王強，何超，胡城，李莉，向萍

1.石首市人民醫(yī)院，湖北 石首 434400； 2.荊州市職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 荊州 434020

肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae，KP)是最常見的革蘭氏陰性病原體之一，可引起支氣管肺炎和支氣管炎，且常出現(xiàn)強耐藥性[1-2]?？死撞窝滓蚱洳∏閲?yán)重、并發(fā)癥發(fā)生率高、死亡率高而成為主要的公共衛(wèi)生威脅，即使采用抗菌藥物治療后，其死亡率也高達(dá)50%[3-5]。羽扇豆醇是一種三萜類化合物，主要存在于橄欖、杧果等水果中[6]。研究發(fā)現(xiàn)，羽扇豆醇具有抗炎和抗腫瘤等生物學(xué)作用[7-9]。但是，關(guān)于羽扇豆醇對肺部感染肺炎克雷伯菌大鼠的保護作用機制研究甚少。因此，本研究基于核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路探討羽扇豆醇對肺炎克雷伯菌大鼠肺損傷的影響，以期為羽扇豆醇應(yīng)用于臨床治療肺炎克雷伯菌大鼠肺損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物45只SPF級健康成年雄性SD大鼠，6～8月齡，體質(zhì)量280～320 g，購自武漢貝賽模式生物科技有限公司，許可證號：SYXK(鄂)2021-0119。動物飼養(yǎng)于室溫23 ℃，濕度55%的環(huán)境中，可自由飲水，12 h晝夜交替照明。本研究動物實驗遵從國家有關(guān)實驗動物保護規(guī)范和管理條例。

1.2 藥物與試劑羽扇豆醇(美國Sigma公司，貨號：L5632，純度：99%)；半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)抗體、Caspase-9抗體、 B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)抗體、p65抗體、p-P65抗體(英國Abcam公司，貨號：ab13847、ab185719、ab32503、ab196495、ab16502、ab194726)；HRP標(biāo)記的小鼠抗兔二抗、γ-干擾素(interferon gamma，IFN-γ)抗體、白細(xì)胞介素-4(interleukin-6，IL-4)抗體、CD4抗體(美國Santa Cruz公司，貨號：sc-2357、sc-52556 FITC、sc-53084 FITC、sc-13573 PE)；抗IgG-FITC抗體、PE-anti-IgG1抗體(美國Sigma公司，貨號：F1763、FCMAB230P)；蛋白Marker、PierceTMBCA定量試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司，貨號：26616、23227)；PVDF膜(美國Millipore公司，貨號：IPVH00010)；RIPA裂解液(強)、極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：P0013B、P0018FS)；誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)試劑盒、巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1(macrophage chemoattractant protein 1，MCP-1)測試盒、IL-10測試盒(南京建成生物工程研究所，貨號：H372-1、H115、H009)；TUNEL反應(yīng)試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司，貨號：G001-1)。

1.3 儀器Olympus DP71型顯微鏡(日本Olympus公司)；Microfuge22R型高速低溫離心機(美國Beckman公司，離心半徑13.5 cm)；MedGraphics 1085D型肺功能儀器(美國麥加菲公司)；Varioskan Flash型多功能酶標(biāo)儀 (美國 Thermo Fisher Scientific公司)；AMA440N型高壓滅菌鍋(英國Astell公司)；MINI4型電泳槽、170-3940型電轉(zhuǎn)儀(美國 Bio-Rad公司)；GDS-800型凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)。

2 方法

2.1 克雷伯菌肺炎大鼠模型建立、動物分組與給藥大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機分為對照組、模型組、羽扇豆醇低劑量組、羽扇豆醇中劑量組及羽扇豆醇高劑量組，每組各9只。除對照組外，其余組大鼠參照文獻(xiàn)方法建立克雷伯菌肺炎大鼠模型[10]，具體如下：大鼠經(jīng)腹腔注射80 mg·kg-1氯胺酮麻醉，頸部消毒、備皮后，無菌操作，暴露大鼠上段氣管，用 1 mL 注射器刺入氣管并滴入濃度為1.2×109CFU·mL-1的菌液0.15 mL；對照組滴入相同體積的生理鹽水。接種后立即豎立大鼠固定臺，使大鼠保持直立位約20 s，以保證接種菌液因重力作用而入肺。觀察造模后大鼠的臨床表現(xiàn)，若體溫升高，活動度及進(jìn)食明顯下降，體質(zhì)量減輕，有明顯的呼吸喘鳴聲等則表明造模成功。所有大鼠均造模成功，第6天進(jìn)行藥物干預(yù)，羽扇豆醇低、中、高劑量組分別用10 mg·kg-1、20 mg·kg-1、50 mg·kg-1的羽扇豆醇腹腔注射給藥，一次性給藥劑量為1 mL，連續(xù)給藥7 d。

2.2 大鼠肺功能的檢測采用肺功能儀器測量各組大鼠的靜息通氣量、氣道阻力改變和肺容積變換，并做好記錄。

2.3 HE染色觀察肺組織病理損傷取部分肺臟組織放入4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，24 h后脫水，石蠟包埋、切片；然后HE染色：將切片分別置于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ及不同純度(100%、95%、90%、80%、70%)的酒精中各10分鐘，自來水沖洗；蘇木精染色、伊紅染色；由低到高濃度酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片；光學(xué)顯微鏡拍照，觀察其形態(tài)特征。

2.4 TUNEL染色檢測肺組織細(xì)胞凋亡首先對包埋的大鼠肺組織進(jìn)行脫蠟、復(fù)水及抗原修復(fù)，然后使用TUNEL反應(yīng)試劑盒，將配好的反應(yīng)液滴于標(biāo)本上，置于濕盒中，37 ℃孵育1 h。用PBS洗3次，每次 15 min，滴加合適濃度的ToPro熒光探針反應(yīng) 15 min，然后再用PBS清洗3次，每次15 min。最后用中性樹脂封片，顯微鏡下拍照記錄。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測外周血輔助性T細(xì)胞1(helper T cell 1,Th1)和Th2的水平取1 mL抗凝混勻全血加入等量淋巴細(xì)胞分離液，各組均離心后分離外周血單個核細(xì)胞，隨后加入紅細(xì)胞裂解液將殘余紅細(xì)胞裂解，離心取沉淀，制成1×106mL-1的細(xì)胞懸液200 μL，并等量分到測定管與對照管中，測定管加入CD4抗PE抗體10 μL進(jìn)行胞外染色，然后加10倍稀釋的FACS溶血素2 mL進(jìn)行溶血及破膜，最后分別加入IFN-γ抗體、IL-4抗體各 10 μL，對照管加入IgG-FITC抗體和PE-anti-IgG1抗體，混勻后室溫避光30 min。每管加1%多聚甲醛500 μL，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2.6 ELISA檢測外周血清iNOS、MCP-1、IL-10的含量嚴(yán)格按照大鼠iNOS、MCP-1、IL-10 ELISA試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行操作測定大鼠血清iNOS、MCP-1、IL-10的含量。

2.7 Western Blot檢測凋亡及NF-κB相關(guān)蛋白的表達(dá)水平取適量肺臟組織，按13體積比加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液進(jìn)行勻漿，12 000 r·min-1離心10 min，取上清，根據(jù) BCA 試劑盒說明書測蛋白濃度。勻漿上清液與上樣緩沖液11配比，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗(稀釋比例為11 000) 4 ℃ 孵育過夜，二抗(稀釋比例為1500)室溫孵育1 h，TBST漂洗，ECL發(fā)光劑顯影，采用 BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用Image J2x 軟件對各抗體條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計。

3 結(jié)果

3.1 羽扇豆醇對大鼠肺功能的影響與對照組比較，模型組靜息通氣量、氣道阻力改變及肺容積變換均明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，羽扇豆醇中、高劑量組靜息通氣量、肺容積變換及氣道阻力改變明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 不同組大鼠的肺功能比較

3.2 羽扇豆醇對大鼠肺組織病理學(xué)的影響對照組肺臟胸膜完整，間質(zhì)無水腫，無炎性細(xì)胞浸潤，無充血，結(jié)構(gòu)正常；模型組肺臟間質(zhì)嚴(yán)重水腫，肺泡內(nèi)出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞和纖維素樣物質(zhì)沉積，組織局灶性壞死，肺泡壁明顯增厚；與模型組比較，羽扇豆醇中、高劑量組肺組織病變程度明顯減輕。見圖1。

圖1 不同組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色，×400)

3.3 羽扇豆醇對大鼠肺組織細(xì)胞凋亡的影響與對照組比較，模型組肺組織細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，羽扇豆醇中、高劑量組肺組織細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。 見圖2。

注：A：肺組織細(xì)胞凋亡TUNEL染色圖(×400)；B：肺組織細(xì)胞凋亡量化結(jié)果比較。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖2 不同組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率比較

3.4 羽扇豆醇對大鼠肺組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與對照組比較，模型組Cleaved Caspase-3/Caspase-3、Cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2的水平均明顯升高 (P<0.05)。與模型組比較，羽扇豆醇中、高劑量Cleaved Caspase-3/Caspase-3、Cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2的水平均明顯降低 (P<0.05)。見圖3。

注：A：凋亡相關(guān)蛋白條帶；B：凋亡相關(guān)蛋白量化結(jié)果比較。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖3 不同組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

3.5 羽扇豆醇對大鼠外周血中Th1和Th2水平的影響與對照組比較，模型組Th1 (CD4+IFN-γ+) 水平明顯升高 (P<0.05)。與模型組比較，羽扇豆醇中、高劑量組Th1 (CD4+IFN-γ+)水平均明顯降低 (P<0.05)；Th2 (CD4+IL-4+) 水平均明顯升高 (P<0.05)。見圖4。

注：A：流式細(xì)胞儀檢測Th1、Th2的水平；B、C：Th1、Th2水平比較。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖4 不同組大鼠外周血中Th1、Th2水平比較

3.6 羽扇豆醇對大鼠血清中iNOS、MCP-1、IL-10 含量的影響與對照組比較，模型組iNOS、MCP-1含量均明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，羽扇豆醇中、高劑量組iNOS、MCP-1含量均明顯降低(P<0.05)，IL-10含量明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 不同組大鼠血清中iNOS、MCP-1、IL-10的含量比較

3.7 羽扇豆醇對NF-κB活化的影響與對照組比較，模型組P65磷酸化水平明顯升高 (P<0.05)。與模型組比較，羽扇豆醇中、高劑量組P65磷酸化水平均明顯降低 (P<0.05)。見圖5。

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05圖5 不同組大鼠肺組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

4 討論

在克雷伯菌肺炎模型中，病原體抵達(dá)下呼吸道，滋生繁殖，引起肺泡毛細(xì)血管充血、水腫、肺泡內(nèi)纖維蛋白滲出及細(xì)胞浸潤等炎性癥狀，產(chǎn)生大量炎癥因子，加重體內(nèi)炎癥反應(yīng)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，肺部感染肺炎克雷伯菌后會出現(xiàn)大面積的炎癥反應(yīng)，肺泡實質(zhì)和血管周圍有明顯的炎癥浸潤，肺泡壁增厚、水腫[12-13]。雖然，目前尚無關(guān)于羽扇豆醇對克雷伯菌肺炎作用的報道，但有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)羽扇豆醇能調(diào)節(jié)iNOS及IL-6、IL-1β等因子水平，緩解機體炎癥，減輕組織損傷[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，羽扇豆醇處理后，肺部感染肺炎克雷伯菌大鼠的靜息通氣量、肺容積變換及氣道阻力改變均明顯升高，肺組織病變程度減輕，表明羽扇豆醇可改善克雷伯菌肺炎大鼠肺損傷。

細(xì)胞凋亡是由細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因直接調(diào)控，Bax、Bcl-2、caspase-9和caspase-3均在細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用[15-16]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在羽扇豆醇預(yù)處理的肝細(xì)胞中，Bax/Bcl-2的水平及Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達(dá)水平降低，證實了羽扇豆醇體外調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用[17]。同樣，研究發(fā)現(xiàn)，羽扇豆醇可通過增強線粒體抗氧化應(yīng)激抑制高糖誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，而下調(diào)Bax、caspase 9、caspase 3的表達(dá)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠給予羽扇豆醇處理后細(xì)胞凋亡率和Cleaved Caspase-3/Caspase-3、Cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2的水平均明顯降低，表明羽扇豆醇可抑制肺組織細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮肺保護作用，與已有的相關(guān)研究結(jié)果一致。

肺炎克雷伯菌感染可引起炎癥細(xì)胞流入肺實質(zhì)，并伴有促炎細(xì)胞因子和化學(xué)因子的釋放，造成中性粒細(xì)胞聚集[19-20]。有研究發(fā)現(xiàn)，羽扇豆醇可誘導(dǎo)iNOS和NLRP3的mRNA表達(dá)水平下調(diào)，起到抗炎的作用[6，21]。而MCP-1可進(jìn)一步干擾免疫系統(tǒng)的平衡，觸發(fā)其他免疫細(xì)胞的浸潤，加重炎癥的嚴(yán)重程度[22]。Wang等報道羽扇豆醇可下調(diào)MCP-1的表達(dá)，上調(diào)抗炎因子IL-10的表達(dá)，從而減輕炎癥[23]。Thl、Th2作為CD4+T的兩個亞組，分泌不同的細(xì)胞因子，Thl細(xì)胞主要分泌IFN-γ，Th2主要分泌IL-4和IL-10[24]。有研究證實，羽扇豆醇處理后增加了Th2/Th1細(xì)胞因子的分泌比率，表明羽扇豆醇可能具有抗炎作用[25-26]。與前人研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)羽扇豆醇處理后Th1 (CD4+IFN-γ+)水平和 iNOS、MCP-1含量降低；Th2 (CD4+IL-4+) 水平和IL-10含量升高，表明羽扇豆醇可減輕肺部炎癥，改善肺部感染肺炎克雷伯菌所引起的肺損傷。

NF-κB是調(diào)節(jié)炎癥最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，激活的NF-κB可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并與促炎基因啟動子結(jié)合，導(dǎo)致基因表達(dá)和炎癥反應(yīng)增強，從而導(dǎo)致炎癥損傷[27-28]。研究發(fā)現(xiàn)，羽扇豆醇對NF-κB信號通路具有抑制作用，IκBα磷酸化減弱[29-30]。與前人研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)，羽扇豆醇處理后P65磷酸化水平降低，表明羽扇豆醇可有效抑制 NF-κB 的活化。

綜上所述，羽扇豆醇可抑制NF-κB的活化，改善肺部感染肺炎克雷伯菌大鼠肺損傷，并減輕炎性反應(yīng)，為羽扇豆醇應(yīng)用于肺炎的臨床防治提供理論依據(jù)。