郎佳琪，趙順鑫，王 丹，李金金，黎海靈，周 濃，趙晶晶*，李雅南

1重慶三峽學院生物與食品工程學院，重慶 404120；2虎林市農業(yè)技術推廣中心，虎林 158100

滇重樓(Parispolyphyllavar.yunnanensis)屬于百合科重樓屬多年生藥用植物，其干燥根莖具有涼肝定驚、消腫止痛、清熱解毒等功效[1]，以其獨特療效和低毒副作用受到了廣泛關注和使用。隨著制藥工業(yè)需求量的逐年增加，造成了野生資源日益枯竭，故人工栽培滇重樓成了實現(xiàn)資源可持續(xù)利用的有效途徑，通過生物技術來改善滇重樓藥用品質已成為國內研究滇重樓規(guī)范化栽培體系的熱點領域，也是實現(xiàn)野生資源有效保護和資源可持續(xù)利用的必由之路[2,3]。

隨著工業(yè)迅速發(fā)展以及化肥、農藥大量施用導致土壤重金屬污染問題日益嚴重，土壤中重金屬只能在環(huán)境中遷移，不能被土壤微生物分解而不斷積累，當重金屬積累量達到一定限度時就會對植物系統(tǒng)產生毒害效應，再通過食物鏈危害人類生命健康[4]。例如，鎘(Cd)元素超標會誘導糖尿病、生殖毒性、骨質疏松癥、腎功能損傷以及脾肝等器官致癌[5]，汞(Hg)元素超標會影響人的中樞神經系統(tǒng)[6]，鉛(Pb)元素對造血系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)等均具有危害作用[6]，故中藥材重金屬殘留問題是確保中藥材“安全、可控、有效”的首要問題之一。叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)作為自然界中分布最廣的植物共生真菌，外源接種AMF可有效地降低宿主植物對重金屬元素的吸收[1,7-9]，如Li等[9]以翅莢木為宿主植物，外源接種AMF能與翅莢木形成良好的共生關系，降低翅莢木內Cu和Pd濃度；Wei等[1]以木香為宿主植物，發(fā)現(xiàn)外源接種摩西球囊霉(Glomusmosseae，Gm)、透明盾巨孢囊霉(Scutellosporapellucida，Spe)和美麗盾巨孢囊霉(Scutellosporacalospora，Sca)三種AMF可以顯著降低木香根部對重金屬元素(Cd、Cu、Hg、Pb和As)的吸收；Li等[10]以花生為宿主植物，外源接種AMF降低了植株地上部分Cd含量，改變了根系的形態(tài)結構來吸附固持Cd?？梢?，AMF可以通過根外菌絲螯合重金屬離子和過濾保護根系等直接作用，以及促進宿主植物對營養(yǎng)元素的吸收改變根際土壤重金屬生物有效性和根際環(huán)境等間接作用來減少宿主植物對重金屬的吸收、轉運和累積[11]，故外源接種AMF可有效地減少中藥材重金屬的殘留，確保了中藥材的安全性和有效性。

目前，對滇重樓重金屬元素的研究主要集中于接種單株AMF[7,8]以及不同產地[11,12]等方面，而關于AMF混合菌劑對滇重樓根際土壤、須根和根莖內重金屬元素的對比研究鮮有報道。故本研究對課題組前期篩選出的12種優(yōu)良單株AMF[12-15]進行混合，對無菌盆栽的滇重樓進行接種共生培養(yǎng)。研究接種不同AMF混合菌劑對滇重樓根際土壤、須根和根莖內重金屬殘留量的影響，以便尋找出能有效降低滇重樓根際土壤、須根和根莖內重金屬殘留量的AMF混合菌劑，為不同AMF混合菌劑在滇重樓生產上的應用提供了理論依據，為滇重樓的菌根化栽培提供了技術支持。

1 材料和方法

1.1 供試叢枝菌根真菌

供試植株為滇重樓(Parispolyphyllavar.yunnanensis)實生苗，購買自云南省大理州農業(yè)科學推廣研究院，經重慶三峽學院的周濃教授鑒定為百合科植物滇重樓。

根據課題組前期的試驗結果[3,15]，按表1方式將12種優(yōu)良單株AMF菌劑進行混合[16,17]，供試AMF購買自美國國際叢枝菌根真菌種質資源保藏中心，經三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室進行菌劑的保存和擴繁，接種菌劑為帶有孢子、菌絲及侵染后根段的栽培基質。

表1 叢枝菌根真菌的混合方式

1.2 實驗設計

供試土壤為未種植過滇重樓的沙壤土，基本理化性質如下：全鉀28.83 g/kg、速效鉀328.64 mg/kg、全氮1.83 g/kg、速效氮10.64 mg/kg、堿解氮為43.50 mg/kg、全磷0.315 g/kg、速效磷104.66 mg/kg、有機質21.2 g/kg、pH值6.87。供試土壤去除碎石、草根等雜物后，用2 mm篩子過篩，與河砂按3∶1體積比混合作為栽培基質，置于1×105 Pa、121 ℃高壓滅菌鍋內滅菌2 h，黑暗條件下保存1 周后裝盆，栽培容器為15 cm×18 cm的白色塑料花盆(用75%乙醇溶液擦拭3遍)，每盆裝土量為16.0 kg，按每千克土施用有機肥1.33 g、鉀肥0.013 g、鈣鎂磷肥0.31 g充分混勻，作為基肥一次性施用。每盆栽種大小基本一致的滇重樓5株，溫室光強設置為280 μmol/(m2·s)，光照時間為每天14 h，隔天澆水至田間持水量70%～80%。

本試驗于2020年在重慶市萬州區(qū)鐵峰山國家森林公園室內進行，采用室溫盆栽方法進行單因素隨機區(qū)組設計，共設置9個混合菌劑處理(S1～S9)和1個對照(S10)，每處理各設置10次重復，每盆接種劑量為15 mL(每1 mL約含60個孢子)，菌劑均勻施在滇重樓根莖處的表土下，按照常規(guī)方式進行管理。

1.3 儀器與試劑

原子吸收分光光度計(TAS-990AFG，源于北京普析通用儀器有限責任公司)；原子熒光光度計(AFS-230E，源于北京科創(chuàng)海光有限公司)；數顯加熱板(C-MAG HP10，源于德國IKA集團)；電熱恒溫真空干燥箱(DZF-6050MBE，源于上海博訊實業(yè)有限公司)；分析天平(AE-240，源于梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；Pb、銅(Cu)、砷(As)、汞(Hg)和鉻(Cr)空心陰極燈源于北京曙光明電子光源儀器有限公司。

重金屬元素標準溶液(1000 μg/mL)：Pb(批號為GSB04-1742-2004)、Cu(批號為GSB04-1725-2004)、As(批號為GSB04-1714-2004)、Hg(批號為GSB04-1729-2004)和Cr(批號為GSB04-1723-2004)源于國家環(huán)境保護總局標準樣品研究所，濃HNO3、氫氟酸和濃HCl均是優(yōu)級純，源于成都金山化學試劑有限公司，水為去離子水。實驗所用玻璃器皿采用20% HNO3溶液浸泡24 h，去離子水沖洗干凈，備用。

1.4 取樣和測定方法

分別在2021年6月(T1)、7月(T2)、8月(T3)和9月(T4)收獲滇重樓植株的須根、新根莖和老根莖，45 ℃條件下烘干，粉碎過40目篩備用；對應的根際土壤自然風干，按分析要求分別粗磨、細磨后過40目篩，備用。采用原子吸收光譜法測定根際土壤和根莖內Pb、Cu、As、Hg和Cr殘留量[18]。

1.5 數據分析

試驗數據的整理采用Excel 2003軟件，數據方差分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(P<0.05)，繪圖采用Origian 9.0軟件進行。

根莖內重金屬元素的富集系數(bioconcentration factor，BCF)按下列公式計算：

2 結果與分析

2.1 叢枝菌根真菌對滇重樓根際土壤內重金屬元素殘留量的影響

外源接種不同AMF混合菌劑對滇重樓根際土壤Pb、Cu、As、Hg和Cr 5種重金屬殘留量均有一定的影響(見圖1)。與對照相比，滇重樓根際土壤重金屬殘留量在不同生長時期變化的差異較大，其中，S4處理對土壤中Pb殘留量的調控效果最佳，S1、S3和S5處理的調控效果次之；S1處理對土壤中Cu殘留量的調控效果最佳，S3和S9處理調控效果次之；S6處理對土壤中As、Hg和Cr殘留量的調控效果最佳，其下降幅度依次為24.81%～75.43%、42.86%～75.54%和16.01%～83.96%，S4處理調控效果次之。

圖1 叢枝菌根真菌對滇重樓根際土壤內重金屬殘留量的影響

從重金屬殘留量來看，Pb和Hg殘留量隨著生長時期延長先升高后降低，最高值出現(xiàn)在T2期；Cu和Cr殘留量隨著生長時期延長而逐漸增加，多數處理的最高值出現(xiàn)在T4期；而As殘留量變化不明顯，維持在1.96～8.68 mg/kg之間。中國土壤元素背景值規(guī)定Pb殘留量為40.60 mg/kg、Cu殘留量為46.30 mg/kg、As殘留量為18.40 mg/kg、Hg殘留量為0.065 mg/kg、Cr殘留量為65.20 mg/kg[19]。除Cu和As外，其余3種元素均存在超過背景值的處理組。這說明AMF混合菌劑對重金屬元素的吸收具有差異性和很強的生物吸附潛力，導致滇重樓根際土壤中的Pb、Hg和Cr元素存在不同程度的累積和富集。

2.2 叢枝菌根真菌對滇重樓須根內重金屬元素殘留量的影響

滇重樓須根中所含的藥用成分與根莖具有相同性，所以進一步開發(fā)利用滇重樓須根資源具有重要的研究價值，滇重樓須根內5種重金屬殘留量高低順序為As>Pb>Hg>Cu>Cr(見表2)，與對照相比，外源接種不同AMF混合菌劑可以不同程度地促進滇重樓須根內上述5種重金屬殘留量的增加，與對照相比，整個生育期內Pb殘留量的平均增長幅度介于88.86%～156.97%之間，Cu殘留量的平均增長幅度介于37.49%～88.97%之間，As殘留量的平均增長幅度介于122.07%～138.79%之間，Hg殘留量的平均增長幅度介于148.25%～169.69%之間，Cr殘留量的平均增長幅度介于30.79%～50.02%之間，方差分析可知，除T1期S2處理和T2期S3處理的Pb、T3期S6和S9處理的Cr外，其余處理與對照間差異均達到了顯著水平(P<0.05)。從重金屬殘留量來看，不同時期接種不同AMF混合菌劑后，滇重樓須根內重金屬殘留量普遍高于對照。其中，T3期S3處理的Pb殘留量最高(0.59 mg/kg)，T1期S4處理的Cu殘留量最高(0.29 mg/kg)，T1期S6處理的As殘留量最高(1.83 mg/kg)，T4期S8處理的Hg殘留量最高(0.17 mg/kg)，T2期S8和S9處理的Cr殘留量最高(均為0.04 mg/kg)。

表2 叢枝菌根真菌對滇重樓須根內重金屬殘留量的影響

2.3 叢枝菌根真菌對滇重樓根莖內重金屬元素殘留量的影響

滇重樓新根莖和老根莖內重金屬殘留量高低順序為Cr>As>Pb>Cu>Hg(見圖2～4)，外源接種不同AMF混合菌劑對新根莖和老根莖內重金屬殘留量均有一定的影響，與對照相比，S6處理對新根莖和老根莖內Pb殘留量的調控效果最佳，其下降幅度分別為7.53%～46.58%和11.95%～75.87%；S1和S6處理對新根莖內Cu殘留量的調控效果最佳，S6和S7處理對老根莖內Cu殘留量的調控效果最佳。其中，S6處理下降幅度分別為33.37%～77.51%和36.05%～68.59%；S4和S8處理對新根莖內As殘留量的調控效果最佳，S3、S5、和S9處理對老根莖內As殘留量的調控效果最佳；S1、S6和S9處理對新根莖內Hg殘留量的調控效果最佳，S5、S6、S7和S8處理對老根莖內Hg殘留量的調控效果最佳，其中，S6處理下降幅度分別為20.99%～45.43%和27.18%～61.89%；S2、S3和S6處理對新根莖內Cr殘留量的調控效果最佳，S3、S4、S5和S6處理對老根莖內Cr殘留量的調控效果最佳，其中，S6處理下降幅度分別為16.10%～42.03%和7.25%～78.69%。

圖2 叢枝菌根真菌對滇重樓新根莖和老根莖內Pb和Cu殘留量的影響

圖3 叢枝菌根真菌對滇重樓新根莖和老根莖內As和Hg殘留量的影響

圖4 叢枝菌根真菌對滇重樓新根莖和老根莖內Cr殘留量的影響

從重金屬殘留量來看，不同時期接種不同AMF混合菌劑后，滇重樓新根莖和老根莖內重金屬殘留量普遍低于對照。其中，T1期和T3期CK的老根莖內As殘留量依次為2.03 mg/kg和3.93 mg/kg，T3期CK以及T4期S1、S2和CK的老根莖內Hg殘留量依次為264.62、223.05、209.63和243.02 μg/kg，根據《中國藥典》和《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》限量標準規(guī)定，上述處理的老根莖內As和Hg重金屬殘留量均不符合限量標準，除T3期S5處理的老根莖Cr殘留量符合限量標準外，其余處理的Cr殘留量均不符合限量標準，這可能與 AMF種間差異以及菌種間協(xié)同作用有關，不同菌種或不同AMF混合菌劑對重金屬的敏感性不同，接種AMF混合菌劑促進了滇重樓對某種重金屬的吸收，但無一致規(guī)律，具體原因有待進一步深入研究。

2.4 叢枝菌根真菌對滇重樓根莖內重金屬富集系數的影響

滇重樓根莖內重金屬富集系數可以反映宿主植物富集土壤重金屬的能力，從表3的結果來看，Cr各處理的BCF均小于0.1，這說明滇重樓對Cr的吸收強烈貧化；Cu前期(T1和T2)各處理的BCF介于0.5～1.5之間，后期(T3和T4)各處理的BCF均小于0.5，這說明滇重樓對Cu的吸收隨著生長時期的延長而逐漸貧化；As和Hg各處理的BCF均大于3.0，這說明滇重樓對As和Hg的吸收強烈富集?？梢?，滇重樓對重金屬元素的吸收具有選擇性，尤其是對As和Hg表現(xiàn)出強烈富集作用，對Cr表現(xiàn)出相對富集作用。

表3 叢枝菌根真菌對滇重樓根莖內重金屬富集系數的影響

2.5 滇重樓根莖土壤中重金屬間相關性分析

滇重樓種植基地土壤中的重金屬元素間存在不同程度的相關性(見表4)，土壤中Pb殘留量與Hg之間呈極顯著正相關(R=0.629)，Cu殘留量與Cr之間呈顯著正相關(R=0.511)，這說明種植基地土壤中以上兩種重金屬元素之間存在相互促進吸收的關系；Cu殘留量與Hg之間呈顯著負相關(R=-0.335)。這說明種植基地土壤中Cu和Hg之間存在相互抑制吸收的關系。

表4 滇重樓根際土壤中重金屬元素間相關分析

2.6 滇重樓根莖中重金屬間相關性分析

重金屬元素在滇重樓生長過程中的積累可能存在協(xié)同或競爭兩種效應，不同生長時期表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律(見表5)，就老根莖而言，Pb與Cu、As和Cr之間呈極顯著正相關，其相關系數依次為0.527、0.753和0.414；Cu與Cr之間呈極顯著正相關，其相關系數為0.455，As與Hg和Cr之間呈極顯著正相關，其相關系數依次為0.487和0.500，Hg與Cr之間呈顯著正相關，其相關系數為0.338，這說明滇重樓老根莖對重金屬元素的吸收具有顯著的協(xié)同作用。就新根莖而言，Pb與Cr之間呈極顯著正相關，其相關系數為0.482，As與Hg之間呈極顯著正相關，其相關系數為0.542，這說明滇重樓新根莖對Pb與Cr、As與Hg的吸收具有顯著的協(xié)同作用；As與Cr之間呈極顯著負相關，其相關系數為-0.484，Hg與Cr之間呈顯著負相關，其相關系數為-0.369，這說明滇重樓新根莖對As與Cr、Hg與Cr的吸收具有顯著的競爭作用。總之，滇重樓老根莖對重金屬元素的吸收作用明顯高于新根莖。

表5 滇重樓根莖中重金屬元素間相關分析

3 討論與結論

3.1 叢枝菌根真菌對滇重樓根際土壤中重金屬殘留量的影響

菌根真菌可以通過雙向養(yǎng)分循環(huán)來促進藥用植物的生長發(fā)育，提高藥用植物的適應性，菌根植物可以將葉片中合成的有機物通過AMF大量地輸送到根系中，同時根際土壤中的礦質元素(重金屬)也可以通過AMF輸入到植物組織中，以此來調控植物組織內礦質元素(重金屬)含量[8,20]，故外源接種AMF是降低中藥材重金屬殘留量的主要微生物修復有效策略之一[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，接種AMF混合菌劑可以不同程度地減少根際土壤中重金屬的殘留量，其中，S4處理對土壤中Pb殘留量的調控效果最佳，S1處理對土壤中Cu殘留量的調控效果最佳，S6處理對土壤中As、Hg和Cr殘留量的調控效果最佳，這說明AMF菌絲體對重金屬的吸附潛力不同，并且不同真菌菌絲體對各金屬離子的吸附能力也不同，其不同原因主要是不同AMF分泌的蛋白質、氨基酸、有機酸等有機物不同，這些分泌的有機物能夠與不同的重金屬離子螯合，進而降低根際土壤中重金屬的生物可利用性或可移動性，從而減輕重金屬的毒害。再者，從重金屬殘留量來看，滇重樓根際土壤中Pb、Hg和Cr的殘留量超過中國土壤元素背景值，這說明AMF混合菌劑對滇重樓根際土壤中重金屬元素的吸收具有差異性和很強的生物吸附潛力，導致菌根化的滇重樓根際土壤中Pb、Hg和Cr元素存在不同程度的累積和富集。

3.2 叢枝菌根真菌對滇重樓須根和根莖中重金屬殘留量的影響

植物對重金屬的積累和忍耐是一個復雜過程，不同植物往往利用不同的適應機制來積累或者排斥重金屬，進而維持自身的生長發(fā)育[11]，而外源接種AMF可以有效地減輕或避免中藥材中重金屬的殘留已是不爭的事實[1,9,10,22]。本研究發(fā)現(xiàn)，外源接種AMF混合菌劑可以不同程度地促進滇重樓須根內重金屬殘留量的增加，因為須根可與AMF首先建立良好的共生關系，形成菌根真菌，致使根外菌絲增加了根部與根際土壤直接的接觸面積，加快了菌絲內聚磷酸鹽與重金屬的結合形成“過濾機制”，促進須根內重金屬殘留量的增加[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，外源接種AMF可以顯著降低滇重樓新根莖和老根莖內重金屬的殘留量，這與Zhang等[2]的研究結果相一致，根莖作為滇重樓的主要藥用部位，其重金屬主要來源于兩個方面，一是來自根部的轉移，二是根莖表面生長的部分須根所吸收的重金屬部分沉積在根莖表皮，但在人工栽培過程中，藥農主要的采收目標是主根，而導致大量的須根被遺留在土壤中；再者，新根莖和老根莖的整體代謝活動較慢，并且AMF可以直接通過螯合作用使重金屬積聚于真菌中，故使滇重樓老根莖和新根莖內重金屬殘留量普遍低于對照。從滇重樓根部重金屬殘留量來看，滇重樓須根內重金屬殘留量順序為As>Pb>Hg>Cu>Cr，滇重樓新根莖和老根莖內重金屬殘留量順序為Cr>As>Pb>Cu>Hg，可見，同一植物不同器官對重金屬的吸收能力不同。參照《中國藥典》和《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》限量標準規(guī)定，本研究中所有處理的老根莖內As和Hg重金屬殘留量均不符合限量標準，除T3期S5處理的老根莖Cr殘留量符合限量標準外，其余處理的Cr殘留量均不符合限量標準，這可能與AMF種間差異以及菌種間協(xié)同作用有關，不同菌種或不同混合菌劑對重金屬的敏感性不同，接種AMF促進了滇重樓對某種重金屬的吸收，但無一致規(guī)律，具體原因有待進一步深入研究。

3.3 叢枝菌根真菌對滇重樓根莖中重金屬富集系數的影響

重金屬富集系數是描述重金屬在生物體內累積趨勢的重要指標，表明了重金屬在植物體內的富集情況。野菊花對Cd的富集作用較強，富集系數為2.72，故野菊花栽培過程中需要注意土壤及環(huán)境中Cd的殘留量，避免野菊花對Cd的過度富集導致藥材中Cd超標[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，滇重樓對As和Hg的BCF均大于3.0，這說明滇重樓對As和Hg的富集作用較強，人工栽培滇重樓過程中根際土壤易出現(xiàn)Hg和Cr累積和富集的情況，致使部分滇重樓根莖中Hg和Cr殘留量出現(xiàn)超標情況，所以在滇重樓中藥材生產質量管理規(guī)范(GAP)基地建設中應嚴格控制其栽培土壤性質，選擇合適的AMF菌株進行混合，這為構建高效優(yōu)質的滇重樓種植體系提供了一條新的技術途徑。

綜上所述，近明球囊霉、沙荒球囊霉、透明盾巨孢囊霉、美麗盾巨孢囊霉、巨大巨孢囊霉和球狀巨孢囊霉6種單株AMF配制成的混合菌劑(S6)對滇重樓根際土壤、須根及根莖內重金屬殘留量的調控效果最佳。而AMF對重金屬的吸附作用往往受諸多因素的影響(如宿主植物的種類、土壤肥力、土壤pH等)，再者不同真菌在菌絲生長、侵染能力及磷運輸效率方面也存在差異，所以在生產實踐中應用AMF時要考慮到這些方面。