何 雷

東南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210096

多項(xiàng)臨床研究表明，小劑量東莨菪堿治療抑郁癥時(shí)有快速抗抑郁的效應(yīng)［1-5］，但會(huì)對(duì)認(rèn)知及學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生一定的不良反應(yīng)，特別是空間定位能力。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，應(yīng)用東莨菪堿會(huì)降低空間定位的學(xué)習(xí)能力，表現(xiàn)異常的空間記憶喚起，對(duì)新環(huán)境的探究時(shí)間延長和認(rèn)知能力下降等，但其作用機(jī)制不甚明確。已有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)［6-9］，動(dòng)物的空間定位能力是通過利用環(huán)境中的標(biāo)記來判斷自身的位置和距離，例如，在曠場(chǎng)區(qū)域內(nèi)，動(dòng)物通過房間內(nèi)標(biāo)記可以判斷自身的位置，從而尋找合適的路徑來完成迷宮任務(wù)。這種空間定位能力與一些相關(guān)功能的神經(jīng)元活動(dòng)有關(guān)，例如位置細(xì)胞、網(wǎng)格細(xì)胞和邊界細(xì)胞。這些集群細(xì)胞發(fā)放可以指征動(dòng)物所處的位置信息，例如位置細(xì)胞主要位于海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)，其在曠場(chǎng)中能以精確到厘米級(jí)別的分辨率區(qū)分自身位置，并可以記錄到該位置所對(duì)應(yīng)的位置細(xì)胞的信號(hào)發(fā)放；而網(wǎng)格細(xì)胞分布在內(nèi)側(cè)內(nèi)嗅皮層（medial entorhinal cortex，MEC）中，其在曠場(chǎng)中可以按網(wǎng)格化形狀分布發(fā)放信號(hào)；邊界細(xì)胞則是分布于壓后皮質(zhì)（retrosplenial cor?tex，RSC）中的一類特殊細(xì)胞，當(dāng)動(dòng)物靠近邊界時(shí)會(huì)密集發(fā)放信號(hào)，用于指征動(dòng)物是否靠近邊界。邊界細(xì)胞對(duì)于感官和空間線索影響下的自我為中心的坐標(biāo)系建立有重要作用，邊界細(xì)胞放電紊亂會(huì)導(dǎo)致空間信息編碼錯(cuò)誤，影響動(dòng)物判斷自身位置和空間距離［6］。此外，邊界細(xì)胞放電還與海馬的theta振蕩具有同步化反應(yīng)，提示RSC邊界細(xì)胞在自我中心的空間信息編碼期間與海馬位置細(xì)胞有重要交流，這些交流是支持空間坐標(biāo)系轉(zhuǎn)換、生成異中心坐標(biāo)的關(guān)鍵因素。RSC邊界細(xì)胞與MEC神經(jīng)元之間也有重要聯(lián)系［10-12］，如果抑制RSC邊界細(xì)胞則會(huì)導(dǎo)致MEC網(wǎng)格細(xì)胞空間信息編碼異常，提示RSC邊界細(xì)胞在進(jìn)行異中心坐標(biāo)向自我中心坐標(biāo)轉(zhuǎn)換的過程中起著重要作用。

本研究選取特異存在于RSC 的邊界細(xì)胞為研究對(duì)象，研究使用東莨菪堿對(duì)小鼠邊界細(xì)胞及空間記憶能力的影響，希望可以找到東莨菪堿誘發(fā)空間定位能力缺陷的原因。Morris 水迷宮是現(xiàn)今研究者們公認(rèn)的用來測(cè)試空間學(xué)習(xí)記憶行為的經(jīng)典方法，本研究首先利用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)來測(cè)試東莨菪堿對(duì)小鼠空間記憶能力的影響。由于在水迷宮實(shí)驗(yàn)中無法同時(shí)記錄在體電生理信號(hào)，于是設(shè)計(jì)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)來判斷東莨菪堿對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)能力及邊界細(xì)胞空間信息編碼的影響。通過向邊界細(xì)胞所在的RSC 區(qū)域植入微絲電極，在曠場(chǎng)測(cè)試實(shí)驗(yàn)的同時(shí)記錄電信號(hào)，分離邊界細(xì)胞的放電頻率，探討東莨菪堿是否會(huì)影響邊界細(xì)胞的空間信息編碼，從而產(chǎn)生空間定位能力下降。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF 級(jí)健康成年C57BL/6 雄性小鼠26 只，鼠齡8 周，體重25～30 g，購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（浙）2019?0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（蘇）2016?0014。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF 級(jí)屏障環(huán)境動(dòng)物室，飼養(yǎng)條件為12 h/12 h晝夜節(jié)律，恒溫25 ℃，相對(duì)濕度（60±5）%，所有小鼠自由飲食攝水。本研究所有小鼠實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)“3R”原則，按照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南》（GB/T 27416?2014）執(zhí)行。

東莨菪堿氫溴酸鹽（中國上海阿拉丁公司），戊巴比妥鈉（北京華業(yè)寰宇化工有限公司），雙氧水（南京晚晴化玻儀器有限公司）。

水迷宮、曠場(chǎng)儀器購自上海欣軟公司，記錄和分析軟件為Anymaze。記錄電信號(hào)的設(shè)備為64 通道在體記錄系統(tǒng)（Plexon Inc公司，美國）。信號(hào)采樣率為40 kHz，用于記錄和分析神經(jīng)元胞外動(dòng)作電位。

電極制備：32通道微絲陣列電極主要由微絲陣列、連接器兩部分組成。將32根聚酰亞胺電極導(dǎo)引管（內(nèi)徑為75 μm，外徑為150 μm，Polymicro techno?logies 公司，美國）切割成5 mm 長度，用快速膠固定組成4×8 的陣列，向每個(gè)導(dǎo)引管插入長度為40 mm的微絲電極（直徑為0.001 4 inch，California Fine Wire 公司，美國），并用快速膠固定微絲與導(dǎo)引管。通過涂抹導(dǎo)電銀漆使微絲的另一端與連接器pin腳相接。連接器（Omnetics Connector 公司，美國）與記錄系統(tǒng)接口相連。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

C57BL/6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組和東莨菪堿組。向小鼠RSC 植入32 通道微絲電極后恢復(fù)7 d，進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，觀察其礦場(chǎng)活動(dòng)速度，并同時(shí)記錄電信號(hào)。隨后通過腹腔給藥方式，給予小鼠25 μg/kg東莨菪堿［13］或等體積的生理鹽水，24 h后進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)并同時(shí)記錄電信號(hào)，分析其對(duì)邊界細(xì)胞放電及邊界細(xì)胞陸地移動(dòng)距離（earth mover’s distance，EMD）的影響。水迷宮實(shí)驗(yàn)中，在訓(xùn)練階段每次訓(xùn)練前注射同上濃度的東莨菪堿或等體積生理鹽水，5 d之后的測(cè)試階段則不注射任何藥物。

1.2.2 電極植入手術(shù)

使用戊巴比妥鈉（腹腔注射10 mg/kg 體重）麻醉。刮去頭頂上方皮毛，固定在立體定位儀上。使用剪刀剪開頭皮，暴露出顱骨，使用雙氧水去除表面結(jié)締組織。根據(jù)小鼠圖譜定位到RSC 上方（AP 2.0 mm；ML 0.8 mm；DV 1.0 mm），使用微型顱鉆在小鼠定位處開孔，直徑約為1.2 mm。用注射針倒鉤挑開硬腦膜，清理植入窗面，將制備好的32 通道微絲陣列電極通過氣動(dòng)微推緩慢植入小孔中，達(dá)到目標(biāo)深度后使用醫(yī)用膠封閉顱骨開孔，待干后用牙科水泥將電極導(dǎo)引管及連接器固定在小鼠顱骨上。等待7 d，便可開始觀察記錄。

1.2.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

利用Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。Morris 水迷宮由1個(gè)圓形水池（直徑1.0 m、深0.6 m）和用于監(jiān)測(cè)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡與速度的視頻監(jiān)控系統(tǒng)組成。實(shí)驗(yàn)時(shí)保持水溫36 ℃。利用Anymaze軟件將水迷宮劃分成4 個(gè)虛擬象限，每個(gè)象限中間位置安置實(shí)體空間標(biāo)志（正上方45 cm 處），選擇其中1個(gè)象限為目標(biāo)象限，放置透明逃生平臺(tái)，位于水下1.5 cm，其他3個(gè)象限設(shè)定4個(gè)動(dòng)物入水點(diǎn)。訓(xùn)練階段共5 d，每天8次，每4次之間間隔1 h，每次訓(xùn)練時(shí)間1 min。每4次訓(xùn)練，入水點(diǎn)的釋放順序采用偽隨機(jī)方式，將小鼠面向池壁放入水中。每只小鼠在臺(tái)上停留20 s用來觀察空間標(biāo)志，若小鼠超過1 min未尋臺(tái)成功，則引導(dǎo)其尋臺(tái)。訓(xùn)練階段結(jié)束后24 h進(jìn)行probe測(cè)試，實(shí)驗(yàn)時(shí)間1 min。取出逃生平臺(tái)，在目標(biāo)象限的對(duì)側(cè)象限中間位置釋放動(dòng)物，記錄并統(tǒng)計(jì)動(dòng)物在各象限的停留時(shí)間及穿過平臺(tái)位置的次數(shù)。

1.2.4 曠場(chǎng)測(cè)試

利用曠場(chǎng)測(cè)試來判定小鼠自發(fā)活動(dòng)能力，并配合電信號(hào)分析判斷邊界細(xì)胞放電。提前將小鼠放入測(cè)試室1 h，測(cè)試時(shí)將小鼠放入曠場(chǎng)內(nèi)，記錄10 min，并同步記錄在體電生理信號(hào)。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后使用稀釋的酒精完全清潔曠場(chǎng)，并晾干，以免上次動(dòng)物余留的信息影響下次測(cè)試結(jié)果。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理方法

在體采集到的電生理信號(hào)以pl2文件格式保存在電腦上，使用Offline Sorter 軟件對(duì)記錄到的單細(xì)胞放電信號(hào)進(jìn)行聚類分析，區(qū)分出單個(gè)神經(jīng)元的放電活動(dòng)。將預(yù)處理好的單神經(jīng)元放電時(shí)間序列導(dǎo)出，使用自行編寫的matlab程序，同時(shí)導(dǎo)入Anymaze分析的軌跡時(shí)間信息，計(jì)算神經(jīng)元放電分布，計(jì)算EMD 從而判斷邊界細(xì)胞等信息。EMD 的計(jì)算參考已發(fā)表的文獻(xiàn)［14］。計(jì)算過程為（Cm?Dm）/（Cm+Dm），其中Cm 定義為任何墻面的單個(gè)最大覆蓋面積，Dm則表示平均放電點(diǎn)的距離，計(jì)算得到區(qū)域內(nèi)所有計(jì)算單位離最近墻面的平均距離，對(duì)于每一面獨(dú)立的墻都計(jì)算，選取最大的分?jǐn)?shù)作為此細(xì)胞的EMD。EMD值越小，說明該細(xì)胞表征邊界的程度越好。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）的方法表示數(shù)據(jù)。分析各組水迷宮學(xué)習(xí)過程運(yùn)用二因素重復(fù)測(cè)量方差分析，使用最小顯著差異法（least?significant difference，LSD）進(jìn)行事后檢驗(yàn)。對(duì)照組和東莨菪堿組各自注射前后的EMD數(shù)據(jù)對(duì)比運(yùn)用配對(duì)t檢驗(yàn)，曠場(chǎng)下總路程、邊界細(xì)胞放電頻率、EMD 數(shù)值采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 東莨菪堿對(duì)小鼠水迷宮中空間記憶的影響

分別對(duì)兩組小鼠在水迷宮中的表現(xiàn)進(jìn)行分析，東莨菪堿組在學(xué)習(xí)過程中就表現(xiàn)出與對(duì)照組的明顯差異，尋臺(tái)時(shí)間明顯比對(duì)照組長，學(xué)習(xí)速度明顯慢于對(duì)照組。在測(cè)試階段，東莨菪堿組無論是在平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間或穿越平臺(tái)的次數(shù)都明顯少于對(duì)照組（圖1）。以上結(jié)果均表明，注射小劑量東莨菪堿會(huì)導(dǎo)致小鼠空間記憶能力下降。

圖1 東莨菪堿影響小鼠水迷宮中空間記憶Figure 1 Scopolamine affected spatial memory in mouse water maze

2.2 小劑量東莨菪堿對(duì)小鼠曠場(chǎng)行為的影響

利用曠場(chǎng)測(cè)試來判斷東莨菪堿對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)能力的影響。電極植入手術(shù)完成后，兩組小鼠的曠場(chǎng)平均活動(dòng)時(shí)間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過腹腔給藥方式，分別給予兩組小鼠25 μg/kg 東莨菪堿或等體積生理鹽水24 h 后，觀察其曠場(chǎng)活動(dòng)速度。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水對(duì)照組比較，東莨菪堿組的活動(dòng)速度沒有顯著差異（P>0.05，表1）。表明兩組小鼠曠場(chǎng)總路程差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，注射小劑量東莨菪堿不會(huì)影響小鼠的曠場(chǎng)活動(dòng)能力。

表1 注射藥物前后兩組小鼠體重和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的測(cè)試值Table 1 Body weight and open field test value of mice in two groups before and after drug injection

2.3 邊界細(xì)胞分離

分別對(duì)兩組小鼠進(jìn)行曠場(chǎng)測(cè)試并同時(shí)記錄電信號(hào)，在此基礎(chǔ)上成功分離出數(shù)個(gè)信噪比較好的單細(xì)胞Spike信號(hào)，通過分析EMD判斷為邊界細(xì)胞（圖2）。

圖2 分離Spike信號(hào)并通過EMD判斷是否為邊界細(xì)胞Figure 2 Separating spike signals and judging whether they were boundary cells by EMD

2.4 小劑量東莨菪堿對(duì)邊界細(xì)胞放電特征的影響

通過腹腔給藥方式，分別給予兩組小鼠25 μg/kg東莨菪堿或等體積生理鹽水24 h后，觀察給藥前后對(duì)之前分離的邊界細(xì)胞放電頻率的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩組小鼠邊界細(xì)胞的放電頻率差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表2）。結(jié)果表明，注射小劑量東莨菪堿對(duì)邊界細(xì)胞的基礎(chǔ)活動(dòng)沒有明顯影響。

表2 注射藥物前后兩組小鼠邊界細(xì)胞放電頻率變化Table 2 Discharge frequency of border cells in two groups before and after drug injection

2.5 小劑量東莨菪堿對(duì)邊界細(xì)胞EMD的影響

EMD 是反映邊界細(xì)胞空間信息編碼狀態(tài)的重要標(biāo)志，EMD 增加表明邊界細(xì)胞對(duì)空間信息編碼異常。本研究通過腹腔給藥方式，分別給予兩組小鼠25 μg/kg 東莨菪堿或等體積生理鹽水24 h 后，觀察給藥前后對(duì)之前分離的邊界細(xì)胞EMD 的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，注射東莨菪堿后，邊界細(xì)胞EMD明顯增加，邊界細(xì)胞效應(yīng)明顯下降，表明注射小劑量東莨菪堿影響邊界細(xì)胞編碼，影響邊界細(xì)胞行使功能（P<0.05，表3）。

表3 注射藥物前后兩組小鼠邊界細(xì)胞EMD變化Table 3 EMD changes of border cells in two groups before and after drug injection

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，東莨菪堿有快速抗抑郁的效果，但同時(shí)會(huì)產(chǎn)生認(rèn)知學(xué)習(xí)、空間定位能力缺陷等不良反應(yīng)，其作用機(jī)制尚不明確。而RSC的邊界細(xì)胞承擔(dān)著動(dòng)物在迷宮活動(dòng)中判斷迷宮邊界距離及自我中心位置的重要作用［15-16］。在曠場(chǎng)的二維空間內(nèi)，RSC 邊界細(xì)胞的相關(guān)放電會(huì)構(gòu)成動(dòng)物的空間感受野，這種信號(hào)能定位以動(dòng)物自身為中心的坐標(biāo)系。所以通過研究東莨菪堿對(duì)特異存在于RSC 的邊界細(xì)胞的影響，可以幫助找到東莨菪堿誘發(fā)空間定位能力缺陷的原因，對(duì)理解藥理機(jī)制，降低聯(lián)合用藥不良反應(yīng)具有重要意義。

本研究首先通過水迷宮實(shí)驗(yàn)來測(cè)試使用東莨菪堿對(duì)小鼠空間記憶能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，東莨菪堿組在學(xué)習(xí)階段尋臺(tái)時(shí)間明顯比對(duì)照組長，學(xué)習(xí)速度明顯慢于對(duì)照組；在測(cè)試階段，東莨菪堿組無論是在平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間或穿越平臺(tái)的次數(shù)都明顯少于對(duì)照組。結(jié)果表明，注射小劑量東莨菪堿會(huì)導(dǎo)致小鼠空間記憶能力下降。

前人研究結(jié)果表明，邊界細(xì)胞的空間信息編碼對(duì)動(dòng)物的空間定位功能極其重要［6］，邊界細(xì)胞空間信息編碼異常會(huì)導(dǎo)致其空間定位能力下降。所以本研究隨后設(shè)計(jì)了曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，通過曠場(chǎng)測(cè)試同時(shí)記錄電信號(hào)的方法來判斷東莨菪堿是否會(huì)對(duì)小鼠的自發(fā)活動(dòng)能力及邊界細(xì)胞空間信息編碼產(chǎn)生影響。結(jié)果顯示：①注射小劑量東莨菪堿24 h 后，兩組小鼠的曠場(chǎng)活動(dòng)速度差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明注射小劑量東莨菪堿不會(huì)影響小鼠的曠場(chǎng)活動(dòng)能力；②兩組小鼠邊界細(xì)胞的放電頻率差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明這一劑量及作用時(shí)間不會(huì)影響RSC腦區(qū)邊界細(xì)胞的基礎(chǔ)活動(dòng)；③東莨菪堿組的邊界細(xì)胞EMD明顯增加，說明這一劑量及作用時(shí)間可能會(huì)影響RSC腦區(qū)邊界細(xì)胞行使功能。這些結(jié)果說明，注射小劑量東莨菪堿會(huì)導(dǎo)致邊界細(xì)胞空間信息編碼異常。

綜上所述，注射小劑量東莨菪堿會(huì)導(dǎo)致小鼠空間記憶能力下降，并會(huì)導(dǎo)致曠場(chǎng)中小鼠邊界細(xì)胞空間信息編碼異常。而邊界細(xì)胞對(duì)于邊界距離及動(dòng)物自我中心位置的判斷具有重要作用，其相關(guān)放電能標(biāo)定自我中心的坐標(biāo)系定位，邊界細(xì)胞空間信息編碼異常會(huì)導(dǎo)致空間定位障礙。故可以推測(cè)，東莨菪堿可能是通過影響小鼠邊界細(xì)胞空間信息編碼從而影響其空間記憶能力，通過影響邊界細(xì)胞空間信息編碼，從而影響距離判斷，導(dǎo)致自我中心定位出錯(cuò)。但后續(xù)還需進(jìn)一步研究來探討兩者間的直接關(guān)系，可以設(shè)計(jì)T迷宮或Y迷宮等實(shí)驗(yàn)，來監(jiān)測(cè)空間定位過程中邊界細(xì)胞空間信息編碼的變化情況。