吳 勛，史英武，屈 延，葛順楠

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710038)

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)主要是由于軍事作戰(zhàn)、各類交通事故、意外墜落等原因造成的顱腦損傷，往往會伴隨長期的精神障礙[12]。海馬體屬于邊緣系統(tǒng)的一部分，在學(xué)習(xí)、記憶與認(rèn)知中起著重要作用。TBI后海馬功能障礙會導(dǎo)致記憶喪失和認(rèn)知障礙[3]。同時(shí)越來越多的臨床證據(jù)表明，TBI后發(fā)生海馬體相關(guān)認(rèn)知功能障礙疾病的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高[4]。但是目前TBI后誘發(fā)海馬細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷與認(rèn)知功能障礙的病理機(jī)制仍不清楚，闡明其損傷機(jī)制并構(gòu)建靶向治療策略對于改善TBI患者的生活質(zhì)量具有十分重要的意義。

丙烯醛(acrolein，Acr)是一類高度活性的不飽和醛產(chǎn)物，其半衰期明顯長于活性氧(reactive oxygen species，ROS)[5]。有研究證實(shí)Acr具有神經(jīng)損傷作用，在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要影響，清除Acr可有效減輕腦卒中后的繼發(fā)腦損傷[6]。同時(shí)，還有研究表明Acr在退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，顯著影響機(jī)體認(rèn)知功能；在阿爾茨海默病以及帕金森病的疾病模型中，Acr的水平顯著增高，通過清除Acr可以觀察到明顯的認(rèn)知功能改善[78]。然而，迄今為止，Acr在罹患TBI后的患者的認(rèn)知功能障礙中的作用尚不清楚。肼苯噠嗪(hydralazine，Hyd)是Acr的一種高效清除劑，其有效性以及安全性已在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型中被證實(shí)[9]。因此，本研究以Hyd治療為干預(yù)模式，探討清除Acr能否有效改善TBI后的認(rèn)知功能障礙。

1 材料與方法

1.1 材料

成年(6～8周)C57BL/6健康雄性小鼠(體質(zhì)量20～25 g)66只，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，每籠6只，實(shí)驗(yàn)前在空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院腦科研究所動物房內(nèi)進(jìn)行1周適應(yīng)性飼養(yǎng)，室溫22～25 ℃，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)飼養(yǎng)，并給予足量的水與食物。本研究的動物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(許可證號：TDLL2017-03-190)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方案 先將成年C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)和TBI后不同時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后3、7、14、28 d)4個亞組，通過Western blotting檢測海馬區(qū)Acr水平的變化情況，繼而確定合適時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)研究。然后再將小鼠隨機(jī)分為Sham組、TBI組和TBI+Hyd(Acr清除劑)干預(yù)組，分別通過Morris水迷宮(morris water maze，MWM)實(shí)驗(yàn)、Western blotting、ELISA以及PCR等檢測各組認(rèn)知功能、突觸相關(guān)蛋白表達(dá)與線粒體生物發(fā)生的變化情況，進(jìn)而評估Hyd對TBI后的認(rèn)知功能障礙的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。

1.2.2 小鼠TBI模型的建立及處理 本實(shí)驗(yàn)采用受控皮質(zhì)沖擊(controlled cortical impact，CCI)模型來模擬TBI損傷[10]。注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠，以俯臥位將小鼠固定于立體定位儀架上。剃除并清理小鼠頭頂部毛發(fā)，10 mL/L碘伏消毒后剪皮，暴露目的區(qū)域顱骨。蘸取3 mL/L雙氧水擦拭清理骨膜。以前囟后2 mm、旁開1.5 mm為中心點(diǎn)鉆取直徑3 mm的圓形骨窗。打開CCI打擊器，設(shè)定參數(shù)為：速度3 m/s，深度1.5 mm，停留時(shí)間為0.2 s，實(shí)施打擊。術(shù)后填補(bǔ)骨窗，縫合皮膚，置于恒溫板待其蘇醒。假手術(shù)組小鼠取出骨瓣后不進(jìn)行CCI打擊器打擊，其余操作相同。治療組小鼠術(shù)后每日腹腔注射5 mg/kg的Hyd，其他組腹腔注射等量的生理鹽水。

1.2.3 MWM實(shí)驗(yàn) 通過MWM實(shí)驗(yàn)評估小鼠認(rèn)知功能[11]。在前5 d每日將小鼠從平臺的4個不同象限放入并各訓(xùn)練1次。在每次試驗(yàn)中，給小鼠60 s的時(shí)間找到站臺。通過視頻追蹤軟件觀察動物在水迷宮中的活動情況，記錄并分析逃逸潛伏期。第6日進(jìn)行長時(shí)空間記憶測試。測試前移除平臺，從4個不同方向分別測試60 s。統(tǒng)計(jì)分析小鼠在目標(biāo)象限中的游動路程與總路程數(shù)的比值，以及小鼠經(jīng)過原平臺的次數(shù)。

1.2.4 Western blotting 通過Western blotting檢測分子蛋白表達(dá)變化[12]。麻醉小鼠后，生理鹽水灌注，取相應(yīng)腦組織于離心管中，加入含有蛋白酶抑制劑的強(qiáng)效細(xì)胞裂解液裂解20 min。經(jīng)超聲勻漿機(jī)勻漿后再靜置20 min，在離心機(jī)中保持4 ℃條件，以12 000g的速度離心15 min。留取上清液，使用蛋白質(zhì)定量試劑盒(UA276918，賽默飛世爾科技公司，美國)進(jìn)行蛋白濃度定量。加入一定量的上樣緩沖液，95 ℃條件下煮沸10 min完成制樣。準(zhǔn)備好電泳儀、電泳液和凝膠，吸取蛋白樣品依次上樣、電泳，至樣品跑至凝膠下緣時(shí)停止。電泳結(jié)束后取凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，待蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上后，將膜置于50 mL/L牛奶溶液(Tris鹽酸緩沖鹽溶液+吐溫溶液配置)中封閉1～2 h。封閉結(jié)束后，置于4 ℃冷庫一抗孵育過夜。待次日用Tris鹽酸緩沖鹽溶液清洗3次，每次5 min后，室溫孵育相應(yīng)的二抗2 h，然后用Tris鹽酸緩沖鹽溶液再次清洗3次，每次10 min。配置發(fā)光液并通過成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)進(jìn)行蛋白條帶檢測以及灰度分析。實(shí)驗(yàn)中使用的主要抗體如下：Acr(1∶1 000，Abcam，英國)；PSD95(1∶1 000，Proteintech，美國)；synaptophysin(1∶1 000，Proteintech，美國)；spinophilin(1∶1 000，Proteintech，美國)；PGC1α(1∶1 000，Invitrogen，美國)；Tfam(1∶1 000，Invitrogen，美國)；Nrf1(1∶1 000，Proteintech，美國)；β-actin(1∶3 000，abclonal，中國)。

2 結(jié)果

2.1 Western blotting檢測Acr的蛋白水平及MWM實(shí)驗(yàn)評估小鼠認(rèn)知功能

Western blotting檢測各組小鼠海馬區(qū)Acr的蛋白水平變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Sham組小鼠相比，TBI后3 d，Acr的水平開始明顯升高，14 d后Acr水平達(dá)到高峰，28 d時(shí)有所降低，但依舊維持較高水平(P<0.05，圖1A～B)。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，我們挑選TBI后14 d作為研究時(shí)間點(diǎn)，將小鼠分為Sham組、TBI組與TBI+Hyd干預(yù)組，對各組小鼠進(jìn)行MWM實(shí)驗(yàn)，評估其認(rèn)知功能改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組小鼠的游泳速度沒有顯著差異(圖1C)。與Sham組相比，TBI組小鼠的逃離潛伏期明顯延長(P<0.05，圖1D)，經(jīng)過原平臺的次數(shù)明顯減少(P<0.05，圖1E)，并且在目標(biāo)象限的游泳路程與其總游泳路程的比值也明顯降低(P<0.05，圖1F)。當(dāng)給予Hyd治療后發(fā)現(xiàn)，小鼠的逃離潛伏期明顯縮短(P<0.05，圖1D)，在目標(biāo)象限的游泳路程與其總游泳路程的比值有所升高(P<0.05,圖1F)，經(jīng)過原平臺的次數(shù)也有明顯增加(P<0.05，圖1E)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，Acr清除劑能有效改善小鼠TBI后的認(rèn)知功能損傷。

A～B：Western blotting檢測各組小鼠海馬Acr的蛋白表達(dá)水平；C：各組小鼠的游泳速度；D：逃離潛伏期；E：經(jīng)過原平臺的次數(shù)；F：目標(biāo)象限的游泳路程占總游泳路程的比值。Sham：假手術(shù)；TBI：創(chuàng)傷性腦損傷；TBI+Hyd：肼苯噠嗪治療；MWM：Morris水迷宮。n=6， aP<0.05 vs Sham組；cP<0.05 vs TBI組。圖1 Western blotting檢測Acr的蛋白水平及MWM實(shí)驗(yàn)評估小鼠認(rèn)知功能

2.2 小鼠海馬突觸相關(guān)蛋白synaptophysin、PSD95與spinophilin的表達(dá)

為進(jìn)一步評估Acr清除劑的保護(hù)作用，我們檢測了各組小鼠的海馬神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白synaptophysin、PSD95與spinophilin的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，TBI組synaptophysin、PSD95與spinophilin的表達(dá)水平均明顯下降，但Acr清除劑干預(yù)后能顯著扭轉(zhuǎn)這一趨勢(P<0.05，圖2)。

A：Western blotting檢測蛋白synaptophysin、PSD95與spinophilin表達(dá)水平的條帶圖；B：synaptophysin的表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖；C：PSD95的表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖；D：spinophilin的表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖。Sham：假手術(shù)；TBI：創(chuàng)傷性腦損傷；TBI+Hyd：肼苯噠嗪治療。n=6，aP<0.05 vs Sham組;cP<0.05 vs TBI組。圖2 Western blotting檢測小鼠海馬突觸相關(guān)蛋白synaptophysin、PSD95與spinophilin的表達(dá)

2.3 線粒體生物發(fā)生的相關(guān)調(diào)節(jié)因子PGC1α、Nrf1及Tfam檢測結(jié)果

線粒體是促進(jìn)TBI后認(rèn)知功能恢復(fù)的重要靶標(biāo)。細(xì)胞通過線粒體生物發(fā)生增加線粒體的數(shù)量和促進(jìn)線粒體的代謝功能，為細(xì)胞修復(fù)提供必要的能量。既往研究證實(shí)，Acr能損傷線粒體正常功能[13]，因此，我們對清除Acr能否有效改善線粒體生物發(fā)生、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)進(jìn)行了猜測。我們首先通過Western blotting對線粒體生物發(fā)生的相關(guān)調(diào)節(jié)因子PGC1α、Nrf1以及Tfam進(jìn)行了檢測，結(jié)果提示，與Sham組相比，TBI后海馬區(qū)PGC1α、Nrf1以及Tfam的表達(dá)水平顯著降低，清除Acr后能顯著升高這些蛋白的表達(dá)水平(P<0.05，圖3A～B)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)TBI后ATP與mtDNA的生成顯著降低，而Acr清除劑治療后能很大程度恢復(fù)TBI后ATP的生成水平(P<0.05，圖3C～D)。以上結(jié)果都提示，清除Acr能有效改善TBI后的線粒體生物發(fā)生。

A～B：Western blotting檢測線粒體發(fā)生關(guān)鍵蛋白PGC1α、Nrf1以及Tfam的表達(dá)水平；C：各組ATP水平檢測分析；D：各組mtDNA水平檢測分析。Sham：假手術(shù)；TBI：創(chuàng)傷性腦損傷；TBI+Hyd：肼苯噠嗪治療。n=6， aP<0.05 vs Sham組；cP<0.05 vs TBI組。圖3 線粒體生物發(fā)生的相關(guān)調(diào)節(jié)因子Pgc1ɑ、Nrf1及Tfam檢測結(jié)果

3 討論

TBI患者常常伴有長期的認(rèn)知功能障礙，極大地影響了患者的生活質(zhì)量。但是目前TBI患者認(rèn)知功能障礙發(fā)生的分子機(jī)制不明，有效的臨床治療手段缺乏。Acr已經(jīng)被證實(shí)參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程。本研究發(fā)現(xiàn)TBI后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠海馬區(qū)Acr水平都有顯著增高，因此，我們推測升高的Acr可能參與了TBI后認(rèn)知功能障礙的病理發(fā)展過程。Hyd是Acr的高效清除劑，其有效性與安全性已在多種動物疾病模型中進(jìn)行過充分的驗(yàn)證。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Hyd給藥能顯著減輕TBI小鼠的認(rèn)知功能障礙，且從亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)層面觀察的結(jié)果同樣也證實(shí)了這一點(diǎn)。因此，這為Acr清除劑未來作為治療TBI后認(rèn)知功能障礙的臨床用藥提供了初步的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

線粒體功能障礙是導(dǎo)致神經(jīng)元功能失衡以及認(rèn)知障礙發(fā)生的重要原因[14]。線粒體一方面可通過氧化磷酸化反應(yīng)產(chǎn)生ATP，為細(xì)胞提供各項(xiàng)生理活動必需的能量，同時(shí)對ROS生成、鈣離子內(nèi)流以及細(xì)胞存活等都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。而在病理情況下，線粒體功能發(fā)生障礙，導(dǎo)致氧化磷酸化過程被破壞，ATP合成受阻，并伴隨著大量ROS的生成及線粒體新陳代謝紊亂，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能障礙。可以說，線粒體正常功能的破壞在TBI后認(rèn)知功能障礙的發(fā)病過程中起著重要的推動作用，但目前TBI后線粒體功能障礙的發(fā)生機(jī)制不清，早期干預(yù)手段依舊缺乏。如何通過促進(jìn)線粒體生物發(fā)生的恢復(fù)進(jìn)而改善認(rèn)知功能障礙是一個很有研究價(jià)值的方向。

Acr是一種強(qiáng)氧化性的α、β型不飽和醛，可由機(jī)體的內(nèi)源性途徑產(chǎn)生。Acr易與多種生物分子反應(yīng)，包括DNA、蛋白質(zhì)和磷脂等，而線粒體也被證明是Acr的一個重要損傷靶器官。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Acr可以損傷心肌細(xì)胞的線粒體功能，破壞氧化磷酸化酶的正常功能，導(dǎo)致線粒體ATP合成障礙及氧化應(yīng)激損傷[13]。同時(shí)前期有研究證實(shí)Acr可誘發(fā)肺細(xì)胞的線粒體mtDNA損傷、導(dǎo)致線粒體自噬異常[15]。我們在本研究中發(fā)現(xiàn)TBI后海馬區(qū)Acr顯著增高，因此我們提出猜想：Acr可能是導(dǎo)致TBI后海馬神經(jīng)元線粒體損傷與認(rèn)知功能障礙的一個重要病理因素。而Hyd作為Acr的高效清除劑，也已在多種疾病模型中被證實(shí)具有良好的清除效果且安全性高，具有一定的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用潛力。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TBI后海馬區(qū)神經(jīng)元線粒體生物發(fā)生失衡，而Acr水平的增高可能是造成線粒體生物發(fā)生失衡的重要原因。通過Hyd治療后線粒體生物發(fā)生得到了明顯的改善，因此提示清除Acr后，線粒體生物發(fā)生功能得到一定恢復(fù)，有助于受損神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)與功能修復(fù)，達(dá)到認(rèn)知功能改善的目的。總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Acr清除劑能減輕TBI后的認(rèn)知功能障礙，為未來相關(guān)臨床治療策略的建立提供新方向。