并不能提高腹膜轉(zhuǎn)移的早期檢出率。因此，需要新的預(yù)測標(biāo)志物來發(fā)現(xiàn)早期腹膜轉(zhuǎn)移，以改善晚期胃癌的預(yù)后。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighed gene co-expression network analysis,WGCNA)是鑒定疾病涉及的共表達(dá)模塊和關(guān)鍵基因的有效方法[3]。本研究基于公共微陣列數(shù)據(jù)集(GSE62254)通過WGCNA鑒定與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)的樞紐模塊，基于胃癌TCGA和GEO數(shù)據(jù)集(GSE62254和GSE84437)篩選胃癌預(yù)后相關(guān)基因，取樞紐模塊的基因和單因素COX回歸分析有統(tǒng)計學(xué)意義的交集基因之一，即含亮氨酸拉鏈和EF手跨膜蛋白2(leucine zipper and EF-hand containing transmembrane protein 2，LETM2),作為胃癌腹膜轉(zhuǎn)移和預(yù)后的候選標(biāo)志物，通過對胃癌相關(guān)組織及腹水或腹腔灌洗液沉渣蠟塊進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemical staining,IHC)表達(dá)分析，探討其與胃癌臨床病理特征和對腹膜轉(zhuǎn)移的預(yù)測意義。

1 材料與方法

1.1 材料 GSE62254和GSE84437芯片數(shù)據(jù)集從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫GEO(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載，分別基于GPL450和GPL6947平臺和文獻(xiàn)獲得300份和454份胃癌樣本基因表達(dá)和臨床數(shù)據(jù)[4-5]。胃癌癌癥基因組圖譜分析(TCGA-STAD)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)從http://cancergenome.nih.gov/使用Perl軟件(https://www.perl.org/；5.32.1版本)下載。通過R軟件Limma包和Sva包對數(shù)據(jù)進(jìn)行了批量歸一化處理。

1.2 方法

1.2.1 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 使用R軟件中的WGCNA包和Limma包對處理后的數(shù)據(jù)集進(jìn)行WGCNA分析。首先，通過定義軟閾值(β值)的功效建立標(biāo)準(zhǔn)的無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)，分析網(wǎng)絡(luò)模塊的平均連通性和尺度獨立性。使用網(wǎng)絡(luò)中每對節(jié)點基因與其Pearson 相關(guān)系數(shù)絕對值構(gòu)造鄰接矩陣，基于TOM(dissTOM)的分層聚類構(gòu)建分層聚類樹狀圖，合并相關(guān)系數(shù)>0.75的模塊。最后，選擇與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)分析中相關(guān)系數(shù)最大、P值絕對值最小的模塊作為樞紐模塊[3]。

1.2.2 基于胃癌數(shù)據(jù)集分析篩選胃癌預(yù)后相關(guān)基因 基于不同數(shù)據(jù)集(GSE62254、GSE84437和TCGA-STAD)的總生存期(overall survival，OS)，以不同基因mRNA表達(dá)的最佳截斷值為臨界值，將樣品分成高表達(dá)組和低表達(dá)組，使用R/Bioconductor軟件中的Survival包對基因表達(dá)進(jìn)行單變量COX生存分析，選擇P<0.05的基因作為預(yù)后相關(guān)基因。利用VennDiagramR程序包獲取深綠色模塊與3個數(shù)據(jù)集預(yù)后相關(guān)基因的交集基因，并繪制韋恩圖，得到與腹膜轉(zhuǎn)移預(yù)后相關(guān)的基因LETM2和SERPINE2。因目前LETM2在胃癌的研究文獻(xiàn)報道有限，本研究選擇LETM2作為關(guān)鍵基因進(jìn)行臨床樣本的IHC分析。

1.2.3 IHC分析LETM2在胃癌不同部位的表達(dá)及臨床意義 收集2006年8月—2021年12月胃癌手術(shù)患者的福爾馬林固定石蠟包埋庫存蠟塊215例，包括腫瘤原發(fā)灶(n=215)、腫瘤周圍正常組織(n=215)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶(n=141)、肝轉(zhuǎn)移灶(n=6)、腹膜轉(zhuǎn)移灶(n=20)。納入標(biāo)準(zhǔn)：明確的病理診斷，臨床和隨訪數(shù)據(jù)完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：胃腺癌伴異質(zhì)性成分；失訪者；死于其他疾病而非胃癌者。

采用兔抗人LETM2多克隆抗體(貨號：17180-1-AP，1∶100稀釋，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)以及Envision試劑盒(K4010，丹麥DAKO生物技術(shù)有限公司),按照抗體說明書對胃癌LETM2進(jìn)行兩步法IHC檢測。PBS作為陰性對照，胎盤組織作為陽性對照。免疫反應(yīng)評分(IRS)根據(jù)染色強(qiáng)度(SI)和陽性細(xì)胞(PP)的百分比的乘積計算，即IRS=SI×PP。染色強(qiáng)度分級如下：0，無染色；1，淡黃色；2，棕黃色；3，棕褐色。陽性細(xì)胞百分比：0為≤5%，1為6%～25%，2為26%～50%，3為51%～75%，4為>75%。采用X-tile軟件(V3.6.1)，根據(jù)生存數(shù)據(jù)確定IRS最佳截斷值為7，將LETM2表達(dá)分為低表達(dá)組和高表達(dá)組。

1.2.4 腹水細(xì)胞沉渣石蠟包埋IHC分析 收集2015年1月—2021年12月就診的胃癌腹膜轉(zhuǎn)移患者腹水(n=20)和胃癌患者非腫瘤腹水或腹腔灌洗液細(xì)胞蠟塊(n=60)，分別行LETM2 IHC分析。具體操作如下：取200～300 mL 腹水樣本，2 500 r/min 離心10 min，棄上清液；血性腹水加入適量的紅細(xì)胞裂解液繼續(xù)離心10 min，小鋼匙刮取細(xì)胞沉渣置于包埋盒中的擦鏡紙上，包裹后合蓋，置于95%乙醇中固定；經(jīng)常規(guī)脫水處理，石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅(H-E)染色和LETM2 IHC分析，每張切片選取10個高倍視野(×200)，對照H-E染色細(xì)胞形態(tài)，LETM2著色陽性腫瘤細(xì)胞>5為陽性，以臨床和病理診斷最終結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，評價LETM2在胃癌腹水細(xì)胞沉渣蠟塊切片IHC分析對胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值[4]。

2 結(jié) 果

2.1 基于WGCNA和數(shù)據(jù)集預(yù)后分析篩選胃癌腹膜轉(zhuǎn)移預(yù)后相關(guān)候選基因 利用WGCNA篩選出與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)系數(shù)最大、P值最小的深綠色模塊(r=0.32，P=1.1×10-8，圖1)作為關(guān)鍵模塊，共包含6 936個基因。根據(jù)基因mRNA表達(dá)的最佳截斷值，GSE62254、GSE84437和TCGA單變量COX回歸分析分別得到1 664、1 031和363個預(yù)后相關(guān)基因(P<0.05)，韋恩圖確定了深綠色模塊基因與3個數(shù)據(jù)集預(yù)后相關(guān)基因的交集基因LETM2和SERPINE2，LETM2在不同數(shù)據(jù)集的K-M生存曲線和Log-rank檢驗提示，LETM2高表達(dá)胃癌患者預(yù)后差(圖2)。

A：WGCNA分析共獲得與胃癌臨床病理性狀相關(guān)的15個關(guān)鍵的共表達(dá)模塊；B：深綠模塊基因與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)性分析結(jié)果(r=0.76，P<0.001)；C：模塊-特征關(guān)系圖顯示，深綠色模塊與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)系數(shù)最大，P值最小，從左到右分別為Lauren分型腸型、彌漫型和混合型；T指AJCC的T分期；N指AJCC的N分期；M指AJCC的M分期；pStage指胃癌病理分期；PM指胃癌腹膜轉(zhuǎn)移，包括癌性腹水或腹膜轉(zhuǎn)移癌結(jié)節(jié)；Mol為文獻(xiàn)提供的ARGC分子分型。圖1 基于胃癌數(shù)據(jù)集WGCNA分析發(fā)現(xiàn)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵模塊Fig.1 Identification of key modules related to peritoneal metastasis based on WGCNA analysis and gastric cancer datasets

A：韋恩圖顯示，深綠色模塊與3個數(shù)據(jù)集預(yù)后相關(guān)基因的數(shù)目及交集基因個數(shù)；B～D：Kaplan-Merier生存分析曲線顯示，LETM2高低表達(dá)組胃癌總生存率的差異具有顯著性;B:TCGA-STAD；C:GSE62254;D:GSE84437。圖2 Kaplan-Merier生存曲線分析LETM2高低表達(dá)胃癌患者的總生存時間差異Fig.2 Significant difference between high and low expression of LETM2 in gastric cancer was demonstrated by Kaplan-Merier survival analysis

2.2 LETM2蛋白在不同胃癌組織中的表達(dá)分析 LEMT2在癌旁胃黏膜、胃癌原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶和肝轉(zhuǎn)移灶中呈異質(zhì)性表達(dá)(圖3)。原發(fā)灶LETM2的表達(dá)高于鄰近的正常胃黏膜上皮(6.88±0.24vs2.95±0.13，P<0.000 1)；彌漫型胃腺癌中的表達(dá)高于腸型(9.29±0.17vs2.84±0.25，P<0.000 1)。此外，LETM2在腹膜轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)高于原發(fā)灶(9.85±0.47vs6.88±0.24，P<0.05)，而原發(fā)性灶和肝轉(zhuǎn)移灶表達(dá)比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(6.88±0.24vs5.13±0.72，P>0.05)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)水平低于腫瘤原發(fā)灶(3.99±0.21vs6.88±0.24，P<0.05)。

A：癌旁胃黏膜；B：高分化胃腺癌；C：差分化胃腺癌；D：胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶；E：胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶；F：胃癌肝轉(zhuǎn)移灶。圖3 LETM2在胃癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)分析(IHC ×200)Fig.3 Immunohistochemical analysis of LETM2 in primary and metastatic loci of gastric cancer (IHC ×200)

2.3 LETM2在胃癌原發(fā)灶中表達(dá)的臨床意義 LETM2高表達(dá)與Lauren組織學(xué)分型(P<0.001)、pStage(P=0.003)和腹膜轉(zhuǎn)移(P=0.002)呈正相關(guān)，與患者年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無相關(guān)性(表1)。LETM2高表達(dá)的胃癌患者中位生存時間更短[(85.00±4.23)月vs(93.00±6.78)月,P=0.02]，ROC曲線分析顯示，胃癌原發(fā)灶LETM2 IHC評分對胃癌腹膜轉(zhuǎn)移預(yù)測的截止值為6.5，曲線下面積為0.626(95%CI:0.519～0.733)，靈敏度為90.0%，特異度為43.0%(圖4)。

A：Kaplan-Merier生存曲線顯示原發(fā)灶LETM2高、低表達(dá)組胃癌總生存率差異具有顯著性；B：ROC曲線分析原發(fā)灶LETM2免疫組織化學(xué)染色評分對胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶的預(yù)測價值。圖4 原發(fā)灶LETM2表達(dá)水平對胃癌預(yù)后及腹膜轉(zhuǎn)移預(yù)測評價Fig.4 Evaluation of predictive value of LETM2 expression in primary tumor for prognosis and peritoneal metastasis of gastric cancer

表1 胃癌原發(fā)灶LETM2表達(dá)與胃癌臨床病理特征相關(guān)性分析Tab.1 Correlation of LETM2 expression with clinicopathologic characteristics of gastric cancer

2.4 腹水細(xì)胞沉渣蠟塊LETM2 IHC分析對胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的診斷評價 LETM2在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移腹水IHC強(qiáng)度大于炎癥細(xì)胞(圖5)，以經(jīng)病理和臨床證實陰性的胃癌患者腹腔沖洗液/腹水為陰性對照組，病理和臨床診斷明確的胃癌患者腹水細(xì)胞沉渣為陽性對照組，LETM2 IHC分析結(jié)果顯示，20例胃癌腹水細(xì)胞LETM2陽性表達(dá)率(靈敏度)為15/20(75.0%)，陰性表達(dá)率為5/20(25.0%)；陰性對照組陽性表達(dá)率為10/60(16.7%)，陰性表達(dá)率(特異度)為50/60(83.3%)(表2)。

表2 胃癌腹水轉(zhuǎn)移灶中LETM2免疫組織化學(xué)染色檢測的靈敏度和特異度分析Tab.2 Sensitivity and specificity of the LETM2 immunohistochemical detection in sections from peritoneal metastatic loci of gastric cancer

A：胃癌患者陰性腹水細(xì)胞沉渣蠟塊LETM2免疫組織化學(xué)染色，右上角為黑框內(nèi)炎癥細(xì)胞局部放大；B：胃癌患者陽性腹水細(xì)胞沉渣LETM2免疫組織化學(xué)染色，右上角為黑框內(nèi)腫瘤細(xì)胞局部放大。圖5 腹水沉渣細(xì)胞蠟塊LETM2免疫組織化學(xué)染色(IHC ×200)Fig.5 LETM2 immunohistochemical staining in sections from paraffin-embedded blocks of cells from ascites(IHC ×200)

3 討 論

腹膜轉(zhuǎn)移是胃癌患者復(fù)發(fā)和死亡的主要原因之一，預(yù)示預(yù)后不良，治療方式選擇有限[2]。開發(fā)用于早期檢測的生物標(biāo)志物有助于晚期胃癌患者的個體化臨床化療方案選擇和改善臨床預(yù)后。本研究旨在通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析和IHC檢測，尋找新的腹膜轉(zhuǎn)移預(yù)測的敏感和特異性分子標(biāo)志物。首先基于胃癌數(shù)據(jù)集GSE62254和WGCNA分析發(fā)現(xiàn)腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)的樞紐模塊，其次基于3個數(shù)據(jù)集基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)(GSE62254、GSE84437和TCGA-STAD)和患者生存數(shù)據(jù)確定胃癌預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因，二者的交集基因之一LETM2被確定為胃癌腹膜轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)的候選基因。相比于正常胃黏膜和高分化胃腺癌，IHC在原發(fā)灶和腹膜轉(zhuǎn)移中檢測到LETM2蛋白在彌漫型胃腺癌和腹膜轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)。胃癌原發(fā)灶LETM2過表達(dá)與胃癌分化程度、病理分期和腹膜轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。3個胃癌數(shù)據(jù)COX回歸分析和臨床樣本IHC分析均發(fā)現(xiàn)，LEMT2過表達(dá)的胃癌患者總體生存時間短，可能是胃癌患者總生存率的潛在預(yù)測指標(biāo)。

LETM2基因位于第8號染色體，約含有27 000個堿基，編碼線粒體內(nèi)含有LETM1結(jié)構(gòu)域的蛋白2(LETM2)，具有4個選擇性剪接變異亞型。其中Q2VYF4-1被認(rèn)為是經(jīng)典序列，包含胞外螺旋卷曲、轉(zhuǎn)運肽、跨膜區(qū)和跨膜螺旋4個基序，而Q2VYF4-2丟失1～47氨基酸，Q2VYF4-3分別丟失1～47和168～215氨基酸，Q2VYF4-4丟失1～214氨基酸，215位氨基酸出現(xiàn)了錯義突變(p.Lys215Met)(https://www.uniprot.org/uniprot/Q2VYF4#Q2VYF4-1)。

LETM2在睪丸組織中表達(dá)最高，也可以在內(nèi)分泌組織、胃腸道、生殖系統(tǒng)、骨髓和淋巴組織中檢測到。除膠質(zhì)瘤和淋巴瘤外，大多數(shù)腫瘤組織表現(xiàn)出不同強(qiáng)度的LETM2細(xì)胞質(zhì)陽性(https://www.proteinatlas.org/)。本研究LETM2在胃癌細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的IHC分析結(jié)果與之一致。LETM2在正常胃上皮中表現(xiàn)出較低的表達(dá)，但在原發(fā)性腫瘤中表現(xiàn)出較高的表達(dá)，特別是分化差或腹膜轉(zhuǎn)移病灶。IHC分析結(jié)果揭示了LETM2在胃癌進(jìn)展和腹膜轉(zhuǎn)移的潛在作用，但由于不可切除的原因，來自腹膜轉(zhuǎn)移灶的檢測樣本數(shù)量有限，需要多中心研究進(jìn)一步驗證。本研究未能觀察到胃癌原發(fā)腫瘤與肝臟轉(zhuǎn)移灶之間的差異表達(dá)，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶平均陽性率低于腫瘤原發(fā)灶。原因可能如下：首先，肝臟和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移灶太小，通過染色區(qū)域和強(qiáng)度的測量存在一定偏倚[5]。此外，為減少肝臟染色的非特異性背景，IHC分析過程降低了原發(fā)性腫瘤中使用的抗體濃度，增加了切片封閉時間，可能會在一定程度上降低染色強(qiáng)度[6]。再者，眾所周知，腹膜轉(zhuǎn)移和實體器官轉(zhuǎn)移具有不同的轉(zhuǎn)移途徑[7]，筆者假設(shè)LETM2可能在腹膜和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮直接或間接的作用，因為LETM2染色在淋巴結(jié)血管中強(qiáng)表達(dá)，不排除其通過血管促進(jìn)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌原發(fā)灶LETM2 IHC分析對胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶預(yù)測具有一定的特異性和敏感性，其在腹水細(xì)胞沉渣石蠟包埋切片組織中陽性胃癌細(xì)胞的假陽性率和假陰性率相對較低。腹水細(xì)胞沉渣蠟塊IHC檢測與單純細(xì)胞病理檢測相比，具有以下優(yōu)勢：一是細(xì)胞相對集中，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，提高了細(xì)胞學(xué)檢查的陽性率；二是蠟塊可以長期保存，反復(fù)切片，進(jìn)行IHC分析，結(jié)合臨床病史，確定腫瘤細(xì)胞的組織來源。通過比對H-E切片，腹膜轉(zhuǎn)移灶中胃癌細(xì)胞IHC強(qiáng)度高于陰性對照組的間皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞，包括組織細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等，有助于胃癌腹水轉(zhuǎn)移灶中癌細(xì)胞的識別。雖然LETM2 IHC分析腹膜轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞檢測具有較高的敏感性，但特異性尚需進(jìn)行多中心采集胃癌和其他癌癥腹膜轉(zhuǎn)移樣本進(jìn)一步驗證，且多指標(biāo)聯(lián)合檢測更有助于提高陽性檢測值。

在一項255個胃腺癌樣本的研究中，LETM2被認(rèn)為與TCGA分子亞型之一染色體不穩(wěn)定型(CIN)相關(guān)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，LETM2過表達(dá)與彌漫性胃腺癌呈正相關(guān)，彌漫性胃腺癌與TCGA-STAD分子亞型基因穩(wěn)定型(GS)重疊，具有高轉(zhuǎn)移潛能。這種研究差異可能源于發(fā)病部位和檢測方法，病變大都從胃體和胃竇獲得，CIN亞型更常見于胃食管連接處，不排除LETM2影響胃癌發(fā)病和進(jìn)展可能因部位不同，分子機(jī)制不同，需要體內(nèi)和體外實驗進(jìn)一步驗證。

綜上所述，通過WGCNA方法篩選3個數(shù)據(jù)集中與胃癌預(yù)后相關(guān)的基因集，將LETM2確定為晚期胃癌腹膜轉(zhuǎn)移和預(yù)后的潛在預(yù)測標(biāo)志物。臨床樣品的IHC分析進(jìn)一步證實了LETM2預(yù)測胃癌細(xì)胞腹膜轉(zhuǎn)移的潛能，但多中心多指標(biāo)聯(lián)合檢測有助于提高晚期胃癌患者腹膜微小轉(zhuǎn)移灶的敏感性和特異性。