孫天驥

(科利特環(huán)能科技(大連)有限公司，遼寧 大連 116021)

全氟辛烷磺酰基化合物(Perfluorooctane sulphonate，PFOS)具有良好的熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性、高表面活性及疏水疏脂性能，被廣泛應(yīng)用于人們的日常生活和工業(yè)生產(chǎn)中，例如，化學(xué)品、化妝品、聚合物添加劑、滅火劑、表面防污劑和電子工業(yè)的各種產(chǎn)品中[1-2].PFOS還具有不易揮發(fā)、難降解、持久性、生物蓄積性和多種毒性的特點，使其在全世界范圍內(nèi)分布廣泛，并嚴(yán)重威脅著人類的安全和健康[3].因此，PFOS作為一種全球性污染物，對于全球環(huán)境影響的廣度和深度以及對于生物圈影響的很多不確定性，已引起了各國科學(xué)工作者的廣泛關(guān)注，使得其成為環(huán)境學(xué)研究的熱點之一.

目前，評價人類體內(nèi)PFOS負(fù)荷的暴露指示物一般通過人體體液，諸如血清和全血等.也有研究顯示指甲也是一種良好的暴露指示物[4-5].但是，血液樣品存在易污染、不易收集、不易儲存運(yùn)輸、樣品濃度受采樣時間影響較大等缺點；指甲樣品雖然成分單一，便于測量，干擾因素較少，但是采集較為困難.事實上，頭發(fā)也可作為PFOS暴露指示物，目前對于頭發(fā)樣品的此類研究比血液樣品要少得多，還缺乏相關(guān)研究數(shù)據(jù)和結(jié)論.與指甲相比，頭發(fā)具有易于采集、貯存和運(yùn)輸?shù)忍攸c，因而適用于大量人群尤其是較為敏感的兒童群體的暴露評價.由于頭發(fā)在生長過程中深入體液，可以反映PFOS的長期暴露并對暴露歷史進(jìn)行追溯[6].作為非損傷性生物基質(zhì)，頭發(fā)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人體內(nèi)微量元素、重金屬的檢測和多氯聯(lián)苯等持久性有機(jī)污染物的暴露評價.本文通過Wistar大鼠的母鼠和子鼠的動物實驗，將子鼠毛發(fā)作為暴露指示物，檢測其對于PFOS的暴露指示作用.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent RRLC/6410B(美國安捷倫科技有限公司)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，DT5-5(BGPLF公司)低速臺式離心機(jī)，MS10(德國IKA公司)磁力攪拌器，ZHWY-334(上海智城分析儀器制造有限公司)多功能脫色搖床.

染毒試劑:PFOS(CAS編號1763-23-1,純度98%)，出廠商：Fluka (Milw-aukee,WI,U.S.A)；

離子對試劑：色譜級四丁基硫酸氫銨(TBAHS)，出廠商：Fluka (Morris Plains,NJ)；

萃取溶劑：甲基叔丁基醚(methyl-tert-butyl ether，MTBE)，出廠商：Sigma-Aldrich (St.Louis,MO,USA)；

復(fù)溶試劑：乙腈acetonitrile (ACN)，出廠商：Sigma-Aldrich (St.Louis,MO,USA)；

高效液相色譜流動相(High performance liquid chromatography，HPLC)：色譜級乙酸銨、色譜級甲醇；

洗滌劑：非離子表面活性劑(1% TritonX-100)；

氫氧化鈉，出廠商：Sigma-Aldrich (St.Louis,MO,USA)；

脫P(yáng)FAAs水(即Milli-Q水)，出廠商：Waters Oasis HLB Plus cartridges (Milford,MA).

1.2 樣品采集與前處理

1.2.1 實驗動物和動物處理 本文采用Wistar大鼠的母鼠和子鼠進(jìn)行實驗，可將母鼠和子鼠的染毒分為4種情況：

(1)母鼠與子鼠均不染毒記為CC組即對照組(子鼠出生前后均無持續(xù)PFOS暴露);

(2)母鼠不染毒而子鼠染毒記為CT組(子鼠出生前不暴露于PFOS，出生后哺乳期的子鼠持續(xù)暴露于PFOS);

(3)母鼠染毒而子鼠不染毒記為TC組(在胚胎期子鼠持續(xù)暴露于PFOS，但出生后子鼠不暴露于PFOS);

(4)母鼠與子鼠均染毒記為TT組(子鼠在胚胎期和哺乳期均持續(xù)暴露于PFOS).

將染毒母鼠和未染毒母鼠分別進(jìn)行配種，母鼠的懷孕周期是21d，待母鼠生育后，再選擇出生后健康的子鼠進(jìn)行培育，飲水中PFOS濃度為5 mg/L的實驗?zāi)甘蠛妥邮蟮木幪栂陆菢?biāo)為5；飲水中PFOS濃度為15 mg/L的實驗?zāi)甘蠛妥邮蟮木幪栂陆菢?biāo)為15.

1.2.2 樣品采集 根據(jù)子鼠毛發(fā)的不同采樣時間PND21(子鼠出生后21 d)、PND28(子鼠出生后28 d)、PND35(子鼠出生后35 d)、母鼠和子鼠的4種染毒情況(CC、CT、TC和TT)以及2種染毒濃度(5 mg/L和15 mg/L)分別將子鼠毛發(fā)剪下，編號裝入干凈的塑料袋中，每組樣品采集5只不同子鼠的毛發(fā)，再將毛發(fā)置于15 mL聚丙烯離心管中.

1.2.3 樣品前處理 根據(jù)一些頭發(fā)中有毒和基本微量金屬含量的研究方法[6]，實驗使用1% TritonX-100洗滌子鼠毛發(fā)樣品，再用脫P(yáng)FOS水超聲振蕩清洗.將子鼠毛發(fā)烘干，稱量并記錄毛發(fā)重量.

將烘干的毛發(fā)樣品置于聚丙烯離心管中，加入1 mL (2.5 mol/L)的NaOH溶液，在80 ℃條件下水浴消化12 h.待子鼠毛發(fā)樣品完全消化后，用5 mol/L的HCl溶液將pH值調(diào)節(jié)至中性.向消化液中加入1 mL四丁基硫酸氫銨(TBAHS)作為離子對試劑，5 mL叔丁基甲醚(TBME)為萃取劑.

振蕩萃取20 min，3 000 rpm離心10 min，取出上層有機(jī)液體置于另一個聚丙烯離心管中，再加入5 mL TBME重復(fù)萃取.將2次萃取的萃取液合并，在50 ℃條件下用平緩氮?dú)饬鞔蹈?加入1 mL乙腈復(fù)溶，渦旋10 s，超聲10 min.

使用尼龍膜過濾，取800 μL于1.5 mL離心管中，50 ℃條件下用平緩氮?dú)饬鞔蹈桑尤?.4 mL乙腈重新溶解，渦旋5 min，加入0.6 mL脫P(yáng)FOS水，超聲10 min.采用LC-MS/MS測定PFOS濃度.

1.2.4 質(zhì)量控制與保證 為避免并控制可能存在的外源性污染，實驗器皿均采用聚丙烯材質(zhì)，使用前用甲醇淋洗2次，每批樣品都設(shè)置全程空白實驗.子鼠毛發(fā)樣品在處理前使用1% TritonX-100進(jìn)行洗滌.為排除外源性污染對本實驗的影響，實驗中設(shè)置對照組，測量環(huán)境中不可控的外源性污染物濃度.本實驗選用T檢驗考察暴露組的差異性是否顯著，分析軟件使用SPSS，置信水平為 α≤0.05.

2 結(jié)果與討論

對照組(即CC組)中的5個子鼠體內(nèi)檢測的PFOS平均濃度不高于1.46E-04 ng/g，其中,單次檢測子鼠體內(nèi)PFOS濃度不高于2.83E-04 ng/g，這個結(jié)果對于PND21、PND28和PND35的組別都是一致的.這說明未經(jīng)過染毒的子鼠體內(nèi)PFOS含量極低.由于這些子鼠是由對照組中未染毒的母鼠所生并喂養(yǎng)，說明對照組中的子鼠在胚胎期和哺乳期的進(jìn)食過程中只存在微量從環(huán)境中被動攝入的PFOS污染物，可以認(rèn)為實驗環(huán)境中無PFOS暴露，因而不會對其它各組子鼠毛發(fā)中PFOS濃度的研究結(jié)果產(chǎn)生影響.

對于CT組和TC組，當(dāng)采樣時間為PND21且無論染毒濃度為5 mg/L或15 mg/L，在胚胎期(TC組)子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS平均濃度均高于哺乳期(CT組)(見圖1)，說明子鼠在胚胎期經(jīng)由暴露組中母鼠所生的攝入途徑，比從哺乳期經(jīng)由暴露組中的母鼠所喂養(yǎng)的攝入途徑更容易富集PFOS污染物.

當(dāng)采樣時間為PND28時，若染毒濃度為15 mg/L時，TC組子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS平均濃度仍高于CT組，但是當(dāng)染毒濃度為5 mg/L時，TC組子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS平均濃度卻低于CT組(見圖2)，這說明采樣時間達(dá)到28 d時，TC組子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS平均濃度開始明顯下降，表明該組子鼠對PFOS的排泄能力開始顯現(xiàn).

當(dāng)采樣時間為PND35時，無論染毒濃度為5 mg/L還是15 mg/L時，CT組子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS平均濃度反過來都高于TC組(見圖3)；在染毒濃度分別為5 mg/L和15 mg/L的情況下，PND35的P值分別為0.059和0.128(Sig雙側(cè))均大于0.05，說明數(shù)據(jù)差異顯著.這說明當(dāng)采樣時間達(dá)到35 d時，在TC組子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS平均濃度開始明顯下降，表明在TC組子鼠對于PFOS的排泄能力持續(xù)作用下，其體內(nèi)PFOS平均濃度下降.

圖1所示染毒濃度為5 mg/L和15 mg/L時，分別從PND21中每組5個采樣子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS濃度平均值在CT組中差別不大，而在TC組差別較大.并且TC組的PFOS濃度平均值高于CT組.

圖2所示，染毒濃度為5 mg/L和15 mg/L時，分別從PND28中每組5個采樣子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS濃度平均值在CT組中差別不大，而在TC組差別較大，染毒濃度為5 mg/L時TC組子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS濃度已經(jīng)低于CT組.

圖3所示，在CT組和TC組中，染毒濃度為5 mg/L和15 mg/L時，分別從PND35中每組5個采樣子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS濃度平均值差別不大，而CT組的PFOS濃度平均值已經(jīng)高于TC組.

從圖3還可以看到，出生時間為PND35時，無論CT組還是TC組，PFOS暴露濃度為5 mg/L的子鼠與PFOS暴露濃度為15 mg/L的子鼠體內(nèi)的PFOS濃度平均值都基本相當(dāng).這說明PFOS攝入量的增加對哺乳期和胚胎期子鼠的PFOS暴露負(fù)荷影響不大，這意味著在哺乳期和胚胎期內(nèi)子鼠富集PFOS的能力有限.

對于由暴露于PFOS的母鼠生育并繼續(xù)哺乳的TT組的子鼠(見圖4～6)，染毒濃度為5 mg/L時,PND28的每組5個采樣子鼠毛發(fā)中PFOS濃度平均值為1.20E-02 ng/g；而染毒濃度為15 mg/L時，PND28的每組5個采樣子鼠毛發(fā)中PFOS濃度平均值為2.37E-02 ng/g.對于PND35的每組5個采樣子鼠，染毒濃度為5 mg/L時，子鼠毛發(fā)中PFOS濃度平均值為7.78E-03 ng/g，而染毒濃度為15 mg/L時，子鼠毛發(fā)中PFOS濃度平均值為1.51E-02 ng/g(見圖6);可見，染毒濃度為15 mg/L的子鼠毛發(fā)中PFOS濃度的平均值幾乎是染毒濃度為5 mg/L時的2倍，這與CT組和TC組的情況不同.由此可以看出，與CT組和TC組相比，TT組子鼠體內(nèi)PFOS負(fù)荷在出生后一個月內(nèi)快速增長.這說明，在胚胎期與哺乳期中子鼠連續(xù)暴露于PFOS的情況下，TT組的子鼠毛發(fā)中PFOS濃度在一個月內(nèi)(28 d)的增長很迅速，而且染毒濃度越高子鼠毛發(fā)中PFOS濃度的平均值越大.從圖6還可以看出，兩種染毒濃度情況下的數(shù)據(jù)雖有一定波動，但是，當(dāng)子鼠出生一個月后(例如35 d)，其毛發(fā)中PFOS濃度都呈現(xiàn)了下降趨勢，當(dāng)染毒濃度為15 mg/L時，下降趨勢更為明顯.這表明子鼠對于PFOS有一定的排泄能力，而且對較高濃度的PFOS有較強(qiáng)的排泄能力.

對于PND21的每組5個采樣子鼠，在染毒濃度分別為5 mg/L和15 mg/L 時，檢測出的子鼠毛發(fā)中PFOS濃度的平均值存在CT組

圖4所示，TT組中，在染毒濃度為5 mg/L和15 mg/L時，分別從PND28 中每組5個采樣子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS暴露濃度.

圖5所示，TT組中，在染毒濃度為5 mg/L和15 mg/L時，分別從PND35中每組5個采樣子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS暴露濃度.

圖6所示，TT組中，染毒濃度為5 mg/L和15 mg/L時,PND35中每組5個采樣子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS濃度平均值低于PND28的PFOS濃度平均值.

圖1 染毒濃度為5 mg/L和15 mg/L時，分別從PND21 圖2 染毒濃度為5 mg/L和15 mg/L時，分別從PND28中中每組5個采樣子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS濃度平均值 每組5個采樣子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS濃度平均值

圖3 染毒濃度為5 mg/L和15 mg/L時，分別從PND35 圖4 染毒濃度為5 mg/L和15 mg/L時，分別從 中每組5個采樣子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS濃度平均值PND28中 每組5個采樣子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS暴露濃度

圖5 染毒濃度為5 mg/L和15 mg/L時，分別從 圖6 染毒濃度為5 mg/L和15 mg/L時,PND35 PND35中每組5個采樣子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS暴露濃度 中每組5個采樣子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS濃度平均值

圖7所示，當(dāng)采樣時間為21 d時，染毒濃度為5 mg/L/和15 mg/L時，分別從PND21中每組5個采樣子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS濃度平均值，可見CT組

圖8所示，當(dāng)采樣時間為35 d時，染毒濃度為5 mg/L和15 mg/L時，分別從PND35中每組5個采樣子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS濃度平均值，可見TC組

圖7 染毒濃度為5 mg/L/和15 mg/L時，分別從PND21 圖8 染毒濃度為5 mg/L和15 mg/L時，分別從PND35 中每組5個采樣子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS濃度平均值 中每組5個采樣子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS濃度平均值

根據(jù)上述4種染毒情況下子鼠毛發(fā)中PFOS的檢測結(jié)果，本實驗采用的方法可以明顯分辨出子鼠在胚胎期與哺乳期期間對于不同濃度的PFOS的暴露差異.因此，依據(jù)該實驗方法可以通過對子鼠毛發(fā)中PFOS濃度的測量，準(zhǔn)確地反映出子鼠在胚胎期和哺乳期中PFOS的暴露情況.上述實驗結(jié)果表明，本實驗所采用的PFOS分析方法是有效可行的，可以依據(jù)此方法繼續(xù)進(jìn)行人體頭發(fā)中PFOS暴露情況的研究.

3 結(jié)論

本項研究采用大鼠的子鼠毛發(fā)作為其體內(nèi)PFOS的暴露指示物，實驗結(jié)果表明，隨著胚胎期和哺乳期子鼠攝入PFOS濃度的增加，在毛發(fā)中檢測出的PFOS濃度也相應(yīng)地增加，由此可以建立子鼠毛發(fā)中PFOS的檢測分析方法.根據(jù)本實驗可以得出以下結(jié)論：在胚胎期和哺乳期持續(xù)染毒的子鼠(TT組)對于PFOS的暴露最強(qiáng)；當(dāng)子鼠出生時間在3周內(nèi)，例如PND21，胚胎期子鼠對于PFOS的暴露強(qiáng)于哺乳期子鼠的暴露；而當(dāng)子鼠出生時間達(dá)到5周時，哺乳期子鼠對于PFOS的暴露略強(qiáng)于胚胎期子鼠的暴露，說明在子鼠出生1個月后，胚胎期子鼠對于PFOS的排泄因素開始顯現(xiàn).由于子鼠具有對于PFOS的排泄能力，哺乳期(CT組)和胚胎期(TC組)子鼠對于PFOS的富集能力有限，染毒濃度的多少對于CT組和TC組中子鼠毛發(fā)的PFOS濃度平均值影響不大.對于TT組，染毒濃度對于子鼠毛發(fā)中檢測的PFOS濃度平均值有正相關(guān)影響.TT組的子鼠對PFOS同樣有一定的排泄能力，排泄能力在出生1個月后較為明顯，而且對較高濃度的PFOS的排泄能力較強(qiáng)，PFOS暴露濃度存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系.這些結(jié)論的深層原因待后續(xù)實驗進(jìn)一步研究.上述實驗結(jié)論推廣到以頭發(fā)作為PFOS的暴露指示物分析人類嬰幼兒體內(nèi)PFOS暴露情況，具有可行性.