丁志浩 綜述，張曉東 審校

(武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430072)

2020年新增結(jié)直腸癌病例190萬例，死亡93.5萬例，占所有癌癥病例和死亡人數(shù)的1/10，是男性排名第3位、女性排名第2位的常見癌癥[1]。結(jié)腸直腸癌的大多數(shù)病例均不是單一因素導(dǎo)致的。除性別、年齡因素外，流行病學(xué)研究還鑒別出下列危險因素，如遺傳、炎癥性腸病、吸煙、肥胖、酗酒、大量食用紅肉和加工肉類、糖尿病等。此外，感染幽門螺桿菌等其他致病因子也可能增加結(jié)直腸癌患病風(fēng)險[2]。雖然藥物和手術(shù)治療方法不斷發(fā)展[3]，但結(jié)直腸癌患者病死亡率依然很高。結(jié)直腸癌的發(fā)病原因多種多樣，涉及許多細(xì)胞通路，Notch信號通路正是其中之一[4]，而且最近許多研究已證明Notch信號是結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵[5]。因此，本文較為細(xì)致地描述了Notch信號通路，以及針對Notch通路的特定蛋白治療結(jié)直腸癌的方法。

1 Notch信號通路簡述

Notch是摩爾根于1917年在果蠅突變體中發(fā)現(xiàn)的，并且證明其是X連鎖的隱性致死基因。1983年，果蠅Notch基因首次被分離出來[6]；2年后其序列被公布[7]。Notch受體和配體基因存在于所有后生動物中，足以見其進(jìn)化的保守，在胚胎發(fā)生期間相鄰細(xì)胞通過Notch交換信息決定細(xì)胞分化命運[8]。Notch信號通路調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生命活動，包括增殖、干細(xì)胞維持、分化和死亡[9]。

1.1Notch配體和受體的結(jié)構(gòu) 人類Notch有5個配體和4個受體，配體Jagged-1、Jagged-2、Delta-like-1(Dll-1)、Delta-like-3(Dll-3)、Delta-like-4(Dll-4)是包含表皮生長因子(EGF)樣重復(fù)的單通道跨膜蛋白DSL(Delta/Serrate/Jagged)家族的成員[10]。Notch通路的4個受體(Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4)均為跨膜糖蛋白，均由1個胞外結(jié)構(gòu)域、1個跨膜結(jié)構(gòu)域、1個膜內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成[11]。見圖1A。Notch受體的胞外結(jié)構(gòu)域由多個EGF重復(fù)序列和負(fù)調(diào)控區(qū)(NRR)組成，NRR由3個Lin12-Notch重復(fù)序列(Lin-12 and Notch repeats、Lin-12、Notch重復(fù)序列)結(jié)構(gòu)域和異二聚結(jié)構(gòu)域組成。Notch受體的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域從近膜端到遠(yuǎn)膜端依次為重組信號結(jié)合蛋白為免疫球蛋白kappa J區(qū)相關(guān)分子結(jié)構(gòu)域、錨蛋白重復(fù)序列、C端TAD拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域(反式激活結(jié)構(gòu)域)，TAD結(jié)構(gòu)域由3個核定位序列和末端富含脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氦酸的約10個氨基酸組成的結(jié)構(gòu)序列(富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)序列組成。Notch配體DSL的胞外結(jié)構(gòu)域包括1個Notch配體N端模塊結(jié)構(gòu)域、DSL結(jié)構(gòu)域和近膜額外的EGF重復(fù)序列[12]。

1.2Notch蛋白的產(chǎn)生 Notch蛋白首先被運輸至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，將來的細(xì)胞外亞基被蛋白蛋白質(zhì)O-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶1(PoFuT1)、蛋白質(zhì)O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶1或EGF結(jié)構(gòu)域特異性O(shè)-連接N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶糖基化，隨后還可能被N-乙酰葡糖胺糖苷酶繼續(xù)糖基化。糖基化修飾調(diào)節(jié)了Notch受體對不同配體的親和力，隨后糖基化的前體通過高爾基體運輸。Notch前體在S1位點被高爾基體反面管網(wǎng)區(qū)中的一種Furin樣蛋白酶裂解，產(chǎn)生非共價結(jié)合的Notch細(xì)胞外異二聚體，之后異二聚體作為Ⅰ型跨膜蛋白運輸至細(xì)胞膜上[12]。細(xì)胞膜上Notch受體蛋白數(shù)量時刻處于動態(tài)，受組成型內(nèi)吞作用調(diào)控，泛素連接酶神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育性下調(diào)蛋白4促進(jìn)該過程。從高爾基體釋放的Notch可被運輸至質(zhì)膜上，也可被輸送至溶酶體降解或在核內(nèi)體中儲存。NUMB可阻止Notch再運輸至質(zhì)膜，并通過Deltex/ITCH促進(jìn)其泛素化，并轉(zhuǎn)運至溶酶體降解。在果蠅中Deltex能促進(jìn)胞內(nèi)體中Notch的激活，但在哺乳動物中DTX1(即人源Deltex)卻是一個負(fù)調(diào)控因子[13-14]。見圖1 B。

1.3Notch信號通路的激活 在經(jīng)典的Notch通路中配體與相鄰細(xì)胞之間的Notch受體結(jié)合，Notch被激活并發(fā)生2次切割。首先解整合素金屬蛋白酶10(ADAM10)/ADAM 17在Notch胞外的S2位點切割，去除Notch受體的胞外結(jié)構(gòu)域，并產(chǎn)生細(xì)胞外截短體[15]，隨后由γ-分泌酶復(fù)合體——PEN-2和前咽缺陷因子-1，在S3位點切割(切割過程既可以發(fā)生在細(xì)胞膜，也可以發(fā)生在胞內(nèi)體)產(chǎn)生Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)，然后NICD轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核[16]，結(jié)合CSL(C-端重復(fù)/DRE結(jié)合因子1/無毛抑制因子/延長酵母的壽命的基因1)復(fù)合體。見圖1C。在NICD不存在的情況下CSL作為沉默因子抑制轉(zhuǎn)錄。NICD的結(jié)合招募了轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，包括類似轉(zhuǎn)錄輔激活因子1～3、Ski作用蛋白/cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白/p300組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶、激活CSL轉(zhuǎn)錄復(fù)合體等[17]激活下游發(fā)狀分裂相關(guān)增強子1等基因。見圖1C。非經(jīng)典Notch信號通路可以由非經(jīng)典Notch配體激活或不需要配體也能激活，Notch受體也可以不被切割，某些非經(jīng)典途徑甚至不需要核內(nèi)CSL復(fù)合物，而是與其他效應(yīng)器發(fā)生相互作用。圖1C。在T淋巴細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)中NICD1與IκB激酶α/IκB激酶β相互作用激活核因子κB[18]，在T淋巴細(xì)胞中NICD1也可以激活蛋白激酶B信號通路[19]。非經(jīng)典Notch信號通路的研究才剛剛開始，內(nèi)容太過寬泛而難以描述，但這些新的激活方式卻是很好的藥物靶點[20]。

2 Notch信號通路與結(jié)直腸癌

2.1Notch信號通路與腫瘤 由于Notch的重要性，其在癌癥發(fā)生、發(fā)展中扮演了雙刃劍的角色。在T-ALL、慢性淋巴細(xì)胞白血病[21]、三陰乳腺癌[22]和非小細(xì)胞肺癌[23]中均能檢測到Notch基因的功能獲得性突變。在結(jié)直腸癌[24]、前列腺癌[25]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、其他惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)，Notch信號下調(diào)或失活。甚至在同種癌癥中Notch也扮演著相反的角色，Notch在T淋巴細(xì)胞惡性腫瘤(如T-ALL)和慢性淋巴細(xì)胞白血病中具有致癌作用，但在B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性粒單核細(xì)胞白血病、急性髓系白血病中卻具有抑癌作用[26-27]。

2.2Notch信號通路與結(jié)直腸癌 Notch在上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中扮演著重要的角色，在此過程中上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)表型，最終導(dǎo)致遷移。在內(nèi)皮細(xì)胞中Notch-1通過啟動子中的E-box間接抑制E-鈣黏蛋白基因表達(dá)，誘導(dǎo)EMT[28]。抑制Notch可以下調(diào)Snail的表達(dá)，從而抑制乳腺癌的耐藥性[29]。Slug蛋白可以抑制Dll-4-Notch信號通路，并促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子受體2的表達(dá)，有利于腫瘤血管的生成[30]。此外，轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路可增加Notch配體的表達(dá)，誘導(dǎo)EMT，而且轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)的EMT可通過Jagged-1敲除或Notch失活來阻斷[4]。Notch在維持正常腸上皮細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用[31]，同樣Notch在結(jié)直腸癌中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用，敲除Jagged-1的結(jié)腸癌細(xì)胞的生長速度比對照組慢得多,Jagged-1缺失是促進(jìn)大腸癌發(fā)生的重要原因，該過程通過抑制腫瘤細(xì)胞分化并促進(jìn)血管生成而誘發(fā)腫瘤[32]。HES1是Notch-1的下游因子，可抑制Kruppel樣因子(KLF4)，而高表達(dá)KLF4對結(jié)直腸癌具有抑制作用[33]?；|(zhì)金屬蛋白酶9可強烈上調(diào)Notch1，并誘導(dǎo)EMT[34]。與普通結(jié)直腸癌細(xì)胞系比較，在腫瘤干細(xì)胞中Notch信號通路增強了10～30倍，Notch通過抑制細(xì)胞周期激酶抑制劑——p27和轉(zhuǎn)錄因子——無調(diào)節(jié)性bHLH轉(zhuǎn)錄因子1阻止腫瘤干細(xì)胞凋亡，且Notch對腫瘤干細(xì)胞自我更新的維持和分泌細(xì)胞分化基因(如黏蛋白2)的抑制也至關(guān)重要[35]，這有利于其保持干細(xì)胞特性。有研究發(fā)現(xiàn)，Notch1基因拷貝數(shù)的增加與晚期結(jié)直腸癌患者的較差生存率顯著相關(guān)，結(jié)直腸癌患者來源的腫瘤異種移植模型中Notch1表達(dá)上調(diào)的腫瘤表現(xiàn)出Notch1、JAG1和NICD1的顯著升高，而用Notch1抗體靶向這一患者群體可能會有所改善[36]。大量mRNA測序證明，Notch靶基因——HES1在人結(jié)直腸癌中均有表達(dá)，且JAG配體、NOTCH和HES1的表達(dá)水平均有所升高，這些基因表達(dá)的變化是結(jié)直腸癌的一致特征。有趣的是，Notch1和Notch2對結(jié)直腸癌患者具有相反的預(yù)后影響，且Notch1陽性協(xié)同Notch2陰性會導(dǎo)致患者更差的整體生存率[37]。

3 靶向Notch的治療方法

結(jié)直腸癌的傳統(tǒng)治療方法包括手術(shù)方法和化學(xué)藥物資料，如西妥昔單抗、伊立替康、氟尿嘧啶、亞葉酸鈣已被用于治療結(jié)直腸癌[38]。因Notch無處不在，所以，產(chǎn)生了泛Notch抑制的簡單治療策略，但這種治療方法會無差別攻擊細(xì)胞，所以，針對泛Notch抑制策略的缺點產(chǎn)生了很多靶向性治療方法。

3.1γ-分泌酶抑制劑(GSIs) GSIs是第一個，也是目前研究最廣泛的小分子Notch抑制劑。這些GSIs最初是作為阿爾茨海默病的研究藥物開發(fā)的。GSI干擾Notch激活的S3切割和蛋白水解步驟，阻止NICD的釋放。從理論上講，這些GSIs均是泛Notch抑制劑，由于γ-分泌酶參與多種底物的裂解反應(yīng)，所以，GSIs不是Notch特異性試劑[39]，GSIs的缺點之一是腸道毒性。Notch1和Notch2調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞系之間的腸隱窩干細(xì)胞分化，在缺乏Notch1和Notch2的情況下腸干細(xì)胞多數(shù)向杯狀細(xì)胞系分化。在體外實驗中DAPM(一種GSI抑制劑)可上調(diào)KLF4和p21的表達(dá)。與對照組比較，DAPM處理的小鼠結(jié)腸腫瘤中KLF4、p21水平升高，而Ki-67染色降低[40]，表明DAPM在治療結(jié)直腸癌通過KLF4通路發(fā)揮功能。

3.2γ-分泌酶調(diào)節(jié)劑(GSM) GSM是一種小分子物質(zhì)，可以在不作為競爭抑制劑的情況下改變γ-分泌酶的催化活性。在發(fā)現(xiàn)GSIs的不良反應(yīng)后研發(fā)工作者旨在開發(fā)GSMs，使其在調(diào)節(jié)Notch的同時保留Notch的切割活性，如早老素1選擇性GSM(MRK560)在T-ALL動物模型中抑制突變Notch1的切割，卻不會引起腸道毒性[41]。

3.3ADAM抑制劑 ADAM10和ADAM17在配體介導(dǎo)的Notch激活中完成細(xì)胞外S2位點的切割。目前，一種新型ADAM17抑制劑——ZLDI-8通過抑制Notch通路達(dá)到抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的效果。該研究也經(jīng)過體內(nèi)實驗證明，ZLDI-8通過抑制Notch而抑制EMT，也能協(xié)同5-氟尿嘧啶或伊立替康提高這2種藥物的抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移活性[42]。

3.4Notch糖基化調(diào)節(jié)劑 POFUT1采用O-巖藻糖修飾Notch受體細(xì)胞外亞基的EGF重復(fù)序列。這些糖基化對正確的Notch信號傳導(dǎo)至關(guān)重要。6-炔基巖藻糖和6-烯基巖藻糖[43]這2個糖基類似物是POFUT1的底物，可以被催化并連接上Notch的EGF重復(fù)序列，其均是Notch配體Dll-1和Dll-4與Notch1結(jié)合并激活Notch1的有效抑制劑，但并不影響Jagged-1的功能，這種定向抑制劑具有作為靶向藥物的潛力。

3.5治療性微小RNA(miRNA) miRNA作為癌癥的潛在生物標(biāo)記物和治療學(xué)正在受到關(guān)注。miR-598可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中的EMT，并被證明可降低Jagged-1 mRNA的表達(dá)[44]。miR-195-5p在結(jié)直腸癌組織中顯著下調(diào)，而TCGA-COAD數(shù)據(jù)庫中低水平的miR-195-5p患者的總生存期顯著縮短，miR-195-5p通過結(jié)合Notch2和CSL mRNA的3′非翻譯區(qū)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的干細(xì)胞樣能力[45]。

3.6單克隆抗體、抗體-藥物結(jié)合物和靶向免疫療法 為規(guī)避泛GSIs的局限性，一些實驗室和生物公司已開發(fā)出針對特定Notch受體或配體的單克隆抗體，現(xiàn)已開發(fā)出2類阻斷抗Notch藥物，一類針對Notch受體的NRR；另一類針對Notch受體的細(xì)胞外配體結(jié)合域(LBD)。從抗體噬菌體展示庫中生成單鏈抗體形式的抗Notch抗體，并用Luciferase發(fā)現(xiàn)了6種針對Notch1的NRR的抗體和4種識別Notch2的NRR的抗體，能阻止Notch激活。與廣泛使用的小分子GSIs比較，抗體能以一種高度特異性的方式封閉單個Notch蛋白[46]。有學(xué)者開發(fā)了一種針對Notch1 LBD的單克隆抗體(23814)，該單克隆抗體可在人和小鼠細(xì)胞中特異性阻斷配體誘導(dǎo)的Notch1激活，阻斷血管生成并抑制腫瘤生長，而無胃腸毒性[47]。JIMENO等[48]開發(fā)的Dll-4和VEGF雙特異性抗體(OMP-305B83，navicixizumab)的在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌與葉酸、5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑或伊立替康聯(lián)合化療的一期研究也已經(jīng)完成。

3.7天然化合物 來自植物的天然化合物可能會成為更好的選擇，如槲皮素聯(lián)合低劑量電離輻射可顯著降低HT-29、DLD-1細(xì)胞中γ-分泌酶復(fù)合物5種蛋白的表達(dá)，有效治療結(jié)直腸癌[49]。青蒿素(一種抗瘧疾劑)可抑制BMI1(一種多克隆轉(zhuǎn)錄抑制因子，在幾種癌癥的腫瘤干細(xì)胞中致癌并上調(diào))的表達(dá)，并降低Notch1和靶基因——HES1、MYC的表達(dá)，但遺憾的是該抑癌效果發(fā)生于T-ALL細(xì)胞中，而非結(jié)直腸癌[50]。

總之，現(xiàn)階段多種藥物治療策略均在不斷深入，這些Notch相關(guān)藥物的單一使用效果可能一般，但聯(lián)合使用會大大提升其療效。

4 小結(jié)與展望

雖然結(jié)直腸癌的診治技術(shù)有了巨大進(jìn)步，但結(jié)直腸癌的發(fā)病率和致死率仍居高不下，并且還具有向年輕化發(fā)展的趨勢。不幸的是，社會的進(jìn)步并沒有減少結(jié)直腸癌的出現(xiàn)，且結(jié)直腸癌發(fā)生率與社會發(fā)展水平呈正相關(guān)。因此，研究結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制也很有必要。

Notch作為最保守的細(xì)胞信號通路之一，參與了眾多最基本生物學(xué)過程。正常的Notch調(diào)節(jié)著細(xì)胞的增殖、分化和死亡，異常的Notch失去調(diào)節(jié)能力經(jīng)常會造成細(xì)胞的癌變。而且Notch與其他許多重要信號通路，如RAS、蛋白激酶B、核因子κB相互作用，探究其信號交叉方式、尋找關(guān)鍵的中間蛋白能更深入地了解結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制，為開發(fā)更有效的藥物和治療方案提供幫助。

了解Notch信號通路有助于建立Notch通路相關(guān)的結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物，如Notch1、JAG1、NICD1等蛋白在結(jié)直腸癌中異常表達(dá)可作為早期篩查和判斷預(yù)后的檢測標(biāo)志物。目前，針對Notch通路的腫瘤抑制劑和治療藥物也被迅速開發(fā)。與傳統(tǒng)化療比較，靶向藥物針對性更強，具有更高的療效和更小的毒性?，F(xiàn)有的靶向藥物主要針對Notch信號通路的γ分泌酶、ADAM蛋白、NICD復(fù)合體、NRR區(qū)域、LBD區(qū)域、配體的糖基化位點等。目前，正在致力于尋找特異性更高、毒性更低的抑制劑。同時，為防止抑制劑影響Notch通路正常的功能，Notch調(diào)節(jié)劑也被廣泛研究，其可以在抑制癌細(xì)胞的同時不影響體細(xì)胞的正常生長。另外，很多天然化合物的提取物也可以抑制Notch信號通路，而且已被證實在乳腺癌、肺癌、白血病中具有良好的效果，其毒性也遠(yuǎn)小于人工合成的小分子抑制劑，將來這些天然產(chǎn)物有希望用于治療結(jié)直腸癌。雖然很多靶向藥物如今仍在試驗階段，但期待隨著Notch信號通路研究的深入，結(jié)直腸癌的靶向治療方案會有更多的選擇，結(jié)直腸癌的治療水平整體得到提高。