閆文升 薛巖 孫幸 楊歡 康潔 康云霄 張國梁

睪酮能增加雄性大鼠的自主運(yùn)動行為、攻擊行為，還有抗焦慮的作用;而睪酮通過影響雄性大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)來改變其行為［1－6］。但睪酮對雌性大鼠的影響國內(nèi)外都研究甚少。本次研究通過曠場實驗來探討長期鼻腔給予丙酸睪丸酮對成年雌性大鼠行為的影響。通過分析曠場行為中各種參數(shù)的變化，來初步了解丙酸睪丸酮對雌性大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 成年雌性Wistar大鼠72只，體重(252±5)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。實驗前所有大鼠在動物飼養(yǎng)室內(nèi)適應(yīng)環(huán)境3 d，12 h亮黑循環(huán)(早6∶00開燈，晚6∶00關(guān)燈)，食物和水供應(yīng)充足。72只大鼠被隨機(jī)分為正常組(Intact)和正常鼻腔給予丙酸睪丸酮組(Intact-T)，鼻腔給藥程序遵循Rojo等［7］的描述方法。正常組大鼠給予芝麻油作為安慰劑(Vehicle)處理，Intact-T大鼠通過鼻腔給予丙酸睪丸酮。

1.2 曠場實驗

1.2.1 實驗裝置:曠場裝置由長 ×寬 ×高為100 cm×100 cm×40 cm的無蓋立方形裝置組成，裝置的四壁為黑色，底為白色，裝置的底被分割成25個正方形大方格(20 cm×20 cm)。每個大方格再分為400個小方格(1 cm×1 cm)。曠場裝置放置一個光強(qiáng)度為20 lux的安靜室內(nèi)，將數(shù)碼攝像機(jī)(Canon HF100，Japan)置于裝置正上方。為了去除氣味，每只大鼠實驗前用70%的乙醇清理廣場底面和四壁。

1.2.2 操作程序:所有大鼠用1%苦味酸溶液標(biāo)記，實驗前5 d，每天用手撫摸每只大鼠進(jìn)行安撫。曠場實驗在大鼠非活動期(8∶00～6∶00)進(jìn)行。在給藥第18天，每只大鼠在曠場裝置中預(yù)暴露5 min，在給藥第19天，每只大鼠在曠場裝置中預(yù)暴露15 min適應(yīng)曠場環(huán)境。在給藥第20、21和22天，每只大鼠依次放在曠場中心區(qū)域，用數(shù)碼攝像機(jī)記錄15 min大鼠曠場行為用于以后分析。

1.2.3 曠場行為參數(shù):曠場裝置被分為中心區(qū)和周圍區(qū)。曠場行為實驗記錄五種行為模式，即靜止聞嗅行為、探索行為、趨觸性行為、運(yùn)動行為和理毛行為(表1)。大鼠曠場行為參數(shù)通過速記法記錄。通過ANOVA統(tǒng)計檢驗發(fā)現(xiàn)第20、21、22天的大多數(shù)行為參數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，因此，大鼠3 d的行為數(shù)據(jù)取平均值后進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

通過曠場實驗共觀察了大鼠的5種行為，正常大鼠鼻腔給予丙酸睪丸酮后其靜止行為(包括靜止聞嗅行為與理毛行為)增加，其活動行為(包括探索行為與運(yùn)動行為)減少。

2.1 靜止聞嗅行為 通過曠場實驗發(fā)現(xiàn)，Intact-T組大鼠鼻腔給予丙酸睪丸酮顯著增加了靜止?fàn)顟B(tài)聞嗅次數(shù)，Intact-T組的靜止?fàn)顟B(tài)聞嗅次數(shù)比正常組增加了47%。見表1、圖1A。

表1 鼻腔給予TP對靜止聞嗅次數(shù)影響n=6，±s

表1 鼻腔給予TP對靜止聞嗅次數(shù)影響n=6，±s

注:與正常組比較，*P ＜0.05

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圖1 鼻腔給予TP對靜聞嗅行為、探索行為、運(yùn)動行為、和理毛行為的影響(*P ＜0.05，#P ＜0.01)

2.2 探索行為 大鼠的探索行為包括行走中聞嗅行為(Walking)、前腿倚靠四壁直立行為(Climbing)、前腿沒有倚靠四壁直立行為(Rearing)和聞嗅行為(Sniffing)。結(jié)果顯示:Intact-T組大鼠鼻腔給予丙酸睪丸酮顯著減少了climbing、rearing和sniffing行為次數(shù)，表現(xiàn)為Intact-T組的三種行為次數(shù)比正常組分別減少了43%、56%、40%。見表2、圖1B。

表2 鼻腔給予TP對探索行為影響n=6，±s

表2 鼻腔給予TP對探索行為影響n=6，±s

注:與正常組比較，*P ＜0.05

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2.3 趨觸行為 通過大鼠在曠場裝置周圍區(qū)域活動時間判斷大鼠的趨觸行為，顯示各組之間曠場裝置周圍區(qū)域活動時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4 運(yùn)動行為 大鼠的運(yùn)動行為包括垂直運(yùn)動、水平運(yùn)動和總徑長。結(jié)果顯示:Intact-T組大鼠鼻腔給予丙酸睪丸酮顯著減少了垂直運(yùn)動、水平運(yùn)動和總徑長，表現(xiàn)為Intact-T組垂直運(yùn)動次數(shù)、水平運(yùn)動次數(shù)和總徑長比正常組分別減少了46%、45%和42%。見表3、圖1C。

表3 鼻腔給予TP對運(yùn)動行為影響n=6，±s

表3 鼻腔給予TP對運(yùn)動行為影響n=6，±s

注:與正常組比較，*P ＜0.05

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2.5 理毛行為 大鼠的理毛行為包括理毛潛伏期、理毛次數(shù)和理毛持續(xù)時間。Intact-T組大鼠鼻腔給予丙酸睪丸酮后理毛潛伏期顯著減少了84%(P＜0.05)。Intact-T組大鼠鼻腔給予丙酸睪丸酮后顯著增加了理毛次數(shù)，延長了理毛持續(xù)時間，表現(xiàn)為Intact-T組的理毛次數(shù)和理毛持續(xù)時間比正常組分別增加了48%和41%。見表4、圖1D。

表4 鼻腔給予TP對理毛行為影響n=6，±s

表4 鼻腔給予TP對理毛行為影響n=6，±s

注:與正常組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01

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3 討論

通過曠場實驗發(fā)現(xiàn)鼻腔給予丙酸睪丸酮的雌性大鼠其靜止聞嗅行為與理毛行為增加;而探索行為中的Walking沒有變化，Climbing、Rearing、Sniffing以及運(yùn)動行為均減少。這些自主行為的變化顯示鼻腔給予丙酸睪丸酮對雌性大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定影響。

丙酸睪丸酮在體內(nèi)可代謝為天然的雄激素從而發(fā)揮生理作用。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠經(jīng)鼻腔給予睪酮其生物利用度可高達(dá)90%［8］。經(jīng)鼻腔給予的睪酮可以通過直接和間接兩種方式轉(zhuǎn)運(yùn)入腦。研究表明，鼻腔給藥后約有2/3的睪酮沒有吸收入血，而是直接從鼻腔轉(zhuǎn)運(yùn)到腦;余下的睪酮先被吸收進(jìn)入體循環(huán)，然后穿過血腦屏障間接轉(zhuǎn)運(yùn)到腦［9］。通過曠場實驗觀察到鼻腔給予丙酸睪丸酮能夠增加雌性大鼠的靜止行為(包括靜止聞嗅行為和理毛行為)，減少其活動行為(包括探索行為和運(yùn)動行為)，暗示鼻腔給藥是睪酮有效入腦的方式。

關(guān)于睪酮對雌性大鼠曠場行為的影響，Stevens等［10］也做了研究，但其研究方法與觀察的行為參數(shù)與本次實驗有所不同。他們在雌性大鼠出生24 h內(nèi)將其皮下注射丙酸睪丸酮，觀察到其45 d時曠場行為—包括運(yùn)動行為和理毛行為與正常雌性大鼠比較均減少30%左右，85 d時的曠場行為只有小幅減少。與本次實驗結(jié)果相比較，丙酸睪丸酮都降低了雌性大鼠運(yùn)動行為參數(shù)，但對理毛行為的影響卻相反，說明新生一過性的丙酸睪丸酮刺激對青春期雌性大鼠與成熟后長期丙酸睪丸酮刺激對雌性大鼠行為的影響不完全相同。這也提示我們丙酸睪丸酮對機(jī)體的影響隨著年齡階段不同而有所不同。

Simerly 等［11，12］應(yīng)用微量透析和高效液相色譜法對麻醉的雄性大鼠鼻腔給予睪酮進(jìn)行研究，顯示睪酮能快速增加雄性大鼠新紋狀體和伏核多巴胺(DA)和5-羥色胺(5-HT)的水平，暗示鼻腔給予睪酮能夠快速激活雄性大鼠的DA能和5-HT能神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致雄性大鼠曠場行為改變，而對雌性大鼠的影響沒有進(jìn)行研究。

1 Frye CA，Seliga AM.Testosterone increases analgesia，anxiolysis，and cognitive performance of male rats.Cogn Affect Behav Neurosci，2001，1:371-381.

2 康云霄，李雙成，高建偉，等.丙酸睪丸酮早期處理對大鼠行為及腦內(nèi)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響.解剖學(xué)雜志，2008，31:655-657.

3 Lumia AR，Thorner KM，McGinnis MY.Effects of chronically high doses of the anabolic androgenic steroid，testosterone，on intermale aggression and sexual behavior in male rats.Physiol Behav，1994，55:331-335.

4 Clark AS，Barber DM.Anabolic-androgenic steroids and aggression in castrated male rats.Physiol Behav，1994，56:1107-1113.

5 McGinnis MY.Anabolic androgenic steroids and aggression:studies using animal models.Ann N Y Acad Sci，2004，1036:399-415.

6 Adler A，Vescovo P，Robinson JK，et al.Gonadectomy in adult life increases tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the prefrontal cortex and decreases open field activity in male rats.Neuroscience，1999，89:939-954.

7 Rojo AI，Montero C，Salazar M，et al.Persistent penetration of MPTP through the nasal route induces Parkinson＇s disease in mice.Eur J Neurosci，2006，24:1874-1884.

8 Hussain AA，Kimura R，Huang CH.Nasal absorption of testosterone in rats.J Pharm Sci，1984，73:1300-1301.

9 Banks WA，Morley JE，Niehoff ML，et al.Delivery of testosterone to the brain by intranasal administration:comparison to intravenous testosterone.J Drug Target，2009，17:91-97.

10 Stevens R，Goldstein R.Effects of neonatal testosterone and progesterone on open-field behaviour in the rat.Q J Exp Psychol，1978，30:157-166.

11 Simerly RB，Chang C，Muramatsu M，et al.Distribution of androgen and estrogen receptor mRNA-containing cells in the rat brain:an in situ hybridization study.J Comp Neurol，1990，294:76-95.

12 de Souza Silva MA，Mattern C，Topic B，et al.Dopaminergic and serotonergic activity in neostriatum and nucleus accumbens enhanced by intranasal administration of testosterone.Eur Neuropsychopharmacol，2009，19:53-63.