趙黎麗，羅佛全，龔海霞，劉添銀△，曹蒙蒙

1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，江西南昌 330006；2.浙江省人民醫(yī)院麻醉科，浙江杭州 310000；3.江西省九江市第一人民醫(yī)院麻醉科，江西九江 332000

有研究表明，在突觸形成高峰期(妊娠期和嬰兒期)幾乎所有全身麻醉藥物都可引起神經(jīng)退行性病變[1]。臨床上大多數(shù)孕婦的非產(chǎn)科手術(shù)是在全身麻醉下完成的。對(duì)胎兒及孕婦而言，孕中期是進(jìn)行非產(chǎn)科手術(shù)最合適的孕期手術(shù)時(shí)間[2]。孕期母體丙泊酚的使用對(duì)子代出生后神經(jīng)行為學(xué)(例如學(xué)習(xí)記憶)的不良影響已有相關(guān)研究證實(shí)[3-7]，但其確切的機(jī)制還在探討中。近期有研究支持microRNAs(miRNAs)在麻醉誘導(dǎo)的神經(jīng)發(fā)育毒性中可能發(fā)揮作用[8]。本研究通過建立孕中期母體丙泊酚麻醉模型，觀察子代認(rèn)知功能的變化，分析子代海馬組織miRNAs表達(dá)譜，試圖尋找差異表達(dá)的miRNAs及進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為治療或預(yù)防孕中期母體丙泊酚麻醉所致的子代神經(jīng)毒性探索新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 本實(shí)驗(yàn)的開展獲南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)所用SD大鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。選擇清潔級(jí)健康SD大鼠30只，其中雄性10只、雌性20只，月齡9～10周，體質(zhì)量270～310 g。采用標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件：室內(nèi)溫度22 ℃，濕度(55±5)%，照明采用自動(dòng)晝夜交替循環(huán)模式，大鼠可自由攝食、飲水。雌雄鼠同籠前進(jìn)行Morris水迷宮(MWM)實(shí)驗(yàn)，判斷其學(xué)習(xí)記憶能力以排除遺傳不良影響。剔除找不到平臺(tái)的大鼠后將雌鼠和雄鼠按2∶1同籠以完成受孕。同籠后實(shí)驗(yàn)員于每日清晨對(duì)雌鼠進(jìn)行陰道涂片，在顯微鏡下陰道涂片發(fā)現(xiàn)精子記為母鼠第1天懷孕。選取孕14 d的母鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為2組，丙泊酚麻醉組(P組)和脂肪乳劑對(duì)照組(C組)，每組10只。

1.2孕鼠干預(yù) 將孕鼠輕柔地固定在自制固定裝置中，鼠尾暴露在外，將鼠尾浸泡在溫水中數(shù)分鐘，清潔表面污物，待鼠尾靜脈擴(kuò)張顯露后用酒精消毒鼠尾，從鼠尾靜脈置入24 G靜脈留置針并固定牢靠。P組經(jīng)鼠尾靜脈留置針靜脈注射誘導(dǎo)劑量丙泊酚20 mg/kg(阿斯利康制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：X17147A)，翻正反射消失后以20 mg/(kg·h)持續(xù)靜脈泵注丙泊酚4 h。C組經(jīng)鼠尾靜脈注射與丙泊酚等劑量的20%中長(zhǎng)鏈脂肪乳劑(廣州百特僑光醫(yī)療用品有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：GM190401)。母鼠麻醉手術(shù)期間采用無創(chuàng)心電監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測(cè)脈搏血氧飽和度、心率，脈搏血氧飽和度<95%的孕鼠剔除本研究。處理結(jié)束后待孕鼠翻正反射恢復(fù)后放回飼養(yǎng)籠繼續(xù)飼養(yǎng)，待其分娩。為排除孕中期單純丙泊酚麻醉可能造成孕鼠內(nèi)環(huán)境紊亂，每組選取6只孕鼠于丙泊酚或脂肪乳劑輸注結(jié)束時(shí)行股動(dòng)脈采血0.5 mL用于動(dòng)脈血?dú)夥治觥Ｋ杏糜趧?dòng)脈血?dú)夥治龅脑惺蟛辉儆糜诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3子鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 子鼠出生后進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)：(1)7 d時(shí)兩組子鼠行懸崖回避實(shí)驗(yàn)；(2)30～34 d時(shí)兩組子鼠行MWM實(shí)驗(yàn)。

1.4子鼠海馬miRNAs芯片檢測(cè)及生物信息學(xué)分析 取出生后7 d和30 d時(shí)的兩組子鼠海馬組織行miRNAs芯片檢測(cè)，并選取數(shù)個(gè)差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)驗(yàn)證。采用在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNAs的靶基因，進(jìn)行KEGG通路富集分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組懸崖回避時(shí)間比較 懸崖回避實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C組懸崖回避時(shí)間為(5.95±1.91)s，P組懸崖回避時(shí)間為(8.18±1.98)s，與C組比較，P組子鼠轉(zhuǎn)身或后退時(shí)間延長(zhǎng)，提示孕中期母體丙泊酚麻醉損傷子鼠早期神經(jīng)發(fā)育。

2.2兩組子鼠逃避潛伏期的比較 在MWM定位航行訓(xùn)練中，P組與C組比較，第4天和第5天逃避潛伏期延長(zhǎng)(P<0.05)，見表1。在MWM空間探索實(shí)驗(yàn)中，各組平臺(tái)穿越次數(shù)比較，P組少于C組(P<0.05)；兩組子鼠靶象限停留時(shí)間和游泳速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。提示孕中期丙泊酚麻醉對(duì)SD大鼠子代學(xué)習(xí)記憶有損傷作用。

表1 兩組子鼠逃避潛伏期的比較

表2 兩組子鼠空間探索實(shí)驗(yàn)的比較

2.3子鼠海馬組織miRNAs芯片檢測(cè)結(jié)果

2.3.1差異表達(dá)的miRNAs 在miRNAs芯片檢測(cè)之前對(duì)抽提的RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，Agilent2100 Nanodrop質(zhì)檢結(jié)果顯示8個(gè)標(biāo)本RNA質(zhì)量均滿足實(shí)驗(yàn)要求，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。miRNAs芯片結(jié)果顯示，以差異倍數(shù)≥2且P<0.05作為差異表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，與C組比較，7 d時(shí)P組子鼠海馬組織有9個(gè)miRNAs表達(dá)水平上調(diào)，包括miR-134-3p、miR-138-2-3p、miR-3068-3p、miR-328b-3p、miR-3552、miR-3572、miR-5132-3p、miR-547-5p、miR-671。與C組比較，30 d時(shí)P組有3個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)，包括miR-374-5p、miR-124-5p、miR-362-3p。

2.3.2miRNAs表達(dá)的驗(yàn)證 選取7 d時(shí)差異表達(dá)miRNAs中的miR-134-3p和30 d時(shí)差異表達(dá)miRNAs中的miR-362-3p進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，與C組比較，P組7 d時(shí)子鼠的miR-134-3p上調(diào)，P組30 d時(shí)子鼠的miR-362-3p下調(diào)，與miRNAs芯片表達(dá)結(jié)果一致。見表3。

表3 miRNAs表達(dá)的驗(yàn)證

2.3.3差異表達(dá)miRNAs生物信息學(xué)分析 采用TargetScan和miRDB兩個(gè)數(shù)據(jù)庫對(duì)7 d和30 d時(shí)差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行預(yù)測(cè)，分別預(yù)測(cè)到1 093個(gè)和312個(gè)靶基因。應(yīng)用在線軟件DAVID軟件進(jìn)行靶基因的KEGG通路富集分析。7 d時(shí)KEGG通路富集分析前20名見圖1，30 d時(shí)KEGG通路富集分析前20名見圖2。

圖1 7 d時(shí)兩組差異表達(dá)miRNAs的靶基因KEGG通路富集分析

圖2 30 d時(shí)兩組差異表達(dá)miRNAs的靶基因KEGG通路富集分析

3 討 論

在本研究中通過給孕中期大鼠尾靜脈注射丙泊酚來探討其對(duì)子代認(rèn)知功能及海馬組織miRNAs表達(dá)的影響。7 d時(shí)子鼠懸崖回避實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示孕中期母體丙泊酚麻醉損傷子鼠早期神經(jīng)發(fā)育。30～34 d時(shí)MWM實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)孕中期母體丙泊酚麻醉會(huì)損傷子代遠(yuǎn)期空間學(xué)習(xí)記憶。孕中期母體丙泊酚麻醉可以改變子鼠海馬組織miRNAs表達(dá)。

有研究表明，麻醉相關(guān)的miRNAs基因靶點(diǎn)參與軸突引導(dǎo)、DNA轉(zhuǎn)錄和蛋白磷酸化相關(guān)的幾個(gè)神經(jīng)發(fā)育通路[9]。因此，確定這些差異表達(dá)的miRNAs的靶點(diǎn)可能有助于闡明介導(dǎo)不同麻醉藥對(duì)神經(jīng)和生理功能作用的具體途徑。本研究取孕中期母體丙泊酚麻醉后子代7 d和30 d時(shí)的海馬組織進(jìn)行miRNAs微陣列分析，尋找差異表達(dá)的miRNAs并進(jìn)行了后續(xù)的生物信息學(xué)分析。7 d時(shí)差異表達(dá)miRNAs的靶基因KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，這些靶基因大量參與神經(jīng)發(fā)育、突觸塑形相關(guān)的生物學(xué)過程，例如樹突形態(tài)發(fā)育、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、學(xué)習(xí)、鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白磷酸化等。同時(shí)它們?cè)诠劝彼崮芡挥|、cGMP-PKG信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、長(zhǎng)時(shí)程抑制、軸突導(dǎo)向、鈣離子信號(hào)通路上都有富集，這些通道與神經(jīng)發(fā)育、突觸塑形都有相關(guān)性。在這些差異表達(dá)的miRNAs分子中，有一些已被研究證實(shí)與神經(jīng)系統(tǒng)功能相關(guān)。miR-134早在2006年就被Nature雜志報(bào)道為一種調(diào)節(jié)樹突棘發(fā)育的腦特異性miRNA[10]。miR-134可以通過下調(diào)大鼠的Limk1/cofilin信號(hào)參與慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)可塑性和類抑郁樣行為[11]。miR-328a可能通過上調(diào)β-分泌酶水平參與戊四氮誘導(dǎo)的大鼠記憶功能障礙[12]。miR-138-5p在體外通過靶向甲狀腺激素受體相互作用蛋白16表達(dá)調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化[13]。7 d和30 d子鼠差異表達(dá)miRNAs未產(chǎn)生過多交集，反映出miRNAs的表達(dá)具有時(shí)間特異性。30 d時(shí)P組差異表達(dá)的miRNAs靶基因KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，預(yù)測(cè)靶基因在生物學(xué)過程、細(xì)胞成分、分子功能與7 d時(shí)已有了很大不同，與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的靶基因減少。嚙齒類動(dòng)物大腦發(fā)育的高峰期主要集中在出生后前2周[14]。7 d時(shí)子鼠處于大腦發(fā)育的高峰期，母體丙泊酚麻醉對(duì)子代神經(jīng)發(fā)育的不良影響可在分子或細(xì)胞水平被觀察到是不難理解的。而30 d時(shí)子鼠的大腦已處于成熟期，故而差異表達(dá)的miRNAs預(yù)測(cè)的靶基因KEGG通路富集分析與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)性減少。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)孕中期母體丙泊酚麻醉損傷子代早期神經(jīng)發(fā)育和遠(yuǎn)期空間學(xué)習(xí)記憶。這可能與子鼠海馬組織miRNAs的表達(dá)譜改變相關(guān)。這些差異表達(dá)的miRNAs靶基因及其相關(guān)通路的研究將為揭示孕中期母體丙泊酚麻醉導(dǎo)致的子代神經(jīng)發(fā)育毒性機(jī)制提供新思路。