王 瑩，陳 晨*，陳 剛

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科，江蘇 南京 210029；2南京醫(yī)科大學(xué)口腔疾病研究江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210029；3江蘇省口腔轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)工程研究中心，江蘇 南京 210029；4南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，江蘇 南京 210029

嚴(yán)重牙槽骨缺損制約了口腔種植義齒技術(shù)的臨床應(yīng)用，利用引導(dǎo)骨再生的填充材料促進(jìn)骨修復(fù)是一種備受期待的解決方法［1-2］。在修復(fù)少量骨缺損時(shí)，骨填充材料內(nèi)部的細(xì)胞僅依靠周圍組織血管的養(yǎng)分滲透即可正常生長［3-4］，獲得了較好的效果。但是支架材料若僅依靠周圍養(yǎng)分的滲透，而缺乏充分的血管化，形成的正常骨質(zhì)通常不會(huì)超過材料表面的1 mm［5］，所以單純用骨替代材料修復(fù)大范圍骨缺損的效果仍不能滿足臨床要求。血管內(nèi)皮細(xì)胞作為支架血管化的主要參與者，可以分泌成骨相關(guān)因子，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic pro?tein，BMP），對成骨細(xì)胞的增殖、遷移、分化甚至礦化都有直接的調(diào)控作用［6］。所以血管化不良的支架材料不但無法為內(nèi)部細(xì)胞輸送養(yǎng)分，也不能持續(xù)釋放相關(guān)細(xì)胞因子募集周圍細(xì)胞長入。

為解決這一問題，設(shè)計(jì)一種能持續(xù)釋放相關(guān)因子的支架，促進(jìn)其血管化和成骨能力，進(jìn)而修復(fù)大范圍的牙槽骨缺損，一直是研究者們努力的方向［7］。本研究前期制備了一種聚乳酸?聚乙醇酸共聚物［poly（lactic?co?glycolic acid），PLGA］微囊支架并證明了其特殊結(jié)構(gòu)非常利于早期的血管長入及后期的成骨［8］。前期利用傳統(tǒng)乳液揮發(fā)法制備的微囊雖然具備載藥緩釋的潛力，但是所制得的微囊粒徑分布過寬，存在大量不適合細(xì)胞培養(yǎng)的10 μm 級(jí)別的過小微囊；內(nèi)部囊腔大小、數(shù)量不規(guī)則，甚至存在不含囊腔的實(shí)心球體，整體包封率及釋放性能可控性差［9］。因此，本研究開發(fā)了一種新的雙通道微量同軸注射PLGA微囊的制備方法。在該方法中內(nèi)外徑不同的雙通道同軸針頭的外針連接裝載PLGA溶液的注射器，內(nèi)針連接裝載細(xì)胞因子或藥物的注射器，同軸針頭置于收集裝置的水相中。再將兩支注射器分別固定于雙通道微量注射泵的A、B 通道。注射泵對雙通道的注射速度精確控制，在收集裝置內(nèi)以一定速度旋轉(zhuǎn)流動(dòng)的水相內(nèi)，得到一種新型的具備“殼?芯”結(jié)構(gòu)的PLGA 微囊，A 通道的PLGA 溶液形成為微囊的“殼”，B 通道的內(nèi)容物形成微囊的“芯”。這種方法使得每一顆成品微囊都具有單個(gè)、圓形的規(guī)則內(nèi)腔。與“批量成型”的乳液揮發(fā)法相比，新方法的工藝屬于“單顆成型”，無論如何改變各項(xiàng)工藝參數(shù)，都能對每顆微囊造成同樣影響，得到均一性極高的產(chǎn)物。

本研究提出的PLGA微囊制備方法理論上通過改變同軸注射針頭的內(nèi)外徑和注射泵雙通道的注射速度，可精確控制微囊的外徑和內(nèi)徑，即囊壁的厚度。在其他條件不變的情況下，不同囊壁厚度的微囊同步降解，囊壁越薄的微囊結(jié)構(gòu)完整性越早破壞，囊腔內(nèi)包封的內(nèi)容物越早釋放。替換B 通道內(nèi)的藥物或因子，可方便地使微囊負(fù)載不同的內(nèi)容物。本研究在微囊成型時(shí)同步載入BMP?2，并利用不同囊壁厚度控制BMP?2的緩釋，初步驗(yàn)證了其對成骨細(xì)胞不同強(qiáng)度的趨化作用。

1 材料和方法

1.1 材料

微量注射泵（SP?2000，寧波安諾公司）；磁力攪拌器（MS?H?Pro+，北京大龍公司）；同軸針頭（A 型：內(nèi)徑0.26 mm+外徑0.85 mm；B型：內(nèi)徑0.16 mm+外徑0.85 mm，合肥思品科技有限責(zé)任公司）；熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；掃描電子顯微鏡（scan?ning electron microscope，SEM，TESCAN MAIA3 公司，捷克）；超微量紫外分光光度計(jì)（Thermo Fisher公司，美國），恒溫?fù)u床（上海旻泉公司），激光粒度儀（Mastersizer 2000，Malvern 公司，英國）；PLGA（75：25，分子量12 kDa，濟(jì)南岱罡生物工程有限公司）；聚乙烯醇［Poly（vinyl alcohol），PVA，上海洵昱實(shí)業(yè)有限公司］；小鼠顱骨成骨細(xì)胞系MC3T3?E1（上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫）；胎牛血清（ScienCell 公司，美國）；α?MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國）；0.25%胰酶（Gibco 公司，美國）；CCK?8 試劑盒（合肥Biosharp 公司）；熒光素鈉（Sigma?Aldrich 公司，美國）；0.1%亞甲基藍(lán)染色液（北京Solarbio 公司）；BMP?2（上海Novoprotein 公司），Calcein/PI 細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測試劑盒（上海碧云天公司）；PBS（Gibco公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 PLGA微囊的制備方法

取8 g PVA 溶于400 mL 去離子水制備成2%的PVA溶液，與磁力攪拌子一起盛于500 mL燒杯中置于磁力攪拌器上備用，取1 g PLGA 溶于10 mL 二氯甲烷配置成10%的PLGA溶液置于50 mL注射器，將包封的內(nèi)容物溶液裝入20 mL 注射器。將裝有PLGA溶液的注射器與裝有包封內(nèi)容物溶液的注射器分別安裝到微量注射泵的A、B通道，調(diào)整A通道注射速度為580 mL/h，B 通道注射速度為80 mL/h，分別連接A 型同軸針頭的外針和內(nèi)針入口，將同軸針頭置于PVA溶液液面以下，調(diào)整磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為190 r/min，注射器排氣后開始注射，注射結(jié)束后將針頭從PVA 溶液中取出，制備過程如圖1。磁力攪拌器控制溫度在39 ℃，攪拌8～12 h 后，靜置燒杯讓PLGA微囊沉淀，隨后棄大部分上清，加入無菌去離子水轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管，震蕩離心管以清洗微球，用離心機(jī)調(diào)整轉(zhuǎn)速300 r/min 離心3 min 棄上清。重復(fù)清洗、離心過程3次。更換B型同軸針頭，控制微量注射泵及磁力攪拌器的參數(shù)不變，重復(fù)微囊制備過程。

圖1 PLGA微囊制備示意圖Figure 1 Schematic diagram of preparation of PLGA microspheres

1.2.2 PLGA微囊的形態(tài)及粒度分析

在B通道注射器內(nèi)置入0.1%亞甲藍(lán)染色液，按1.2.1中制備方法制備微囊并冷凍干燥，用光學(xué)顯微鏡及掃描電子顯微鏡在10 kV 電壓下觀察PLGA 微囊的形態(tài)。收集同一批次制備的所有微囊并用粒度分析儀測試微囊粒徑，檢測3批樣本，取均值。

1.2.3 PLGA微囊囊壁厚度分析

按照1.2.1 中PLGA 微囊的制備方法，在B 通道注射器內(nèi)加入100 μg/mL 的熒光素鈉溶液，更換使用兩種型號(hào)同軸針頭，分別收集兩種微囊并于正置熒光顯微鏡下觀察，用圖像處理軟件Image J測量微囊囊壁厚度（n=286）并統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 PLGA微囊的降解

凍干后兩種囊壁厚度的PLGA 微囊分別稱取50 mg 置于1.5 mL 離心管中，每種厚度設(shè)5 個(gè)離心管，每個(gè)離心管中加入1 mL PBS（PH=7.4），將離心管置于150 r/min 恒溫?fù)u床，每隔1、3、7、14、21、28、35、42、49、70 d 取出離心管并離心，去上清，冷凍干燥、稱重，并用SEM觀察PLGA微囊形態(tài)變化。

1.2.5 PLGA微囊細(xì)胞相容性檢測

在B 通道注射器內(nèi)置入無菌生理鹽水，按1.2.1制備方法制備空白微囊并冷凍干燥。取50 mg冷凍干燥的空白PLGA 微囊于1.5 mL 離心管，在75%乙醇中浸泡1 h，去除乙醇，用PBS 漂洗3 遍，加入完全培養(yǎng)基100 μL，置于37 ℃150 r/min 恒溫?fù)u床5 d，離心取上清，用1 mL完全培養(yǎng)基稀釋作為實(shí)驗(yàn)組浸提液培養(yǎng)基。將MC3T3?E1 細(xì)胞按4×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板,于37 ℃、5%CO2和100%濕度的孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組用浸提液完全培養(yǎng)基，對照組用正常完全培養(yǎng)基，每組設(shè)5個(gè)孔，每2天換液，分別在培養(yǎng)第1、3、5、7天后，吸棄原培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含10%CCK?8的完全培養(yǎng)基，避光孵育2 h，吸取90 μL液體置于另一96孔板，用酶標(biāo)儀于450 nm波長下檢測吸光度值。

取20 μL冷凍干燥的空白PLGA微囊，在75%乙醇中浸泡1 h，去除乙醇，用PBS 漂洗3 遍，置于6 孔板中作為實(shí)驗(yàn)組，不加微囊組為對照組，每組3 個(gè)孔。將MC3T3?E1 細(xì)胞按1×104個(gè)/孔的密度接種于6 孔板，于37 ℃、5%CO2和100%濕度的孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d 換液，7 d 后用Calcein/PI 細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測試劑盒按照說明書對細(xì)胞進(jìn)行染色，倒置熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果。

1.2.6 細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)

按照1.2.1 中PLGA 微囊的制備方法，將B 通道注射器替換為500 ng/mL的大鼠BMP?2，更換兩種型號(hào)的同軸針頭，獲得并收集載有BMP?2的兩種囊壁厚度的PLGA 微囊。各取20 μL 體積的兩種PLGA微囊，在75%乙醇中浸泡1 h，去除乙醇，用PBS漂洗3 遍后置于24 孔板中Transwell 小室的下室，并加入培養(yǎng)基700 μL，上室加200 μL 培養(yǎng)基重懸后的MC3T3?E1 細(xì)胞，接種密度為5×105個(gè)/室。不加微囊組為空白對照，每組3 個(gè)孔，24 h 后觀察細(xì)胞遷移結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有定量數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 22.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLGA微囊的形態(tài)及粒度分析

同軸雙通道注射法制備的PLGA微囊形態(tài)及粒度表征見圖2，結(jié)果顯示：該方法制備的兩種厚度囊壁的PLGA微囊大小均一，表面光滑，粒徑均值無明顯差異，約為167.58 μm。

圖2 雙通道微量注射泵制備的PLGA微囊表征Figure 2 The characterizations of PLGA microspheres prepared by dual?channel micro?syringe pump

2.2 PLGA微囊囊壁厚度分析

熒光顯微鏡下兩組囊壁厚度的PLGA 微囊（圖3A、B），圖像處理軟件Image J測量微球囊壁厚度統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：A 型同軸針頭制備的PLGA 微囊囊壁厚度為（23.82±7.10）μm；B型同軸針頭制備的PLGA微囊的囊壁厚度為（35.31±5.55）μm，B 型針頭制備的PLGA 微囊囊壁厚度明顯大于A 型同軸針頭，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001，圖3C、D）。

圖3 不同囊壁厚度的PLGA微囊Figure 3 PLGA microspheres with different shell thickness

2.3 PLGA微囊的降解

兩種厚度PLGA 微囊均可在60 d 左右基本降解，SEM觀察其不同時(shí)間點(diǎn)的微囊形態(tài)變化，35 d后PLGA 微囊在SEM 鏡下基本喪失其原本特征（圖4A）。PLGA 微囊降解動(dòng)力學(xué)變化（圖4B），隨著時(shí)間的推移，PLGA微囊質(zhì)量逐漸減少，最初20 d微囊降解速度較慢，20 d之后微囊降解速度加快，降解末期42 d 以后降解速度減慢直至降解完成。降解全過程中囊壁厚薄不同未見對微囊的降解速率產(chǎn)生明顯影響。

圖4 PLGA微囊的降解結(jié)果Figure 4 The degradation results of PLGA microspheres

2.4 PLGA微囊細(xì)胞相容性檢測結(jié)果

圖5 可見細(xì)胞培養(yǎng)第7 天時(shí)加入PLGA 微囊的實(shí)驗(yàn)組與對照組的細(xì)胞均能正常增殖，并且細(xì)胞可黏附到PLGA 微囊表面；CCK?8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞從1、3、5、7 d都表現(xiàn)出增長趨勢，且加入PLGA微囊浸提液培養(yǎng)后細(xì)胞活力與對照組基本無差異（1、3、7 d時(shí)，P>0.05）。

圖5 PLGA微囊細(xì)胞相容性檢測Figure 5 Cell compatibility test of PLGA microspheres

2.5 細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)

趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖6），與空白組相比，兩組載有BMP?2 的微囊作用24 h，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移量明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而載有BMP?2 的薄型PLGA微囊24 h內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的量也明顯多于厚型PLGA微囊，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖6 包封BMP?2的PLGA微囊對成骨細(xì)胞的趨化作用Figure 6 The chemotactic effects of PLGA microspheres encapsulated with BMP?2 on osteoblastcells

3 討論

傳統(tǒng)乳液揮發(fā)法制備的PLGA微囊多用作緩釋藥物的載體［10］，該工藝較易制備幾十微米甚至更小粒徑的微囊。然而PLGA 微囊直徑過小，表面積不足，不利于細(xì)胞黏附，其堆疊后作為骨填充物過于密實(shí)，微囊間孔隙太小，不利于細(xì)胞傳導(dǎo)，此外微囊直徑<10 μm容易被吞噬細(xì)胞吞噬，微囊直徑>200 μm容易引起細(xì)胞免疫反應(yīng)［11］，因此直徑100～200 μm的微囊粒徑較為理想。常用的乳液揮發(fā)法制備的微囊越小則越趨向于形成單一規(guī)則囊腔，若微囊直徑越大則囊腔數(shù)量、分布越不規(guī)則，從無囊腔到數(shù)個(gè)甚至眾多較小囊腔密集分布，如此則既無法控制藥物載量也無法調(diào)控緩釋［12］。所以傳統(tǒng)工藝制備的PLGA 微囊難以兼具百微米的較大直徑和單一、規(guī)則并可控的囊腔［13-14］。

本研究中所制得的PLGA微囊為規(guī)則的球形，具有良好的生物相容性，表面適宜貼壁型細(xì)胞黏附生長，且微囊粒徑分布集中度較高，平均為167.58 μm，堆疊后形成的骨填充支架具備同樣級(jí)別尺寸的高度連通的孔隙，使其整體呈現(xiàn)優(yōu)良的細(xì)胞傳導(dǎo)性。雙通道微量同軸注射法在穩(wěn)定獲得大直徑微囊的基礎(chǔ)上，成功在單個(gè)微囊內(nèi)獲得了單一規(guī)則的囊腔，更為重要的是微囊囊壁的厚度可通過控制制備參數(shù)而改變。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種微囊均可在60 d 左右基本完成降解。不同囊壁厚度的微囊取同等質(zhì)量用作降解實(shí)驗(yàn)，且二者的PLGA原料相同，所以降解速度無明顯差別。而囊壁越薄的微囊越早破損，越早釋出包封的內(nèi)容物，因此理論上可以認(rèn)為控制了囊壁的厚度等同于控制了微囊內(nèi)因子的釋出時(shí)間。囊壁越薄包封的細(xì)胞因子量越大，釋放越早，也越能更早誘導(dǎo)周圍組織中細(xì)胞向骨缺損區(qū)趨化。然而囊壁過薄必然帶來微囊強(qiáng)度下降、降解時(shí)間過短以及因子突釋等缺陷［12］。應(yīng)用組織工程技術(shù)引導(dǎo)骨再生時(shí)骨填充物的空間維持能力是決定最終效果的一個(gè)重要因素，而空間維持能力又取決于材料的強(qiáng)度和降解速度［15］。填充材料強(qiáng)度過低或降解過快皆不利于骨修復(fù)空間的維持。所以本研究中所制備的緩釋型PLGA微囊還需要根據(jù)最終應(yīng)用場景的需求精確調(diào)整制備參數(shù)。

本研究首創(chuàng)的微量注射泵雙通道同軸注射法制備的緩釋型PLGA微囊相較于傳統(tǒng)乳液揮發(fā)法微囊，制備方法簡單，原材料的利用率大大提高，微囊粒徑分布集中，且所獲微囊在百微米直徑的基礎(chǔ)上具備單一規(guī)則的囊腔。新制備方法中的PLGA分子量、溶液濃度、雙通道各自的注射速度及收集裝置中液體的攪拌速度的變化，都會(huì)對最終微囊的直徑和囊壁厚度產(chǎn)生影響［16］。本研究經(jīng)過初步探索，在維持約167.58 μm 粒徑的基礎(chǔ)上，穩(wěn)定獲得了兩種不同囊壁厚度的微囊。Transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)提示載有BMP?2的PLGA微囊對成骨細(xì)胞具有誘導(dǎo)作用，且因薄型PLGA 微囊早期因子釋放量大于厚型微囊，趨化作用更明顯。對該新方法各項(xiàng)制備參數(shù)的調(diào)控影響仍需進(jìn)一步研究，也需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證，本研究結(jié)果為開發(fā)可控性骨組織工程技術(shù)材料提供了一種新思路。