張凌云,劉 纓

(北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,中國北京 102488)

細(xì)胞衰老(cellular senescence,CS)是細(xì)胞增殖、分化能力和生理功能逐漸發(fā)生衰退的變化過程[1～2]。細(xì)胞衰老研究是衰老機制、抗衰老、抗癌[3]研究的重要內(nèi)容之一,而構(gòu)建細(xì)胞的衰老模型是研究細(xì)胞衰老必不可少的步驟。根據(jù)誘發(fā)因素的不同,細(xì)胞衰老可以劃分成應(yīng)激誘導(dǎo)早衰(stress-induced premature senescence,SIPS)、復(fù)制性衰老(replicative senescence,RS)[4～5]、癌基因誘導(dǎo)衰老(oncogene-induced senescence,OIS)。

衰老指標(biāo)對于驗證所制備模型成功與否十分重要,指標(biāo)的選擇也同樣重要。目前,不同文獻中使用的衰老細(xì)胞模型和檢測指標(biāo)都不盡相同。不同情況下如何選用合適的模型和檢測指標(biāo)尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本文討論和分析了現(xiàn)有的一些細(xì)胞衰老模型的建立方法,列舉了常用的細(xì)胞衰老檢測指標(biāo)并總結(jié)了其選擇方法,以便為相關(guān)的研究提供參考。

1 檢測指標(biāo)

細(xì)胞衰老的特征包括細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞周期阻滯、氧化應(yīng)激水平和染色質(zhì)的改變。由于沒有單一的性狀可以獨自定義細(xì)胞衰老,所以體外衰老表型的確定往往需要多個特征同時驗證,有文獻建議至少驗證3個不同的特征[6]。具體的檢測指標(biāo)有基于這些特征的通用指標(biāo),如:衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶(senescence-associated beta-galactosidase,SA-β-Gal)活性升高、細(xì)胞形態(tài)改變、衰老相關(guān)蛋白質(zhì)累積、細(xì)胞周期分布改變、DNA損傷灶產(chǎn)生[7]、衰老相關(guān)的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)[1,8]等;也有基于不同誘導(dǎo)劑以及細(xì)胞類型的特異指標(biāo),如:造血祖細(xì)胞混合細(xì)胞集落形成單位(colony forming unitmix,CFU-mix)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、ATP的合成及線粒體的膜電位。

1.1 形態(tài)變化相關(guān)指標(biāo)

1.1.1 衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶活性

SA-β-Gal活性升高被一致認(rèn)為是評價細(xì)胞衰老的生物學(xué)標(biāo)志。目前,絕大部分關(guān)于細(xì)胞衰老模型的文獻都有使用SA-β-Gal染色法對其活性進行檢測,只有少數(shù)例外[9]。這也是唯一可以將不同文獻中所建立的模型進行對比的指標(biāo)。Dimri等[4]首次證明,該生物標(biāo)志物在生物體內(nèi)隨著細(xì)胞的衰老而逐漸積累增多。β-Gal是一種水解酶,其在衰老前細(xì)胞、靜止細(xì)胞和終末分化細(xì)胞中是缺乏的,只有在衰老細(xì)胞中才可以催化β-半乳糖苷水解為單糖[4,6,10]。在pH為6.0的條件下進行β-Gal測定時,只有處于衰老狀態(tài)的細(xì)胞才會出現(xiàn)由人工顯色底物X-Gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)分解產(chǎn)生的藍(lán)色染色沉淀物。該現(xiàn)象是由于內(nèi)源性溶酶體β-Gal特異性地在衰老細(xì)胞中的過度表達(dá)和積累,可以很容易并且可靠地在原位和體外被檢測到[4,11]。用光學(xué)顯微鏡進行觀察并且計數(shù)時,表達(dá)藍(lán)色的細(xì)胞即為β-Gal陽性,細(xì)胞陽性染色百分率可以表示群體衰老程度。

1.1.2 細(xì)胞形態(tài)變化

衰老細(xì)胞的形態(tài)特征是體積增大,生長在固體表面時明顯扁平,細(xì)胞核增大且形狀不規(guī)則。這些特征觀察起來很方便,部分文獻選擇細(xì)胞形態(tài)作為細(xì)胞衰老的檢查指標(biāo)[12],但是沒有一個量化標(biāo)準(zhǔn)。McKenna等[13]根據(jù)細(xì)胞形態(tài)的特征變化,利用細(xì)胞核染料4＇,6-二脒基-2-苯基吲哚(4＇,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)標(biāo)記核DNA,以生長細(xì)胞扁平化時DNA相關(guān)的部分區(qū)域熒光強度與細(xì)胞核面積比值的下降,作為衰老的一個形態(tài)計量指標(biāo)。核纖層蛋白B1(lamin B1)是維持細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整性的關(guān)鍵,其減少導(dǎo)致核完整性和穩(wěn)定性下降,繼而導(dǎo)致其他核變化[6,14],這種減少可以通過成像或免疫印跡檢測,從而指示體外衰老表型[6,15]。

1.1.3 衰老相關(guān)的分泌表型

衰老的發(fā)生經(jīng)常與持續(xù)性的DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response,DDR)有關(guān)[15],同時伴隨著細(xì)胞分泌功能增加,即衰老相關(guān)分泌表型(SASP)。SASP因子的種類復(fù)雜多樣,主要有促炎因子、生長因子、趨化因子等[16]。復(fù)制性衰老與誘導(dǎo)型衰老有相類似的表型,它們都會引起相關(guān)炎癥因子的釋放,出現(xiàn)SASP。促炎因子是SASP的重要組成部分之一,是衰老細(xì)胞的關(guān)鍵特征[17]。另外,白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和IL-8在衰老細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),也是細(xì)胞衰老的重要指標(biāo)。IL-8是C-X-C趨化因子家族的一員,在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用[17]。

1.2 細(xì)胞周期相關(guān)指標(biāo)

1.2.1 衰老相關(guān)細(xì)胞周期蛋白

周期蛋白依賴性激酶抑制物(cyclin-dependent kinase inhibitor,CKI)是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的重要信號分子,其中最具代表性的是P16、P21和P53[17]。P21、P53、P16的表達(dá)上調(diào)可促進細(xì)胞衰老發(fā)生[18～19]。細(xì)胞衰老的一個主要特征是不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞生長周期停滯,這主要是由于P16/RB和P53/P21通路的調(diào)節(jié),這兩條通路的調(diào)節(jié)和變化也是導(dǎo)致細(xì)胞衰老的兩種理論信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制[20]。P16INK4a、P21-Cip1是認(rèn)可度較高的衰老相關(guān)標(biāo)志物。P21能夠普遍結(jié)合進而阻礙各類周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)復(fù)合物的生成,降低RB的磷酸化水平,抑制E2F的釋放,阻礙DNA的生成,進而致使細(xì)胞無法進入S期,只能停滯在G1期,最終誘發(fā)細(xì)胞衰老[21]。p53基因是一種與細(xì)胞生長、凋亡、衰老和DNA修復(fù)相關(guān)的重要基因。有研究指出,降低p53基因的表達(dá)水平可以減少皮膚細(xì)胞凋亡,并且能夠一定程度緩解皮膚衰老[22～23]。p53同時也是一種抑癌基因,其編碼的蛋白質(zhì)P53參與細(xì)胞對DNA損傷的應(yīng)答,具有促進或抑制衰老的雙重作用[4,24]。

1.2.2 細(xì)胞周期分布

細(xì)胞周期是指連續(xù)分裂的細(xì)胞從一次分裂完成時開始到下一次分裂完成時為止的過程。細(xì)胞周期調(diào)控細(xì)胞衰老,G1/G0期的永久性細(xì)胞周期停滯是細(xì)胞衰老的特征之一,此種停滯由每個細(xì)胞的DNA數(shù)量決定。相較于年輕細(xì)胞,衰老細(xì)胞中處于S期的細(xì)胞進一步減少,G1/G0比值下降,G2/M比值增加[25]。因此,細(xì)胞周期各期的分布情況也可用于監(jiān)測衰老,其常采用流式細(xì)胞術(shù)或碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色法進行分析。

1.3 細(xì)胞抗氧化能力檢測指標(biāo)

自由基所導(dǎo)致的氧化損傷是細(xì)胞衰老的幾大學(xué)說之一。機體的抗氧化能力與衰老密切相關(guān),當(dāng)機體受到壓力刺激或抗氧化能力減弱時,過量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)在體內(nèi)堆積,導(dǎo)致氧化損傷,從而引發(fā)衰老及相關(guān)疾病[26]。衰老往往伴隨著抗氧化能力的下降,因此抗氧化因子的表達(dá)和活力也是常用的衰老指標(biāo)。如:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是清除ROS的關(guān)鍵酶,可以將毒性超氧化物轉(zhuǎn)化為過氧化氫和水[20]。SOD是機體抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分,也是機體抗氧化能力的重要評價指標(biāo)。

長壽基因Sirt1(sirtuin1)表達(dá)的去乙?；缚梢种苝53基因表達(dá),延緩細(xì)胞的凋亡和衰老[27～28]。該因子在線粒體調(diào)控及清除ROS的過程中也起到關(guān)鍵作用,可通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)通路降低細(xì)胞內(nèi)ROS的水平,進而延緩細(xì)胞的衰老進程[19]。NF-κB是一種和衰老有密切關(guān)聯(lián)的調(diào)控因子,其過表達(dá)可以引起所培養(yǎng)的細(xì)胞出現(xiàn)衰老表型[19]。丙二醛(malondialdehyde,MDA)是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物之一,其水平能夠反映出機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度,從而間接說明細(xì)胞受到傷害的程度。由于ROS的產(chǎn)生和線粒體有關(guān),所以線粒體膜電位水平也能夠在一定程度上說明機體的氧化損傷程度[29]。因此,NF-κB、MDA和線粒體膜電位均可作為機體抗氧化能力降低的間接檢測指標(biāo)。

1.4 染色質(zhì)改變相關(guān)指標(biāo)

1.4.1 DNA損傷灶

除了顯著的形態(tài)學(xué)改變、SA-β-Gal活性升高,與衰老相關(guān)的異染色質(zhì)灶(senescence-associated heterochromatin foci,SAHF)是衰老細(xì)胞的另一個典型特征[15],組蛋白H3第9位賴氨酸三甲基化(H3 lysine 9 trimethylation,H3K9me3)、異染色質(zhì)蛋白 1γ(heterochromatin associated protein 1γ,HP1γ)是其標(biāo)志蛋白質(zhì)[30～31]。DNA是組成染色質(zhì)的主要成分。DNA損傷中最嚴(yán)重的形式為DNA雙鏈斷裂,其應(yīng)用最廣泛的標(biāo)記物是γ-H2AX(phosphorylated histone H2AX)。

1.4.2 DNA甲基化

部分DNA甲基化數(shù)據(jù)已被開發(fā)為衰老的生物標(biāo)志物,即“表觀遺傳時鐘”,其已被廣泛用于識別健康和疾病(包括認(rèn)知功能衰退和其他神經(jīng)退行性變性疾病)的實際年齡與生物年齡之間的差異,是目前最具前景的衰老生物標(biāo)志物之一[32]。DNA甲基化時鐘包括特定的一組由嘧啶-磷酸-鳥嘌呤二核苷酸組成的DNA甲基化位點,其甲基化狀態(tài)可用于測量主觀年齡,即生物衰老程度。這些時鐘被認(rèn)為是人類和其他脊椎動物按時間順序年齡的準(zhǔn)確生物標(biāo)記,可以量化生物衰老的速度[33]。

近期,Liu等[34]首次從多角度對11個當(dāng)前的DNA甲基化時鐘進行了比對分析,并建立了新的組合式DNA甲基化時鐘“meta-clock”,其在反映衰老特征方面更為高效,而且可以區(qū)別腫瘤與正常組織,可以更好地進行全因死亡預(yù)測。這類組合式時鐘的探索,或許將有利于開發(fā)出更有效可靠的衰老生物標(biāo)志物用于臨床及轉(zhuǎn)化研究。

1.5 特異指標(biāo)的選擇

1.5.1 和細(xì)胞的類型有關(guān)

衰老指標(biāo)的選擇和細(xì)胞類型相關(guān),因為不同細(xì)胞有其特異的衰老表現(xiàn)。例如,干細(xì)胞的自我更新能力會隨著機體年齡的增加而不斷下降,部分研究者會利用細(xì)胞增殖能力檢測方法,如CCK8、Ki67免疫熒光染色[35～36],輔助干細(xì)胞衰老鑒定。當(dāng)然,增殖能力不僅僅是干細(xì)胞才有,一些增殖能力較強的細(xì)胞模型在衰老鑒定的時候也會用到增殖檢測,如大鼠髓核細(xì)胞(nucleus pulposus,NP)[35]、乳腺癌細(xì)胞[36]。對于造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell,HSC)和祖細(xì)胞(hematopoietic progenitor cell,HPC),集落形成單位(colony-forming unit,CFU)是評價其自我更新能力以及多向分化潛能的重要指標(biāo)[37～38],有研究選用CFU-mix作為多向HSC的衰老評價指標(biāo)[38]。堿性磷酸酶(ALP)高表達(dá)是牙囊細(xì)胞(dental follicle cell,DFC)早期分化的重要指標(biāo)[39],也可作為其衰老檢測指標(biāo)。纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)是一類有效的纖溶抑制劑和血栓形成的介質(zhì),其表達(dá)可以作為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)衰老的標(biāo)志物[40]。另外,相關(guān)研究在對人真皮成纖維細(xì)胞(human dermal fibroblast,HDF)進行研究時,將Ⅰ型膠原蛋白(collagen typeⅠ,Col-Ⅰ)和基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase 1,MMP-1)納入檢測指標(biāo)[9]。表1給出了部分衰老指標(biāo)在不同細(xì)胞相關(guān)研究中的選用情況[9,30,35,37,39～41]。

表1 衰老指標(biāo)在不同細(xì)胞中的應(yīng)用Table 1 Hallmarks of senescence applied for different cells

1.5.2 和誘導(dǎo)劑的種類有關(guān)

衰老指標(biāo)的選擇還和誘導(dǎo)劑的種類有關(guān)。例如:使用H2O2作為誘導(dǎo)劑的時候,由于H2O2通過氧化應(yīng)激的方式,最終引起DNA的損傷,激活P53/P21信號通路,所以研究人員往往會將DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX或者P21等衰老相關(guān)蛋白質(zhì)加入檢測指標(biāo)[42～43];選用血管緊張素Ⅱ(angio-tensinⅡ,AngⅡ)作為誘導(dǎo)劑對人血管平滑肌細(xì)胞(human vascular smooth muscle cell,hVSMC)進行研究時,因AngⅡ可以通過端粒依賴性和非依賴性途徑介導(dǎo)DNA氧化損傷,從而加速血管平滑肌細(xì)胞的衰老,所以研究人員將DNA損傷、端粒DNA長度納入其檢測指標(biāo)[44]。AngⅡ還可以刺激NADPH氧化酶1(NADPH oxidase 1,Nox1)激活,并通過降低過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α,PGC-1α)活性、增加線粒體氧化應(yīng)激等途徑,介導(dǎo)線粒體功能障礙,導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞的衰老,因此,Tsai等[29]將ATP的合成及線粒體的膜電位也用于衰老判定。

1.5.3 和研究目的有關(guān)

衰老指標(biāo)的選擇也和研究目的有關(guān)。自噬途徑具有消除受損蛋白質(zhì)和細(xì)胞器進而延長壽命的功能,衰老的細(xì)胞往往伴隨自噬活性的下降。有研究發(fā)現(xiàn),自噬通過消除損傷細(xì)胞器、減輕氧化應(yīng)激、促進胞內(nèi)物質(zhì)循環(huán)等途徑,保護血管內(nèi)皮細(xì)胞,避免其死亡[45]。Wang等[46]在研究蟲草素對衰老的抑制作用與自噬途徑的相關(guān)性中,就將細(xì)胞自噬水平相關(guān)蛋白質(zhì)P62、微管相關(guān)蛋白輕鏈3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)納入檢測指標(biāo)。

2 細(xì)胞衰老模型

無論是通用或者非通用檢測指標(biāo)的選擇,其目的都是對細(xì)胞衰老進行更深入的研究。人為構(gòu)建的細(xì)胞衰老模型根據(jù)誘發(fā)因素的不同,可以劃分成應(yīng)激誘導(dǎo)早衰、復(fù)制性衰老以及癌基因誘導(dǎo)衰老。

2.1 復(fù)制型

復(fù)制性衰老是端粒在每次分裂結(jié)束時逐漸侵蝕的結(jié)果,直至細(xì)胞達(dá)到端粒功能障礙的狀態(tài)(稱為Hayflick的極限)[47]。復(fù)制性衰老模型是基于器官老化內(nèi)在機制的常用實驗性衰老模型[48]。復(fù)制性衰老模型的構(gòu)建一般不使用藥物,這避免了與后期實驗組進行藥物處理時發(fā)生沖突,因此模型適用范圍更廣。但是,其造模往往需要多次反復(fù)傳代,耗費的時間和人力較大[49]。

當(dāng)前,多種細(xì)胞被用于復(fù)制性衰老研究。例如:王曉睿[49]對鼠腎小管原代上皮細(xì)胞進行傳代培養(yǎng),13 d后衰老比率超過95%;Han等[50]研究了自噬在復(fù)制衰老過程中的可能作用,發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)自噬水平降低可能是人類包皮成纖維細(xì)胞Hs68復(fù)制性衰老的機制;Delfarah等[51]基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectroscopy,LC-MS)的代謝組學(xué),研究了衰老的原代人乳腺上皮細(xì)胞(human mammary epithelial cell,HMEC),發(fā)現(xiàn)抑制核苷酸合成促進HMEC的復(fù)制衰老;Gao等[52]利用人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞(human embryonic lung diploid fibroblasts)2BS和人胚肺成纖維細(xì)胞(human fetal lung fibroblasts)WI-38證明,E2F1介導(dǎo)復(fù)制衰老過程中POLD1[polymerase(DNA)delta 1]的下調(diào)。

2.2 誘導(dǎo)型

誘導(dǎo)型衰老模型(SIPS)與復(fù)制型不同,其構(gòu)建有H2O2、輻射、高糖、藥物等多種誘導(dǎo)方式,其中H2O2是最常用的誘導(dǎo)劑,通?？梢栽趲滋熘畠?nèi)完成衰老模型的構(gòu)建,并且對多種細(xì)胞都有效[49]。

2.2.1 H2O2誘導(dǎo)

氧化損傷是現(xiàn)今較為常見的細(xì)胞衰老模型構(gòu)建原理。H2O2通過氧化應(yīng)激的方式,最終引起DNA的損傷,激活P53/P21信號通路[53]。H2O2誘導(dǎo)條件基于實驗?zāi)康暮图?xì)胞類型的不同而調(diào)整。Marazita等[43]建立了H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞衰老模型,其將細(xì)胞暴露于150 mmol/L H2O290 min,維持培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后,陽染率有80%。Lim等[54]用1 mmol/L H2O2處理人骨骼肌成肌細(xì)胞(CHQ5B)30 min,探討富托三烯酚組分(tocotrienol-rich fraction,TRF)對其衰老的調(diào)控作用。蘇慧麗等[55]選擇人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞系2BS制備衰老模型,200 μmol/L H2O2處理2 h后,培養(yǎng)5 d,陽染率接近95%。

三丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)也被用作制備細(xì)胞氧化損傷模型的誘導(dǎo)劑。Zhou等[38]報道,t-BHP可致小鼠造血干細(xì)胞(HSC)衰老,其誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后細(xì)胞的衰老陽染率達(dá)到57.92%±4.24%。

2.2.2 輻射誘導(dǎo)

輻射誘導(dǎo)對環(huán)境的要求較高,并且需要更加精密的分析儀器[49]。衰老的主流觀點認(rèn)為,DNA損傷積累最終導(dǎo)致機體衰老,而電離輻射可以使DNA的雙鏈斷裂繼而致使DNA損傷。

Dalle Pezze等[56]設(shè)計了一個數(shù)學(xué)模型來模擬20 Gy X射線照射5 min誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的動態(tài)過程。模型整合了細(xì)胞老化的5個關(guān)鍵調(diào)控因素:胰島素受體、FoxO3a(forkhead box protein O 3a)、DDR、ROS和線粒體功能。其優(yōu)點是可以隨時對模型進行調(diào)整,且快速;缺點是對于未弄清楚機制的衰老調(diào)節(jié)通路,無法復(fù)制進模型中。Schick等[57]聯(lián)合應(yīng)用放射療法(radiotherapy,RT)與曲美替尼,探索曲美替尼使RAS/RAF突變黑色素瘤細(xì)胞放射增敏的機制。McRobb等[41]用20 Gy劑量的輻射誘導(dǎo)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain-derived endothelial cells.3,bEnd.3)衰老,發(fā)現(xiàn)第6天時陽染率達(dá)到65%±8%。此外,也有文獻使用311 nm紫外線(UVB)誘導(dǎo)HDF細(xì)胞衰老,結(jié)果顯示細(xì)胞陽染率可達(dá)到90%左右[58]。

2.2.3 高糖誘導(dǎo)

在誘導(dǎo)細(xì)胞衰老中,D-半乳糖是被使用得較多的糖類誘導(dǎo)劑[9]。D-半乳糖在正常情況下可經(jīng)肝臟代謝成葡萄糖,但在較高濃度時,D-半乳糖在醛糖還原酶的催化下還原成半乳糖醇[42],后者的積累導(dǎo)致細(xì)胞滲透壓變化、細(xì)胞腫脹、膜脂損傷等衰老表現(xiàn)。D-半乳糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷可以觸發(fā)ROS的生成[59],導(dǎo)致腦神經(jīng)退化。此外,D-半乳糖可以誘發(fā)蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng),最終形成晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end product,AGE)[60],AGE聚集是許多年齡相關(guān)退行性疾病的常見特征[59]。目前,高糖與衰老之間的關(guān)系仍未完全闡明。

除了D-半乳糖,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、葡萄糖等也可用于誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。Hou等[35]用濃度為0.2 mol/L的葡萄糖誘導(dǎo)大鼠髓核(NP)細(xì)胞衰老。劉印康等[9]用脂多糖誘導(dǎo)HDF細(xì)胞衰老。最近,缺乏核型營養(yǎng)不良聚糖(β-DG)使小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)獲得衰老特征被證實[61]。除此之外,人們在糖尿病機制研究中也發(fā)現(xiàn),通過上調(diào)血小板反應(yīng)蛋白CD47依賴性信號通路可以妨礙血管生成并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老[62]。有報道顯示,核糖也可用來誘導(dǎo)構(gòu)建衰老相關(guān)疾病模型[63～64]。

2.2.4 其他藥物誘導(dǎo)

Herbert等[44]用AngⅡ誘導(dǎo)hVSMC的衰老,驗證了AngⅡ通過ROS介導(dǎo)的DNA損傷致使hVSMC衰老的假說。Tsai等[29]則在該模型的基礎(chǔ)上對衰老的機制開展了進一步研究。

由于研究細(xì)胞衰老對抗腫瘤具有積極的作用,所以部分研究人員致力于抗腫瘤藥物在細(xì)胞衰老中的作用機制研究。Ota等[40]用抗腫瘤藥物誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞衰老,并發(fā)現(xiàn)西羅莫司和依維莫司誘發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老是Sirt1依賴性的,而紫杉醇通過Sirt1非依賴性途徑發(fā)揮作用。Demaria等[65]發(fā)現(xiàn),阿霉素(doxorubicin,Doxo)等4種常用的化療藥物可以誘導(dǎo)正常非癌組織中衰老細(xì)胞的持續(xù)存在。Liu等[66]發(fā)現(xiàn),異染色質(zhì)組織在Doxo或H2O2誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的早期階段被激發(fā)。另有研究表明,免疫抑制劑及抗癌藥物雷帕霉素可以預(yù)防細(xì)胞和組織的衰老[37],由此其被視為潛在的抗衰老藥物受到進一步關(guān)注。

2.3 癌基因誘導(dǎo)衰老

除了復(fù)制性衰老、應(yīng)激性早衰,癌基因誘導(dǎo)衰老也是細(xì)胞衰老的一大類型。癌基因通過調(diào)節(jié)某些基因誘導(dǎo)細(xì)胞衰老[67]。Paget等[36]通過敲除PKCi基因研究了其對乳腺癌細(xì)胞衰老的抑制作用。Nojima等[68]通過敲除SPT6基因誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。Crochemore等[69]通過敲除Cockayne綜合征(Cockayne syndrome,CS)相關(guān)基因CSB誘導(dǎo)p21依賴性早衰,揭示了CSB的缺失是基于p21的復(fù)制性衰老的已知最早的觸發(fā)因素。

3 總結(jié)

復(fù)制性衰老模型不使用藥物,避免了藥物之間的相互作用,更符合真實衰老狀態(tài)。但是其缺點也很明顯,即模型制作耗時長,在實驗中會消耗更多的人力以及物力。誘導(dǎo)型衰老模型則相反,造模時間稍短,一般在5～8 d即可造模成功。但是其缺點也不容忽視,如誘導(dǎo)劑的使用對于后續(xù)的實驗可能會有未知的影響。另外,就不同誘導(dǎo)劑造模成功率來看,H2O2能達(dá)到一個較高的衰老率(平均80%以上),糖類較低,其他誘導(dǎo)劑則參差不齊。就輻射誘導(dǎo)而言,其對所需儀器的要求較高,且誘導(dǎo)方向的不確定性較大。而無論是藥物誘導(dǎo)還是輻射誘導(dǎo)或者是基因調(diào)控誘導(dǎo),都會對細(xì)胞產(chǎn)生一種損傷性的影響。因為這種損傷造成的快速衰老現(xiàn)象在細(xì)胞的自然衰老過程中一般不會出現(xiàn)或者出現(xiàn)較少,所以誘導(dǎo)型的衰老模型和自然衰老模型可能仍然存在一定的差異。如果能夠在制作模型的時候和自然衰老模型進行實時比較,或許能校準(zhǔn)這種可能存在的差異。

細(xì)胞衰老模型是否成功建立最終還要依靠檢測指標(biāo)證實。檢測指標(biāo)的選擇不僅限于衰老標(biāo)志物,還和所選用的細(xì)胞類型、誘導(dǎo)劑的種類以及實驗最終的研究目的有關(guān)。選擇適當(dāng)?shù)哪Ｐ秃蜋z測指標(biāo),是正確分析和評價實驗結(jié)果的前提。對衰老檢測指標(biāo)和細(xì)胞模型的研究將進一步為相關(guān)的科學(xué)研究提供材料和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

致謝:十分感謝實驗室的係夢琪師姐給予文字部分的指導(dǎo)并且協(xié)助完成論文修改工作。