江張勝,趙晨玲,董 婷

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,中國安徽 合肥 230038;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,中國安徽 合肥 230031)

細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicle,EV)是指包括外泌體(exosome)、微囊泡(microvesicle)和凋亡小體(apoptotic body)在內(nèi)的一系列囊泡。其中,外泌體是指多泡體(multivesicular body,MVB)與細(xì)胞膜融合時(shí)釋放到細(xì)胞外空間的大小為40～100 nm的腔內(nèi)囊泡,其不僅可以由包括神經(jīng)元細(xì)胞在內(nèi)的不同類型細(xì)胞從晚期內(nèi)體細(xì)胞區(qū)室分泌,還可從諸如腦脊液、血漿和尿液等的條件細(xì)胞培養(yǎng)基或體液中分離。外泌體作為疾病診斷和治療的生物標(biāo)志物及細(xì)胞間通信的重要介質(zhì),可在膜細(xì)胞與胞漿蛋白質(zhì)、脂質(zhì)與RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。

目前,中風(fēng)(stroke)、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)和帕金森病(Parkinson’s disease,PD)等神經(jīng)疾病,被認(rèn)為是危害較大的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,已成為世界性衛(wèi)生保健難題[2～3]。迄今為止,上述神經(jīng)疾病尚不能完全治愈,僅可通過藥物改善其癥狀。近年來,神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell,NSC)在神經(jīng)疾病損傷修復(fù)中的作用逐漸得到了業(yè)內(nèi)人士的普遍認(rèn)可。NSC不僅可參與神經(jīng)發(fā)生、突觸發(fā)生、少樹突發(fā)生、軸突連接和髓鞘形成等過程,而且在灰質(zhì)和白質(zhì)損害方面也有作用[4]。盡管NSC治療神經(jīng)疾病的機(jī)制尚不清楚,但有研究表明,其可能與細(xì)胞外環(huán)境中的分泌因子通過旁分泌功能實(shí)現(xiàn)的遠(yuǎn)距離細(xì)胞間通信有關(guān)[5]。NSC和受損器官之間的細(xì)胞間通信被認(rèn)為是通過釋放自由分子來調(diào)控的,這些分子通過與受體結(jié)合傳遞信號[6]。雖然當(dāng)前外泌體發(fā)揮作用的機(jī)制仍不清楚,但不可否認(rèn)的是其為細(xì)胞間通信開辟了一個(gè)新的研究前沿。眾多研究表明,外泌體可以作為反映神經(jīng)疾病病理進(jìn)展和促進(jìn)康復(fù)的生物標(biāo)志物,其可通過腦細(xì)胞的合成與釋放,透過血腦屏障,流入到外周血或腦脊液中[7～8]。由于NSC來源的外泌體可為神經(jīng)疾病的診斷和治療提供新的途徑,故本文重點(diǎn)介紹了NSC來源的外泌體的性質(zhì)和特征,以及它們作為神經(jīng)疾病診斷與治療的生物標(biāo)志物在臨床前模型中的作用(圖1)。

圖1 NSC分泌的外泌體的結(jié)構(gòu)、功能和在神經(jīng)疾病治療中的應(yīng)用(根據(jù)參考文獻(xiàn)[47～49]、[52～53]修改)(A)NSC分泌的外泌體;(B)外泌體在神經(jīng)疾病中的治療作用;(C)外泌體的結(jié)構(gòu)和組成成分;(D)外泌體在神經(jīng)疾病治療中的應(yīng)用。Fig.1 Structure,function and application of exosomes secreted by NSCs in the treatment of neurological diseases(modified according to References[47～49]and[52～53])(A)Exosomes secreted by NSCs;(B)Function of exosomes in the treatment of neurological diseases;(C)The structure and composition of exosomes;(D)Application of exosomes secreted by NSCs in the treatment of neurological diseases.

1 外泌體

1.1 外泌體的生物學(xué)合成及基本特性

外泌體生物發(fā)生的第一步是質(zhì)膜向內(nèi)出芽,形成一個(gè)膜結(jié)合的液泡。該液泡在成熟過程中經(jīng)歷幾個(gè)變化,形成一個(gè)晚期核內(nèi)體,晚期核內(nèi)體的限制膜隨后向內(nèi)芽出,并夾斷形成被膜包裹的囊泡,稱為管腔小泡(intraluminal vesicle,ILV),即MVB。最后,部分MVB與細(xì)胞膜融合釋放到胞外,形成大小均一的囊泡,即外泌體[9]。

多個(gè)研究表明,不同來源的外泌體根據(jù)其生物發(fā)生釋放特定的脂類(膽固醇、磷脂酰絲氨酸、磷酸甘油酯和脂質(zhì)等[10])、核酸(DNA、編碼RNA、非編碼RNA和microRNA[11])和蛋白質(zhì)(CD9、CD80、CD86和Tsg101等[12])。目前,檢測外泌體的主要方法包含蛋白質(zhì)免疫印跡、透射電鏡、免疫熒光染色和納米粒子追蹤分析等技術(shù)。

1.2 外泌體的分離和純化

自30多年前發(fā)現(xiàn)外泌體以來,人們已經(jīng)清楚地認(rèn)識到外泌體對生理和病理的許多方面都有作用,為了提高其應(yīng)用效率,外泌體的高效分離和純化是十分必要的。目前,高效分離和純化外泌體的主要方法有:1)差速離心法。這也是最常見的一種方法,其操作簡單,產(chǎn)量適中。大容量樣本根據(jù)顆粒的大小和密度,采用低速離心、高速離心交替進(jìn)行的方法,分離得到大小相近的囊泡,但回收率不穩(wěn)定,且重復(fù)離心可能會(huì)損壞囊泡膜結(jié)構(gòu)[13～14];2)抗體親和捕獲法。該方法利用抗原、抗體之間高度的特異性結(jié)合對外泌體進(jìn)行分離,在獲得高純度外泌體的同時(shí),可分離不同亞型的外泌體,但外泌體表面抗原可能因阻斷和覆蓋而不能被識別[15];3)微控流芯片法。該方法利用外泌體特異性構(gòu)建三維微環(huán)境,進(jìn)而從復(fù)雜的細(xì)胞基質(zhì)分離出外泌體。雖然其獲得的外泌體純度高,但臨床樣品缺乏標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)模化測試與方法驗(yàn)證,同時(shí)樣本容量較低[16]。

2 NSC及其分泌的外泌體

2.1 NSC的特征及功能

NSC是神經(jīng)系統(tǒng)中最不穩(wěn)定的細(xì)胞之一,具有自我更新的功能特性,可產(chǎn)生3種基本的神經(jīng)外胚層譜系,在整個(gè)生命過程中以發(fā)育階段的方式產(chǎn)生神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。研究證實(shí),NSC能夠促進(jìn)神經(jīng)元產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)生長因子等[17～19],這些因子可減少宿主內(nèi)源性神經(jīng)元的細(xì)胞死亡,促進(jìn)軸突/樹突連接、神經(jīng)營養(yǎng)和炎癥調(diào)節(jié)、細(xì)胞替代和神經(jīng)可塑性修復(fù),增強(qiáng)神經(jīng)系統(tǒng)再生的能力。除了替代失去的神經(jīng)元,NSC還可能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)劑的功能,并且NSC移植作為一種潛在的神經(jīng)退行性疾病的治療方法已被廣泛探索[20]。但是,NSC治療也可能帶來一些安全風(fēng)險(xiǎn),主要包括畸胎瘤形成、異常細(xì)胞生長、免疫排斥和炎癥,以及不希望的細(xì)胞分化表型,這些都限制了NSC在臨床上的應(yīng)用[20]。因此,NSC分泌的外泌體在神經(jīng)疾病中的診斷和治療受到了極大的關(guān)注。

2.2 NSC分泌的外泌體

研究表明,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,NSC分泌的外泌體參與神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞之間廣泛的相互作用[21]。此外,NSC分泌的外泌體可將神經(jīng)元中的活性物質(zhì)轉(zhuǎn)移到腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞中,這可能會(huì)調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能,對突觸活性、神經(jīng)血管完整性的維持和髓鞘形成等方面產(chǎn)生影響。例如:攜帶miR-124a的NSC外泌體進(jìn)入星形膠質(zhì)細(xì)胞與興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-2/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1的表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)[22];NSC外泌體可通過轉(zhuǎn)移miR-132到血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)控腦血管的完整性,導(dǎo)致黏附連接蛋白Cdh5的表達(dá)上調(diào)[23]。

在某些病理環(huán)境中,外泌體被認(rèn)為是疾病的介質(zhì),這種現(xiàn)象在多種神經(jīng)疾病中都有存在[24]。此外,NSC分泌的外泌體已被報(bào)道攜帶特定顆粒從其來源的細(xì)胞到其他細(xì)胞,導(dǎo)致大腦病理改變的增加,這包括AD中的β-淀粉樣蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)和tau蛋白、海綿狀腦病中的朊蛋白、PD中的α-突觸核蛋白和富含亮氨酸的重復(fù)激酶-2、肌萎縮側(cè)索硬化中的超氧化物歧化酶-1[25]。另一方面,NSC分泌的外泌體也被證明具有神經(jīng)保護(hù)作用,因?yàn)樗鼈兪侵車窠?jīng)再生和神經(jīng)元損傷修復(fù)的一部分[26]。Alvarez-Erviti等[27]研究表明,NSC分泌的外泌體表面攜帶的活性物質(zhì)(如小的RNA)可以作為神經(jīng)疾病診斷的納米信號。

同時(shí),NSC分泌的外泌體可以作為神經(jīng)疾病藥物治療的載體[28]。與NSC本身相比,使用NSC分泌的外泌體作為藥物載體有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先,通過鼻內(nèi)給藥,大量的外泌體可靶向大腦的不同區(qū)域[29];其次,與細(xì)胞治療不同,外泌體在給藥后發(fā)生腫瘤或惡性轉(zhuǎn)化的可能性幾乎為零,因?yàn)樗鼈儾皇怯泻思?xì)胞,不能復(fù)制,在釋放載物后迅速分解[30];最后,靜脈或鼻內(nèi)給藥不太可能導(dǎo)致血栓形成,因?yàn)殪o脈給藥能夠穿過血腦屏障并通過胞吞作用穿過內(nèi)皮細(xì)胞形成小泡。因此,提供無細(xì)胞療法的外泌體可以改變?nèi)藗兛创幬锏姆绞?可以在沒有顯著副作用的情況下拯救許多生命。

3 NSC分泌的外泌體在神經(jīng)疾病中的應(yīng)用

3.1 外泌體作為診斷的標(biāo)志物

神經(jīng)疾病的監(jiān)測、診斷及治療,需要一個(gè)準(zhǔn)確、高效且容易檢測的標(biāo)志物。外泌體能成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的生物標(biāo)志物主要有以下幾個(gè)原因。第一,外泌體可以比較容易地通過血腦屏障,特異的中樞神經(jīng)系統(tǒng)來源的外泌體和外周外泌體均可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物[27,31];第二,外泌體中的核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)在疾病進(jìn)展過程中發(fā)生改變;第三,外泌體可以從尿液、血液和唾液等容易獲取的生物液體中無創(chuàng)分離出來,可用于疾病的早期診斷,這在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中特別重要;第四,外泌體內(nèi)容物被保護(hù)在膜狀結(jié)構(gòu)中,這比傳統(tǒng)標(biāo)本更有優(yōu)勢,因?yàn)闈撛诘纳飿?biāo)志物被保護(hù)起來不容易被降解;第五,外泌體高度穩(wěn)定,這使應(yīng)用于臨床分析的樣品可以長期保存;第六,外泌體可以被濃縮,從而顯著提高檢測靈敏度。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的微環(huán)境中,外泌體不僅可以介導(dǎo)大腦功能和神經(jīng)保護(hù),而且也涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制[27,32]。Guo等[33]通過純化PD患者腦脊液中的外泌體,證實(shí)外泌體中存在能夠誘導(dǎo)神經(jīng)元中α-突觸核蛋白聚集的α-突觸核蛋白寡聚體。Shi等[34]觀察到,PD患者血漿外泌體中的α-突觸核蛋白濃度與健康對照組相比會(huì)有所增加。因此,人們通過檢測外泌體中的α-突觸核蛋白在一定程度上可判斷PD患者的病情。另外,Fiandaca等[35]報(bào)道,在AD患者血源性外泌體中檢測到磷酸化tau蛋白和Aβ的增加。Jia等[36]驗(yàn)證了腦脊液與血源性外泌體生物標(biāo)志物的一致性,證實(shí)血源性外泌體與腦脊液中的Aβ42和磷酸化tau蛋白具有相同的AD診斷能力。因此,人們可以通過檢測外泌體中Aβ的表達(dá)水平來監(jiān)測AD患者的發(fā)病情況。

3.2 外泌體治療神經(jīng)疾病的潛力

3.2.1 外泌體在中風(fēng)治療中的應(yīng)用

中風(fēng)是導(dǎo)致死亡和長期殘疾的主要原因之一。到目前為止,臨床唯一批準(zhǔn)治療腦卒中的藥物是組織型纖溶酶原激活劑。然而,這種藥物僅適用于及時(shí)住院治療的一小部分患者[37]。此外,組織型纖溶酶原激活劑的使用可能會(huì)增加一些患者發(fā)生出血性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)。因此,非侵入性的、有希望修復(fù)受中風(fēng)影響的大腦的替代療法是必需的。從這個(gè)角度出發(fā),少數(shù)研究分析NSC分泌的外泌體在腦卒中模型中的療效具有重要意義。生物標(biāo)志物對于預(yù)測中風(fēng)的嚴(yán)重程度和預(yù)后(包括可能形成的出血和其他并發(fā)癥)非常有價(jià)值。

NSC已知在各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的組織再生和修復(fù)中有效,其可通過分泌外泌體發(fā)揮抗炎和神經(jīng)營養(yǎng)作用[38～39]。Webb等[40]的研究表明,在血栓栓塞性中風(fēng)后靜脈注射NSC來源的外泌體可以改善中年小鼠的細(xì)胞與組織功能。NSC外泌體創(chuàng)造了小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化的有利環(huán)境,這可能與其促進(jìn)碎片清除和減少慢性炎癥有關(guān),由于中風(fēng)是通過局部神經(jīng)免疫反應(yīng)打開血腦屏障,從而導(dǎo)致慢性神經(jīng)變性,故在中風(fēng)后接受外泌體的動(dòng)物記憶會(huì)有所改善[41]。隨后,同一組研究人員在豬腦卒中模型中研究了NSC分泌的外泌體的療效[41],他們通過永久性大腦中動(dòng)脈閉塞誘導(dǎo)缺血性卒中,并在卒中后2 h、14 h和24 h靜脈給予外泌體,發(fā)現(xiàn)受損組織在功能水平上有顯著改善,同時(shí)給予的外泌體能夠消除缺血性病變及顱內(nèi)出血,減少腦損傷體積和腦腫脹,維持了腦白質(zhì)的完整性。總的來說,中風(fēng)后使用NSC來源的外泌體可以給患者提供顯著的神經(jīng)與運(yùn)動(dòng)功能保護(hù)。

3.2.2 外泌體在AD治療中的應(yīng)用

AD是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病,以記憶喪失和多種認(rèn)知障礙為主要臨床表現(xiàn)。長期以來,AD病理被認(rèn)為是有毒的Aβ異構(gòu)體積累在腦實(shí)質(zhì)。Aβ導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞激活,從而使炎癥反應(yīng)擴(kuò)散到整個(gè)大腦[42]。遺憾的是,目前尚無有效的方法可以預(yù)防或治愈AD患者的神經(jīng)元細(xì)胞死亡、Aβ沉積和認(rèn)知功能下降。近年來,研究人員發(fā)現(xiàn)NSC具有分化為中樞神經(jīng)系統(tǒng)各種類型細(xì)胞的潛能,為神經(jīng)退行性疾病的治療帶來了希望。自從最初發(fā)現(xiàn)外泌體與AD有關(guān)[43]以來,多項(xiàng)研究證明了外泌體在AD中的多方面作用。

Dinkins等[44]研究發(fā)現(xiàn),外泌體蛋白質(zhì)在AD患者大腦的斑塊中積累,它們通過抑制nSMase2,減少外泌體的分泌,從而在體內(nèi)減少AD患者大腦中的淀粉樣斑塊負(fù)荷。有證據(jù)表明,Aβ在突觸上結(jié)合可導(dǎo)致突觸功能中斷,最終導(dǎo)致樹突棘的收縮和認(rèn)知障礙[45]。Micci等[46]研究發(fā)現(xiàn),NSC分泌的外泌體可阻止突觸與Aβ受體的結(jié)合,并防止相關(guān)功能障礙(如記憶回憶缺陷);用NSC外泌體治療小鼠的突觸可塑性和記憶功能均對Aβ誘導(dǎo)的損傷有保護(hù)作用;此外,在誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)基因小鼠模型中敲除NSC可導(dǎo)致突觸對Aβ的易損性增加,而外源性給藥NSC外泌體可完全修復(fù)該易損性。這些結(jié)果表明,由NSC特異性釋放的外泌體在促進(jìn)或維持突觸對Aβ?lián)p傷影響的恢復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,NSC分泌的外泌體通過誘導(dǎo)受體神經(jīng)元的變化來緩解Aβ介導(dǎo)的毒性。目前已有研究表明,外泌體(包括NSC分泌的外泌體)引發(fā)的許多效應(yīng)可歸因于其特定的microRNA載體作用,包括對衰老[47]、認(rèn)知、突觸功能[48]的調(diào)節(jié)以及對神經(jīng)的保護(hù)[49]。因此,NSC分泌的外泌體中特定的microRNA可能介導(dǎo)其對靶神經(jīng)元突觸的保護(hù)作用,提示了開發(fā)新的治療途徑促進(jìn)AD患者認(rèn)知功能恢復(fù)的可能性。

3.2.3 外泌體在SCI治療中的應(yīng)用

SCI會(huì)促使軸突分離和神經(jīng)元死亡,導(dǎo)致永久性功能損傷。目前,SCI尚無根治方法,但干細(xì)胞移植常被認(rèn)為是緩解SCI發(fā)展的最具吸引力治療方法之一。成人脊髓中內(nèi)源性NSC的發(fā)現(xiàn),為未來SCI的無創(chuàng)治療帶來了希望。但在常規(guī)臨床應(yīng)用前,人們?nèi)孕杞鉀Q移植細(xì)胞存活率低、細(xì)胞去分化、腫瘤形成等諸多問題。有研究表明,移植的干細(xì)胞主要通過旁分泌機(jī)制來減輕炎癥反應(yīng)、提供神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)修復(fù),而外泌體在促進(jìn)SCI缺氧缺血后功能恢復(fù)的這一過程中發(fā)揮重要作用[50]。

自噬對細(xì)胞的再生至關(guān)重要,基礎(chǔ)或生理的自噬有助于細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持、蛋白質(zhì)和亞細(xì)胞細(xì)胞器的控制,且可減少細(xì)胞損傷[51]。Rong等[39]研究表明,NSC來源的外泌體可通過提高LC3B和beclin-1表達(dá)所介導(dǎo)的自噬,抑制SCI模型大鼠的神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)炎癥和小膠質(zhì)細(xì)胞激活過程,從而促進(jìn)功能恢復(fù)。因此,未來可將NSC來源的外泌體作為一種新型SCI生物治療途徑。

4 總結(jié)和展望

外泌體是目前基礎(chǔ)科學(xué)和轉(zhuǎn)化研究中發(fā)展最快的領(lǐng)域之一。然而,來自特定細(xì)胞類型的外泌體在不同條件下的功能差異性仍有待探索。在本文中,我們特別指出NSC來源的外泌體的特性、診療潛力及其在生理和病理?xiàng)l件下可能介導(dǎo)的多種功能,為臨床診療提供理論基礎(chǔ)。深入了解外泌體的組成和發(fā)展先進(jìn)的方法來調(diào)節(jié)外泌體的載體,將進(jìn)一步提高外泌體對不同神經(jīng)疾病的治療效果。使用NSC在特定培養(yǎng)條件下分泌的特性良好的外泌體和攜帶所需microRNA、mRNA和蛋白質(zhì)的外泌體,在治療多種神經(jīng)疾病方面有很大的前景。

此外,使用NSC外泌體的非侵入性治療方法可能比NSC移植更有效,因?yàn)樵陟o脈或鼻腔給藥后,外泌體可以很容易地穿過血腦屏障到達(dá)病變部位。在未來,針對大腦中特定神經(jīng)元類型或區(qū)域的外泌體可能有助于治療不同的神經(jīng)疾病。但是,NSC外泌體的研究還面臨諸多挑戰(zhàn),有關(guān)NSC外泌體診斷和治療神經(jīng)疾病方面的研究仍任重道遠(yuǎn)。