曾曉艷，林雅麗，劉應(yīng)蛟*，黃玉婷，龔力民，劉塔斯（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙 40000；.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南昌 330004）

五步蛇又名蘄蛇，學(xué)名尖吻蝮蛇，屬于蝰科動物，主要分布在我國湖南、湖北、福建等黃河以南的地區(qū)，國外僅見于越南北部[1]。蛇毒是從毒蛇的毒腺中分泌出來的一種毒液，屬于生物毒素，是所有毒素中結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜的一類物質(zhì)，其主要化學(xué)成分為毒蛋白、多肽和酶類等二十種以上的生物活性物質(zhì)[2]。在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)方面應(yīng)用廣泛。隨著研究的不斷深入，分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，蛇毒的一些有效成分被相繼提取并應(yīng)用于臨床，在抗腫瘤、抗風(fēng)濕、抗炎、抗凝血以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療方面均有較好的療效。

炎癥反應(yīng)是一種重要的機(jī)體防御過程，實質(zhì)上是機(jī)體與致炎因子進(jìn)行抗?fàn)幍姆磻?yīng)，最終使機(jī)體的內(nèi)環(huán)境以及內(nèi)環(huán)境和外環(huán)境之間達(dá)到新的平衡。免疫細(xì)胞激活是炎癥反應(yīng)的啟動環(huán)節(jié)。RAW264.7巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞，在脂多糖（LPS）等外界因素刺激后能產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）和一氧化氮（NO）等[3]。近年來神經(jīng)毒素在抗炎方面的研究也成為一個熱點(diǎn)，認(rèn)為神經(jīng)毒素能通過抑制多型核細(xì)胞的遷移產(chǎn)生一個長時程抗炎作用[4]。陶方方等[5]采用蘄蛇蛇毒對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠血清TNF-α、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）及金屬蛋白酶組織抑制物1（TIMP-1）的影響；蘄蛇毒素對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎具有抑制作用[6]；蘄蛇提取物醇溶性和水溶性部位有一定的抗風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用[7]。目前蘄蛇蛇毒對炎癥的發(fā)生發(fā)展還不明確。LPS作為觸發(fā)炎癥的因子，LPS與巨噬細(xì)胞膜上的Tolllike受體接觸，刺激巨噬細(xì)胞，使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，動物機(jī)體在致炎因子的作用下發(fā)生炎癥反應(yīng)[8]。此類致炎因子包括TNF-α、IL-6和NO等，對巨噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬、抗原提呈及炎癥調(diào)節(jié)等功能具有重要作用[9-10]。因而本實驗采用LPS刺激RAW264.7細(xì)胞形成體外炎癥模型，考察不同濃度蛇毒對炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、NO分泌的影響，并初步探索其作用機(jī)制，為五步蛇蛇毒的深層次開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞系

小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7（普諾賽生命科技有限公司）。

1.2 試藥

五步蛇蛇毒（簡稱蛇毒）取自湖南永州異蛇酒有限公司基地養(yǎng)殖的五步蛇，經(jīng)低溫保存，過濾處理，冷凍結(jié)成冰塊后進(jìn)行干燥，再真空干燥，自制得到凍干粉[11]。

PBS 緩沖液（Procell，批號：PB180327）、胎牛血清（FBS，Procell，批號：SA190501）、青霉素-鏈霉素溶液（雙抗）（Procell，批號：PB180120）、DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Procell，批號：PM150210）、LPS（Solarbio，批號：426Y039）、噻唑藍(lán)（MTT，Solarbio，批號：309E0511）、二甲亞砜（DMSO，批號：20180105）（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；TNF-α、IL-6和NO檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；核轉(zhuǎn)錄因子p65抗體（NF-κB p65，批號：8242T）、核轉(zhuǎn)錄因子κB 抑制劑激活酶抗體（Iκ，批號：3416T）和核轉(zhuǎn)錄因子κB 抑制蛋白抗體（IκB，批號：76041T）（美國CST）；Affinity Purified Antibody peroxidase Labeled Goat anti-Rat lgG（H＋L）（美 國KPL， 批 號：10232580）；ECL發(fā)光液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號：P1050）。

1.3 儀器

LBI-150-L潔凈工作臺（蘇靜安泰空氣技術(shù)有限公司）；SW-CJ-1FD生化培養(yǎng)箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）；NIB-100倒置顯微鏡（南京江南永新光學(xué)有限公司）；3111 CO2培養(yǎng)箱、1510酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技有限公司）；LE204E102電子天平（梅特勒托利多儀器有限公司）；DYCZ-40A電泳儀/轉(zhuǎn)膜儀（北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 MTT法檢測蛇毒對RAW264.7 細(xì)胞的毒性

2.1.1 細(xì)胞處理 將RAW264.7細(xì)胞復(fù)蘇后，混懸于含10% FBS，1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d換液和傳代1次。

2.1.2 MTT法檢測細(xì)胞存活率 取生長狀態(tài)良好、密度達(dá)到80%～90%的RAW264.7細(xì)胞，密度為2×105個·mL－1、100 μL/孔接種于96孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。實驗分為空白對照（Kb）組和不同蛇毒濃度組（1、5、10、25、50、100、200、300 μg·mL－1），每組平行6孔。蛇毒用DMEM培養(yǎng)基配制，并用0.22 μm濾膜過濾。對照組換含10% FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，蛇毒組分別加入不同濃度的蛇毒，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后避光加入5 mg·mL－1MTT 100 μL于各孔中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，恒溫振蕩器上振蕩10 min，用酶標(biāo)儀于490 nm處測定其吸光度，計算細(xì)胞存活率（%）＝（實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

2.2 細(xì)胞分組處理

參考“2.1.2”的實驗結(jié)果，取無細(xì)胞毒性的蛇毒濃度25、50和100 mg·L－1。取處于生長對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞（2×108個·L－1）移于6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。細(xì)胞分為空白對照（Kb）組、模型（LPS）組、蛇毒25、50和100 mg·L－1組，各組設(shè)3個復(fù)孔。除空白對照組外，其余組細(xì)胞蛇毒預(yù)處理2 h，然后加入LPS 1 mg·L－1，培養(yǎng) 24 h。吸取各組上清液，3000 r·min－1離心10 min，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 ELISA方法檢測蛇毒對TNF-α、IL-6 和NO炎癥因子分泌或生成的影響

取“2.2”項下上清液，采用小鼠 TNF-α、IL-6和NO檢測試劑盒測定上清液中 TNF-α、IL-1β和IL-6 的含量。

2.4 Western blot法檢測 NF-κB p65、IκK、IκB的蛋白表達(dá)

取“2.2”項下上清液，用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞后加入磷酸酶抑制劑（100∶1∶1）混合液，刮取貼壁細(xì)胞，冰上裂解 30 min，然后4℃、12 000 r·min－1，離心30 min，取2 mL上清液用于蛋白濃度測定，其余樣品加入4×Loading Buffer，95℃金屬浴5 min，－80℃凍存。選用10%Gel和5%SDS-PAGE濃縮膠進(jìn)行電泳，完成后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5% TBST稀釋的BSA溶液室溫孵育2 h，加入一抗（1∶1000）過夜，TBST漂洗3次，每次10 min；加入二抗曝光?；叶葤呙栌肐mage J軟件定量分析蛋白條帶，以β-Actin作為內(nèi)參，檢測目的蛋白的表達(dá)變化。

2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

數(shù)據(jù)采用 Graphpad 軟件進(jìn)行分析，組間比較采用雙尾t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。灰度掃描用Image J軟件定量分析蛋白條帶，以β-Actin作為內(nèi)參，檢測目的蛋白的表達(dá)變化。

3 結(jié)果

3.1 蛇毒對RAW264.7 細(xì)胞存活率的影響

結(jié)果見圖1，與空白對照組比較，蛇毒300 μg·mL－1組細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05），當(dāng)蛇毒質(zhì)量濃度在 0～200 μg·mL－1時，細(xì)胞存活率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），即蛇毒對RAW264.7 細(xì)胞沒有毒性作用（見圖1）。綜合考慮選擇25、50、100 μg·mL－1作為蛇毒低、中、高劑量組進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 蛇毒對 RAW264.7 細(xì)胞活性的影響Fig 1 Effect of agkistrodon acutus venom on the cell viability of RAW264.7 cells

3.2 蛇毒對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子影響

與空白對照組相比，LPS組中的TNF-α、IL-6和NO分泌水平顯著增加（P＜0.001）。與LPS組比較，蛇毒25、50、100 μg·mL－1劑量組的TNF-α、IL-6 和NO分泌水平均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），并且呈劑量依賴性，見圖2。

圖2 蛇毒對 TNF-α、IL-6 和NO分泌的影響Fig 2 Effect of agkistrodon acutus venom on the secretion of TNF-α，IL-6， and NO

3.3 蛇毒對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的中NFκB p65、IκK、IκB蛋白表達(dá)影響

與空白對照組比較，LPS組NF-κB p65及IκK蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.001），而IκB蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.001）。予以蛇毒干預(yù)后25μg·mL－1組的NF-κB p65及IκK蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01），IκB蛋白表達(dá)沒有明顯變化（P＞0.05）；蛇毒50 μg·mL－1和100μg·mL－1組 的NF-κB p65及IκK蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.001），IκB蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01，P＜0.001），結(jié)果見圖3。

圖3 蛇毒對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的中NF-κB p65、IκK、IκB蛋白表達(dá)影響Fig 3 Effect of agkistrodon acutus venom on the protein expression of NF-κB p65，IκK，and IκB in RAW264.7 cells stimulated by LPS

4 討論

TNF-α是由單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞受到促炎因子的刺激后合成和釋放的一種關(guān)鍵性促炎性蛋白[11]，具有廣泛生物學(xué)活性的炎性介質(zhì)。TNF-α的生物活性受其濃度高低的影響，在正常情況下，機(jī)體內(nèi)TNF-α的濃度較低，有抗腫瘤、抗感染、促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化等多種生理功能，可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，是機(jī)體免疫防護(hù)的重要介質(zhì)；而當(dāng)TNF-α濃度過高時，反而會作為重要的炎癥遞質(zhì)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的病理生理過程，能增加微血管壁的通透性，并刺激中性粒細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附受體，趨化中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，啟動炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)感染引起的炎癥損害[12]。IL-6是機(jī)體T細(xì)胞經(jīng)過活化后分泌的一種重要免疫調(diào)節(jié)因子，與TNF-α相似，并且與TNF-α共同參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，作為一種促炎因子，為反映機(jī)體炎癥程度的重要指標(biāo)[13]。NO是具有生物活性的氣體分子，其大量生成與炎癥密切相關(guān)，在急性炎癥部位會通過細(xì)胞毒性效應(yīng)引起細(xì)胞損傷，進(jìn)而引起炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展[3]。本研究采用ELISA法測定相關(guān)促炎因子的含量水平，結(jié)果表明，與模型組比較，蛇毒低、中、高劑量（25、50、100 μg·mL－1）組均可以通過抑制TNF-α和IL-6分泌以及NO釋放，從而達(dá)到抗炎的效果。提示蛇毒低、中、高劑量組的抗炎作用與其能夠抑制促炎因子TNF-α、IL-6和NO的釋放有密切關(guān)系。

核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)中，參與機(jī)體的炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答及細(xì)胞的生長調(diào)控等過程。在靜息狀態(tài)下，NF-κB與抑制蛋白IκB結(jié)合形成復(fù)合體，被穩(wěn)定在細(xì)胞質(zhì)中而不能發(fā)揮其基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能[14]。當(dāng)細(xì)胞受到外源性刺激，如TNF-α、IL-1β、IL-6、NO、T細(xì)胞激活劑、生長因子及病毒感染等，NF-κB 誘導(dǎo)激酶（NIK）為IκK的上游激酶，NIK可引起IκKα與IκKβ相應(yīng)位點(diǎn)的磷酸化，通過級聯(lián)反應(yīng)，使IκBs 磷酸化而與NF-κB解離，致使NF-κB 被激活[15]?？梢奛F-κB信號通路對炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮著重要作用。王君燕等[16]證明獐牙菜苦苷對LPS誘導(dǎo)的炎癥模型中TNF-α、IL-6的生成具有抑制作用，其機(jī)制可能與抑制NF-κB通路相關(guān)因子p65、IKK-α的表達(dá)有關(guān)。陳譜等[17]認(rèn)為芍藥苷可以阻止NF-κB通路激活，抑制軟骨細(xì)胞炎癥及延緩軟骨退變。趙康博等[18]認(rèn)為30～240 mg·L－1辣椒堿可以顯著降低由LPS誘導(dǎo)的My D88和NF-κB mRNA的表達(dá)，提示辣椒堿的抗炎活性可能與NF-κB信號通路有關(guān)。本研究采用Western blot法檢測各組細(xì)胞中NF-κB p65、IκK及IκB表達(dá)水平。結(jié)果顯示，蛇毒50 μg·mL－1和100 μg·mL－1組NF-κB p65及IκK蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001），而IκB表達(dá)顯著升高（P＜0.01，P＜0.001）。

現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為蛇毒具有鎮(zhèn)痛（類似嗎啡樣鎮(zhèn)痛作用包括緩解惡性腫瘤疼痛、神經(jīng)痛和關(guān)節(jié)痛等），抗風(fēng)濕，抗腫瘤以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療方面的作用[19]。目前，研究者們對于蛇毒粗毒應(yīng)用于抗炎作用以及機(jī)制的研究報道甚少，本實驗采用LPS刺激RAW264.7細(xì)胞形成體外炎癥模型，觀察了蛇毒干預(yù)后LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞 中NF-κB信號通路NF-κB p65、IκK、IκB表達(dá)含量變化，發(fā)現(xiàn)蛇毒可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB信號通路激活。

綜上，本研究結(jié)果表明，五步蛇蛇毒可能抑制TNF-α和IL-6分泌以及NO生成，從而達(dá)到抗炎的作用，其作用機(jī)制可能是上調(diào)NF-κB p65及IκK表達(dá)水平，下調(diào)IκB表達(dá)水平，激活NF-κB信號通路來抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。