馬靈珍，紀(jì)東漢，鞠 康，薛天樂，文 永

1亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院；2安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院亳州中醫(yī)藥研究所；3安徽愛生中藥飲片有限公司，亳州 236800

中藥材為中國傳統(tǒng)中醫(yī)特有藥物，在預(yù)防與治療疾病方面發(fā)揮了重要的作用。中藥材種類繁多、來源廣泛，具有作用的整體性、組成成分的多樣性、作用靶點(diǎn)的復(fù)雜性以及成分間相互作用的特點(diǎn)，中藥的產(chǎn)品質(zhì)量直接影響中醫(yī)臨床療效，所以有效控制中藥的質(zhì)量，是保證中醫(yī)臨床療效的前提。但由于中藥化學(xué)成分含量普遍較低，且部分化學(xué)成分不穩(wěn)定，使得中藥化學(xué)對照品不易制備且價(jià)格昂貴，造成多指標(biāo)的質(zhì)控模式難以推廣。中藥材質(zhì)量評價(jià)模式多基于傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)、多指標(biāo)成分、指紋圖譜及譜效關(guān)系等評價(jià)模式來對其質(zhì)量進(jìn)行綜合評價(jià)。但上述評價(jià)方法多存在主觀因素影響、實(shí)驗(yàn)繁瑣復(fù)雜及重現(xiàn)性不好等缺點(diǎn)，目前多指標(biāo)綜合評價(jià)模式仍是中藥質(zhì)量評價(jià)的主要研究方向。一測多評(quantitative analysis of multicomponents by single-marker，QAMS)的多指標(biāo)質(zhì)量控制方法是利用一種易得廉價(jià)的內(nèi)參比物質(zhì)對照品，實(shí)現(xiàn)對多種成分的同時(shí)測定，最終達(dá)到控制中藥整體質(zhì)量的目的?；瘜W(xué)計(jì)量學(xué)(chemometrics)作為一種近代新興的分析實(shí)驗(yàn)方法，其重要特征為將多變量方法引入到化學(xué)研究中，計(jì)算出研究對象的信息，以及在對大量樣本進(jìn)行處理時(shí)可快速、全面地鑒別歸類。優(yōu)劣解距離法(TOPSIS)是一種多指標(biāo)的決策分析方法，目前已被廣泛用于多種中藥材的質(zhì)量評價(jià)中。該方法可客觀地對各指標(biāo)進(jìn)行權(quán)重賦值，有效避免人為主觀因素對中藥材內(nèi)在質(zhì)量評價(jià)的影響。

車前子為車前科植物車前PlantagoasiaticaL.或平車前PlantagodepressaWilld.的干燥成熟種子，具有清熱利尿通淋、滲濕止瀉、明目、祛痰之功效[1]。車前子應(yīng)用廣泛，且藥源豐富，具有廣闊的開發(fā)利用前景。鹽車前子為其炮制品，是我國傳統(tǒng)的常用中藥，應(yīng)用歷史悠久，療效確切。車前子含有多種化學(xué)成分，主要包括環(huán)烯醚萜類、苯乙醇苷類、黃酮類、生物堿類、三萜類以及甾醇類等化合物[2,3]。但車前子屬于多基原藥材，其種質(zhì)資源遺傳多樣性的地理差異較為明顯，野生種與栽培種基因型差異較大，各成分含量差異相應(yīng)較大，成分不同，療效不同，因此，建立一個(gè)科學(xué)、便捷、合理的質(zhì)量評價(jià)方法，對鹽車前子的質(zhì)量進(jìn)行全面準(zhǔn)確地評價(jià)并指導(dǎo)車前子資源的合理利用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。Li等[4]采用AHP-CRITIC混合加權(quán)法和響應(yīng)面法對鹽車前子炮制工藝進(jìn)行了優(yōu)化，Gu等[5]采用UPLC-Q-TOF/MS法對車前子生品和鹽炙品中京尼平苷酸、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷進(jìn)行了定量控制研究，Li等[6]采用藥理學(xué)聯(lián)合代謝組學(xué)方法，對比考察了生車前子和鹽車前子對鹽水負(fù)荷模型大鼠的利尿作用并明其作用機(jī)制，目前研究中對鹽車前子定量控制成分較少，也未檢索到對其所含成分進(jìn)行一測多評法研究，以及采用化學(xué)計(jì)量學(xué)聯(lián)合熵權(quán)優(yōu)劣解距離法綜合質(zhì)量評價(jià)的文獻(xiàn)報(bào)道，本研究收集江西、河南、安徽、山東和廣西等5個(gè)省共18個(gè)代表性產(chǎn)地的車前子藥材，按2020年版中國藥典一部車前子項(xiàng)下鹽車前子炮制要求以及四部鹽水炙法對車前子進(jìn)行同方法炮制，采用HPLC-QAMS法測定鹽車前子中10種成分，通過化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合熵權(quán)TOPSIS法對不同產(chǎn)地來源車前子鹽制品進(jìn)行綜合質(zhì)量評價(jià)。以期為鹽車前子的整體質(zhì)量控制提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為車前子資源合理開發(fā)與利用提供參考。

1 材料

1.1 試藥

對照品桃葉珊瑚苷(批號111761-202102，含量98.4%)、京尼平苷酸(批號111828-201805，含量98.1%)、大車前苷(批號11914-202105，含量96.0%)、毛蕊花糖苷(批號111530-201914，含量95.2%)、槲皮素(批號100081-201610，含量99.8%)、山柰酚(批號110861-202013，含量93.2%)、木犀草素(批號111520-202107，含量96.3%)和芹菜素(批號111901-202004，含量99.4%)源于中國食品藥品檢定研究院；對照品10-羥基大車前草苷(批號327-97-9，含量97.0%)源于上海純優(yōu)生物科技有限公司；異毛蕊花糖苷(批號PRF9010243，含量97.0%)源于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；乙腈和磷酸為色譜純級別，其余試劑為分析純；車前子藥材來源于車前PlantagoasiaticaL.的干燥種子，信息見表1。

表1 車前子藥材信息

1.2 儀器

高效液相色譜儀(Shimadzu LC-20A型，日本島津公司)；高效液相色譜儀(Waters e2695型，Waters公司)；色譜柱Discovery C18、Waters XBridge C18和Durashell C18，規(guī)格均為5 μm，250 mm×4.6 mm；電子分析天平(XSE205DU型，Mettler Toledo)。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品溶液的制備

取桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、10-羥基大車前草苷、大車前苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素對照品適量，用70%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.374、3.950、0.092、0.974、2.710、0.632、0.216、0.438、0.076和3.190 mg/mL的混合對照品貯備液，再將貯備液用70%甲醇稀釋20倍得混合對照品溶液(上述10種對照品質(zhì)量濃度分別為0.018 7、0.197 5、0.004 6、0.048 7、0.135 5、0.031 6、0.010 8、0.021 9、0.003 8和0.159 5 mg/mL)。

2.2 供試品溶液的制備

取凈車前子按中國藥典2020年版一部車前子項(xiàng)下方法進(jìn)行炮制，得鹽車前子；取鹽車前子粉末約0.6 g，精密稱定，精密加70%甲醇25 mL，稱重，加熱回流60 min，放冷，70%甲醇補(bǔ)重，搖勻，過濾，即得。

2.3 色譜條件及專屬性試驗(yàn)

Discovery C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)色譜柱，柱溫30 ℃；檢測波長分別為210 nm(0～22 min檢測桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸和10-羥基大車前草苷)[7-9]、330 nm(22～35 min檢測大車前苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷)[10-15]和360 nm(35～65 min檢測槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素)[16,17]；流動相選用0.1%磷酸(A)-乙腈(B)，流速維持1.0 mL/min進(jìn)行梯度洗脫(0～12 min，21.0%B；12～22 min，21.0%→35.0%B；22～35 min，35.0%→47.0%B；35～54 min，47.0%→75.0%B；54～65 min，75.0%→21.0%B)，進(jìn)樣量10 μL。在上述色譜條件下進(jìn)樣混合對照品溶液及供試品溶液，記錄色譜圖(見圖1)。圖譜顯示鹽車前子供試品溶液中10種成分與相鄰色譜峰分離良好(分離度均≥1.5)。

圖1 混合對照品(A)和供試品(B)的HPLC色譜圖

2.4 多指標(biāo)成分定量檢測

2.4.1 線性關(guān)系考察

取“2.1”項(xiàng)下混合對照品貯備液，精密吸取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分別用70%甲醇稀釋200、100、40、20、10和4倍，搖勻制得系列線性工作溶液，按“2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖，以桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、10-羥基大車前草苷、大車前苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X，μg/mL)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

表2 鹽車前子中各成分的線性關(guān)系

2.4.2 精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性試驗(yàn)

取鹽車前子(編號：S1)一份供試品溶液，在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、10-羥基大車前草苷、大車前苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素色譜峰峰面積，得峰面積的RSD值依次為1.03%、0.56%、1.18%、0.95%、0.71%、1.02%、1.15%、1.07%、1.34%和0.60%，表明精密度良好。取一份鹽車前子(編號：S1)供試品溶液，于制備后0、2、4、6、10、16和24 h進(jìn)樣，記錄桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、10-羥基大車前草苷、大車前苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素色譜峰峰面積，得峰面積的RSD值依次為1.04%、0.53%、1.16%、1.01%、0.74%、0.99%、1.17%、1.05%、1.31%和0.62%，表明鹽車前子供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。取鹽車前子(編號：S1)適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備鹽車前子供試品溶液6份，在上述色譜條件下檢測分析，記錄色譜峰峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、10-羥基大車前草苷、大車前苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素的含量，得含量的RSD值依次為1.27%、0.93%、1.74%、1.58%、1.09%、1.21%、1.69%、1.42%、1.89%和1.08%，表明重復(fù)性良好。

2.4.3 加樣回收率試驗(yàn)

取鹽車前子(編號：S1)細(xì)粉9份，每份精密稱定0.3 g，分別加入混合對照品溶液(桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、10-羥基大車前草苷、大車前苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素對照品質(zhì)量濃度分別為0.259、2.748、0.067、0.651、1.865、0.428、0.171、0.332、0.057和2.109 mg/mL)0.8、1.0、1.2 mL(各平行3份)，再按“2.2”項(xiàng)方法制得加樣供試品溶液，在上述色譜條件下檢測，得10種成分的平均加樣回收率為98.61%、100.10%、96.89%、99.23%、100.04%、98.89%、97.69%、97.88%、96.96%和99.87%；RSD分別為1.31%、0.59%、1.27%、0.98%、0.74%、1.39%、1.46%、1.11%、1.53%和0.69%。

2.5 HPLC-QAMS質(zhì)量評價(jià)模式的建立

2.5.1 相對校正因子(f)的計(jì)算

以毛蕊花糖苷為內(nèi)參比物質(zhì)，進(jìn)樣“2.4.1”項(xiàng)6個(gè)混合對照品溶液，按照公式fi/s=fi/fs=(ρi/Ai)/(ρs/As)=(ρi×As)/(ρs×Ai)計(jì)算f。式中f、ρ、A、i、s依次代表相對校正因子、質(zhì)量濃度、峰面積、內(nèi)參比物質(zhì)和其他待測成分，結(jié)果見表3。

表3 鹽車前子中各成分的f

2.5.2 相對校正因子(f)耐用性考察

分別考察了儀器及色譜柱、流速和柱溫的改變對f的影響，選用液相色譜儀(Shimadzu LC-20A型和Waters e2695型)和色譜柱(Discovery C18柱、Waters XBridge C18柱和Durashell C18柱)，流速：1.0±0.2 mL/min，柱溫：30±5 ℃等條件，取混合對照品溶液依法進(jìn)樣檢測，結(jié)果儀器與色譜柱對所建立的f無影響(見表4)、流速對所建立的f無影響(見表5)、柱溫對所建立的f無影響(見表6)。

表4 不同儀器及色譜柱對f的影響

表5 不同流速對f的影響

表6 不同柱溫對f的影響

2.5.3 色譜峰定位

在上述色譜條件下，取“2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液，依法進(jìn)樣檢測，記錄色譜峰保留時(shí)間，采用相對保留時(shí)間值法對待測成分色譜峰進(jìn)行定位，考察液相色譜儀(Shimadzu LC-20A型和Waters e2695型)和色譜柱(Discovery C18柱、Waters XBridge C18柱和Durashell C18柱)對相對保留時(shí)間值(t)的影響，結(jié)果采用相對保留時(shí)間值法可以對目標(biāo)化合物色譜峰進(jìn)行準(zhǔn)確定位(見表7)。

表7 儀器及色譜柱對t的影響

2.6 含量測定

取18批鹽車前子(S1～S18)，依法制備鹽車前子供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，分別運(yùn)用ESM和HPLC-QAMS法計(jì)算鹽車前子中10種成分的含量(見表8)。結(jié)果兩種方法無顯著性差異(P>0.05)，表明HPLC-QAMS法可用于鹽車前子中10種成分的含量測定。

表8 鹽車前子中10種成分含量測定結(jié)果(n=3)

2.7 聚類分析(CA)

聚類分析(cluster analysis，CA)指將物理或抽象對象的集合分組為由類似的對象組成的多個(gè)類的分析過程，是通過數(shù)據(jù)建模簡化數(shù)據(jù)的一種方法。將表8中18批鹽車前子的10種成分QAMS法測定結(jié)果導(dǎo)入SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用平均聯(lián)接(組間)法，利用Euclidean距離為樣品的測度進(jìn)行聚類分析，得聚類樹狀圖(見圖2)。結(jié)果顯示，當(dāng)間距為15時(shí)，18批鹽車前子樣品聚為3類，S16、S18、S17、S14、S15和S13共6批樣品聚為一類，S11、S12、S9、S10共4批樣品聚為一類，S7、S8、S1、S2、S3、S4、S5和S6共8批樣品聚為一類。

圖2 18批樣品聚類樹狀圖

2.8 主成分分析(PCA)

主成分分析(principal component analysis，PCA)是將多個(gè)變量通過線性變換以選出較少個(gè)數(shù)重要變量的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法。是從原始變量中導(dǎo)出少數(shù)幾個(gè)主成分，使它們盡可能多地保留原始變量的信息，且彼此間互不相關(guān)。將表8中QAMS法測定結(jié)果導(dǎo)入SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件采用降維的方式對主成分進(jìn)行提取，得各主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率(見表9)及成分矩陣表(見表10)。由表9可知前2個(gè)主成分特征值大于1，即6.778和1.737，對方差的貢獻(xiàn)率分別為67.780%和17.369%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為85.149%，大于85%，表明選取前2個(gè)主成分即可代表鹽車前子85.149%的信息量。表10主成分矩陣可以看出第一主成分的信息來自京尼平苷酸、10-羥基大車前草苷、毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素等成分的綜合，第二主成分的信息來自桃葉珊瑚苷、大車前苷和異毛蕊花糖苷的信息。同時(shí)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SIMCA 14.1建立PCA模型，18批鹽車前子樣品PCA得分圖見圖3，共提取出2個(gè)主成分R2X為0.851，大于0.5，所建立的模型穩(wěn)定性較高。從圖3可以看出，S1～S8、S9～S12以及S13～S18分別呈現(xiàn)一定關(guān)聯(lián)性。

圖3 PCA得分圖

表9 鹽車前子中主成分方差分析

表10 鹽車前子中10種成分的成分矩陣表

2.9 正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)

正交偏最小二乘法-判別分析通過對數(shù)據(jù)的分析，能夠查找出引起產(chǎn)品質(zhì)量差異的特征成分，將表8中QAMS法含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1統(tǒng)計(jì)軟件，運(yùn)行OPLS-DA程序得圖4，結(jié)果累積解釋能力參數(shù)(R2X、R2Y)分別為0.972和0.886，預(yù)測能力參數(shù)Q2為0.741，兩者高于0.5(50%)時(shí)所建立的模型穩(wěn)定可靠、預(yù)測能力強(qiáng)。由圖4可以看出18批鹽車前子的含量數(shù)據(jù)點(diǎn)均落在95%置信區(qū)間內(nèi)，根據(jù)分布可分為3類，與聚類分析和主成分分析結(jié)果一致。

圖4 18批鹽車前子樣品的OPLS-DA模型得分圖

對所建立的OPLS-DA模型中2個(gè)主成分進(jìn)行200次置換檢驗(yàn)(見圖5)，結(jié)果顯示R2擬合直線Y軸截距為0.275，小于0.3，表明所建立的OPLS-DA模型結(jié)果可靠；Q2擬合直線Y軸截距為-0.694(為負(fù)數(shù))，表明所構(gòu)建的OPLS-DA模型不存在過度擬合，預(yù)測能力好，可有效判別分析18批鹽車前子的質(zhì)量差異。根據(jù)變量重要性投影(variable importance in projection，VIP)值篩選影響鹽車前子化學(xué)成分差異的標(biāo)志性成分(見圖6)，結(jié)果VIP>1的有4個(gè)成分，即成分5(毛蕊花糖苷，VIP=1.502)、成分2(京尼平苷酸，VIP=1.441)、成分10(芹菜素，VIP=1.329)、成分4(大車前苷，VIP=1.229)對鹽車前子樣品質(zhì)量的影響較大，是影響鹽車前子產(chǎn)品質(zhì)量的主要潛在標(biāo)志物。

圖5 OPLS-DA置換檢測結(jié)果圖

圖6 18批鹽車前子樣品的VIP圖

2.10 熵權(quán)TOPSIS(EW-TOPSIS)法分析

2.10.1 歸一化處理

表11 各指標(biāo)歸一化處理結(jié)果

2.10.2 加權(quán)決策矩陣的構(gòu)建

表12 加權(quán)矩陣

2.10.3 最優(yōu)與最劣方案的確定

根據(jù)加權(quán)決策矩陣得到最優(yōu)方案 Z+=max(Z1，Z2…...Zm)和最劣方案 Z-=min(Z1，Z2…...Zm)得Z+=max(0.779 0，1.441 0，0.337 0，1.229 0，1.502 0，0.863 0，0.440 0，0.750 0，0.412 0，1.329 0)，Z-=min(0，0，0，0，0，0，0，0，0，0)。

2.10.4 貼近度的計(jì)算及評價(jià)

表13 鹽車前子藥材質(zhì)量評價(jià)排序

排名前6位分別是江西新干、江西吉水、江西樟樹、江西瑞昌、江西宜春和江西泰和車前子所得鹽制品，結(jié)果表明江西產(chǎn)地所得鹽車前子整體質(zhì)量較好，其次為河南、安徽、山東和廣西產(chǎn)地所得鹽車前子。

3 討論與結(jié)論

3.1 供試品溶液制備

本試驗(yàn)在制備供試品溶液時(shí)，首先篩選了提取溶劑：60%甲醇[2-4,7]、70%甲醇[9,14]、70%乙醇[17]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%甲醇提取時(shí)，所測10種成分的提取率較高。接著對提取方式及時(shí)間進(jìn)行了考察，采用超聲和加熱回流，時(shí)間分別為40、50、60、70 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%甲醇加熱回流提取60 min時(shí)，10種成分的提取率最高，雜質(zhì)干擾最少。綜合考慮，最終確定以70%甲醇回流提取60 min為鹽車前子供試品最佳提取方式。

3.2 QAMS法與化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)果評價(jià)

為客觀評價(jià)車前子藥材質(zhì)量，選取全國5個(gè)省不同產(chǎn)地的車前子18批，統(tǒng)一按照現(xiàn)行中國藥典中鹽車前子的方法進(jìn)行炮制，采用QAMS法和ESM法對18批鹽車前子中的10種成分進(jìn)行定量分析檢測，同時(shí)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果18批不同產(chǎn)地鹽車前子中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、10-羥基大車前草苷、大車前苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素10 種化學(xué)成分含量存在一定的波動，但同一產(chǎn)地的車前子質(zhì)量相對穩(wěn)定。EW-TOPSIS結(jié)果顯示，江西產(chǎn)地所得鹽車前子整體質(zhì)量較好，江西省新干縣所得鹽車前子最優(yōu)解歐氏貼近度均值高于其余幾個(gè)產(chǎn)地樣品，提示江西省新干縣產(chǎn)車前子所得鹽制品整體質(zhì)量較佳。

綜上，本試驗(yàn)采用HPLC-QAMS法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)及熵權(quán)TOPSIS法對不同產(chǎn)地所得鹽車前子進(jìn)行了綜合質(zhì)量評價(jià)，建立了鹽車前子10種指標(biāo)成分定量質(zhì)控模式，較已有文獻(xiàn)報(bào)道，增加了定量測定成分?jǐn)?shù)量，同時(shí)HPLC-QAMS法有效降低了檢驗(yàn)成本，有利于多指標(biāo)成分定量控制模式的普及應(yīng)用，并建立了化學(xué)計(jì)量學(xué)聯(lián)合熵權(quán)優(yōu)劣解距離法綜合質(zhì)量評價(jià)方法，所建立的方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可行，從多方面、多角度控制該藥材質(zhì)量，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步探討不同產(chǎn)地所得鹽車前子化學(xué)成分引起的藥效差異及藥材資源的合理利用提供了數(shù)據(jù)支撐。同時(shí)中藥材基原對其產(chǎn)品質(zhì)量也會產(chǎn)生一定的影響，本研究選取同一基原車前子所得鹽車前子進(jìn)行多指標(biāo)成分定量控制以及化學(xué)計(jì)量學(xué)綜合評價(jià)，后續(xù)將收集不同基原產(chǎn)品開展進(jìn)一步研究。