陳瑋婷，夏朝水，陳昌銘，廖巧玲，曹奕鴦，陳仕朋，郭蕓瑋

(三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 a花卉研究所，b旱地作物研究所，福建 沙縣 365500)

非洲菊(GerberajamesoniiL.)又名扶郎花，為菊科大丁草屬多年生草本花卉，是世界五大鮮切花之一，具有重要經(jīng)濟(jì)觀賞價(jià)值[7-8]。在實(shí)際生產(chǎn)中，非洲菊大多采用露地或簡易大棚栽培，冬天的持續(xù)低溫和夏天的棚內(nèi)高溫等原因均可造成非洲菊干旱或者間歇性干旱，導(dǎo)致非洲菊產(chǎn)量和切花品質(zhì)下降，造成嚴(yán)重?fù)p失[9]。因此，探究改善非洲菊對(duì)干旱脅迫適應(yīng)能力的有效栽培措施十分關(guān)鍵。

印度梨形孢(Piriformosporaindica)是印度科學(xué)家Verma在西北部沙漠地區(qū)灌木叢根部分離出的一種內(nèi)生真菌，屬于擔(dān)子菌門層菌綱梨形孢屬，其與叢枝菌根真菌的功能特性極為相似，在寄主植物的根際定殖，并產(chǎn)生復(fù)雜的互利共生作用，有助于提高植物抵御生物和非生物逆境脅迫的耐受力[10]。相關(guān)報(bào)道表明，印度梨形孢可以通過影響抗氧化酶系統(tǒng)來減少ROS的形成[11]。水稻幼苗接種印度梨形孢后可降低鹽脅迫下葉片的MDA含量，提高抗氧化酶活性及脯氨酸、葉綠素、可溶性糖和可溶性蛋白含量，從而增強(qiáng)水稻幼苗對(duì)鹽脅迫的耐受性[12]。印度梨形孢與紫花苜蓿共生可以促進(jìn)干旱脅迫下紫花苜蓿生長，主要是通過刺激SOD、POD、CAT活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的累積來抵抗干旱逆境[13]。接種印度梨形孢的棉花通過增強(qiáng)光合作用和促使根系伸長、增粗，側(cè)生根數(shù)量增加而促進(jìn)棉花生長，并且通過維持葉片水分和溫度，保持幼苗葉片的色素含量和含水量，維持正常的生理代謝，提高棉花苗期的抗旱性[14]。目前已有大量研究探討印度梨形孢對(duì)植物生長發(fā)育的作用，提高不同植物應(yīng)對(duì)非生物和生物脅迫的抗性，包括滲透脅迫、高溫脅迫、低溫脅迫、病蟲害侵染等[15]。但關(guān)于印度梨形孢與菊科植物共生及相關(guān)滲透脅迫等方面的研究甚少，Chen等[16]初步研究發(fā)現(xiàn)，接種印度梨形孢可顯著提高非洲菊組培苗耐鹽性。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)進(jìn)一步探究印度梨形孢對(duì)非洲菊幼苗生長及抗旱性的影響，明確印度梨形孢對(duì)非洲菊干旱脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)理，旨在為花卉的綠色栽培、抗旱性栽培研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為非洲菊(GerberajamesoniiL.)品種‘云南紅’，來源于三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院國家非洲菊種質(zhì)資源庫收集的品種。印度梨形孢(Piriformosporaindica)真菌菌株由臺(tái)灣大學(xué)植物科學(xué)研究所葉開溫教授提供，三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院花卉研究所實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)處理

試驗(yàn)在三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院作物遺傳改良與創(chuàng)新利用實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.1 菌懸液的制備 取在PDB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d的印度梨形孢菌液，4 ℃、8 000g離心15 min后用ddH2O清洗3遍，加入ddH2O制備菌懸液,將菌懸液攪碎后調(diào)節(jié)吸光度OD600至0.8備用[17]。

1.2.2 印度梨形孢對(duì)非洲菊幼苗生長的影響試驗(yàn) 將非洲菊組培苗接種于生根培養(yǎng)基(0.5 mg/L NAA、0.5 mg/L激動(dòng)素和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%蔗糖、0.2%活性炭、0.7%瓊脂)，21 d后選擇長勢(shì)均勻一致的非洲菊組培苗移栽于直徑9 cm、高8 cm的塑料盆中，栽培基質(zhì)由泥炭土、黃土、珍珠巖按質(zhì)量比3∶1∶1配成，在25 ℃、相對(duì)濕度70%～75%、白天光照12 h的條件下正常培養(yǎng)。試驗(yàn)設(shè)處理組(澆灌印度梨形孢菌液)和對(duì)照組(澆灌ddH2O，CK)，每個(gè)處理24株，每周澆灌50 mL印度梨形孢菌液或ddH2O，共澆灌4次，試驗(yàn)持續(xù)30 d。澆灌結(jié)束緩苗7 d后進(jìn)行干旱脅迫試驗(yàn)，將幼苗充分澆透后采用自然干旱處理[1]，設(shè)非脅迫處理為對(duì)照，14 d后對(duì)幼苗完全展開第3片葉進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定，每指標(biāo)重復(fù)3次。

工況一，開挖深度為1.38 m，至第一道內(nèi)支撐位置；工況二，開挖深度為7.33 m，至第二道內(nèi)支撐位置；工況三，開挖深度為12.38 m，至第三道內(nèi)支撐位置；工況四，開挖深度為18.26 m，至基坑底部.

1.2.3 印度梨形孢在非洲菊幼苗根部定殖情況觀察 印度梨形孢菌液處理非洲菊幼苗30 d后，采集健康新鮮的根部樣本(每樣本3個(gè)生物學(xué)重復(fù))迅速放入液氮，混合均勻后磨樣，每份樣品稱取0.1 g，置于-80 ℃冰箱低溫保存。采用Kumar等[18]的染色方法，將根部切片先用體積分?jǐn)?shù)2%氫氧化鉀浸泡3 min，體積分?jǐn)?shù)0.05%臺(tái)盼藍(lán)染色7 min，再用ddH2O緩慢沖洗3～4遍后制片，用BX53光學(xué)顯微鏡(Olympus，Shinjuku，Tokyo，Japan)觀察印度梨形孢在非洲菊幼苗根部的定殖情況。

采用Chang等[19]的方法提取非洲菊幼苗根部總RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Takara Bio Inc.，Shiga，Japan)試劑盒合成cDNA，以印度梨形孢PiTef1基因、非洲菊GjActin為內(nèi)參基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列分別為PiTef1-F(5′-GGCCACCGTGACTTTATCAA-GAAC-3′)、PiTef1-R(5′-TTCCTTGACGATTT-CGTTGAAGCG-3′)和GjActin-F(5′-ATGGTGA-ACTCCCACACTCAGAAG-3′)、GjActin-R(5′-CAGGATGAAGATGAGGATGACAAGA-3′)，以鑒定印度梨形孢的定殖情況。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 生長指標(biāo) 印度梨形孢菌液處理非洲菊幼苗30 d后，分別收集2組非洲菊幼苗地上部和根部樣品，測(cè)定地上部鮮質(zhì)量、葉片數(shù)、葉柄長以及根部鮮質(zhì)量、根數(shù)、根長。

1.3.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù) 取干旱脅迫前后各組非洲菊幼苗葉片，經(jīng)黑暗條件馴化30 min后，用葉綠素?zé)晒鈨xMini-PAM-Ⅱ(WALZ，Germany)測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)，包括PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)和表觀光合電子傳遞速率(ETR)。

1.3.3 光合色素含量 取干旱脅迫前后各組非洲菊幼苗葉片，按照Wintermans和Mots[20]的方法提取葉綠素。使用Infinite M200酶標(biāo)儀(Tecan，Switzerland)在665和649 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量；類胡蘿卜素含量測(cè)定采用Sumanta等[21]的方法，以甲醇萃取葉片上清液，使用Infinite M200酶標(biāo)儀(Tecan，Switzerland)測(cè)定470，652和665 nm下的吸光度，計(jì)算類胡蘿卜素(Caroteniods)含量。

1.3.4 相對(duì)含水量和含水量 取干旱脅迫前后各組非洲菊幼苗葉片，測(cè)定鮮質(zhì)量，然后在65 ℃烘箱中烘2 d后測(cè)定干質(zhì)量。計(jì)算相對(duì)含水量和含水量。

1.3.5 氣孔觀察 采取指甲油印痕法[22]，將指甲油均勻涂抹在植物下表皮，靜置10 min后剪取透明膠帶黏貼于葉片上，撕下透明膠帶并置于載玻片，在顯微鏡下選取3個(gè)視野進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)保衛(wèi)細(xì)胞彎曲角度，計(jì)算氣孔開放度。

1.3.6 抗氧化酶活性 CAT活性采用紫外吸收法[23]測(cè)定，APX活性參照Nakano和Asada[24]的方法測(cè)定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法[25]測(cè)定，SOD活性采用SOD活性檢測(cè)試劑盒(Solarbio)測(cè)定。

1.3.7 MDA含量測(cè)定 MDA含量采用MDA含量檢測(cè)試劑盒(Solarbio)測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，采用t-test檢驗(yàn)干旱脅迫處理下非洲菊幼苗指標(biāo)差異顯著性(P<0.05)。利用Excel 2010軟件制圖，圖表中數(shù)據(jù)均為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 印度梨形孢對(duì)非洲菊幼苗生長的影響

觀察發(fā)現(xiàn)，用印度梨形孢菌液處理非洲菊幼苗30 d后，處理組非洲菊幼苗比對(duì)照組更粗壯、葉片更綠、生長更旺盛。由表1可知，處理組非洲菊幼苗地上部鮮質(zhì)量為3.29 g/株，較對(duì)照組極顯著增加85.00%(P<0.01)；處理組非洲菊幼苗葉片數(shù)和根數(shù)分別較對(duì)照組顯著增加12.50%和25.00%(P<0.05)；處理組非洲菊幼苗葉柄長16.29 cm，較對(duì)照組極顯著提高46.23%；處理組非洲菊幼苗根部鮮質(zhì)量為0.46 g/株，是對(duì)照組的1.92倍；處理組非洲菊幼苗根長為16.39 cm，極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。可見印度梨形孢能促進(jìn)非洲菊幼苗生長。

表1 印度梨形孢對(duì)非洲菊幼苗生長的影響Table 1 Effects of Piriformospora indica treatment on growth of gerbera seedlings

2.2 印度梨形孢在非洲菊幼苗根部的定殖

用印度梨形孢菌液處理非洲菊幼苗30 d后，取根部組織進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察定殖情況。結(jié)果(圖1)表明，印度梨形孢的孢子定殖于非洲菊幼苗根部細(xì)胞內(nèi)，其孢子呈藍(lán)色梨形狀。

圖1 印度梨形孢在非洲菊根部的定殖情況(×400)Fig.1 Colonization of Piriformospora indica on gerbera roots after co-cultivation(×400)

對(duì)印度梨形孢PiTef1基因進(jìn)行RT-PCR，如圖2所示，僅在處理組非洲菊幼苗根部檢測(cè)到PiTef1基因，進(jìn)一步證實(shí)印度梨形孢已成功定殖于非洲菊根部。

圖2 印度梨形孢在非洲菊根部定殖的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of the colonization of Piriformospora indica in roots of gerbera seedlings

2.3 干旱脅迫下印度梨形孢對(duì)非洲菊幼苗生長的影響

由圖3可知，干旱脅迫14 d后，對(duì)照組非洲菊幼苗葉片出現(xiàn)了嚴(yán)重萎蔫與褪綠，處理組非洲菊幼苗葉片輕微下垂，褪綠現(xiàn)象不明顯。

圖3 干旱脅迫下印度梨形孢對(duì)非洲菊幼苗生長的影響Fig.3 Effects of Piriformospora indica treatment on growth of gerbera seedlings under drought stress

2.4 干旱脅迫下印度梨形孢對(duì)非洲菊幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

葉綠素?zé)晒鈪?shù)是代表植物光合生理與逆境脅迫關(guān)系的重要參數(shù)。由圖4可知，在未脅迫情況下，處理組非洲菊幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)與對(duì)照組均無顯著差異(P>0.05)。在干旱脅迫下，處理組非洲菊幼苗葉片的Fv/Fm和qP分別為0.825和0.655，均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，說明印度梨形孢能保護(hù)非洲菊光系統(tǒng)反應(yīng)中心，緩解干旱脅迫對(duì)非洲菊幼苗造成的光抑制；而處理組非洲菊幼苗葉片的NPQ和ETR均與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。

* 表示與對(duì)照組相比在P<0.05水平差異顯著，** 表示與對(duì)照組相比在P<0.01水平差異極顯著。下同 * indicates significant differences at P<0.05 level and ** indicates significant differences at P<0.01 level.The same below圖4 干旱脅迫下印度梨形孢對(duì)非洲菊幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Fig.4 Effects of Piriformospora indica on chlorophyll fluorescence parameters of gerbera seedlings under drought stress

2.5 干旱脅迫下印度梨形孢對(duì)非洲菊幼苗葉片光合色素的影響

葉綠素和類胡蘿卜素是光化學(xué)反應(yīng)的2種主要光合色素，其對(duì)光合作用至關(guān)重要，干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致光合色素的降解。干旱脅迫下印度梨形孢對(duì)非洲菊葉片光合色素的影響見圖5。

圖5 干旱脅迫下印度梨形孢對(duì)非洲菊葉片光合色素的影響Fig.5 Effects of Piriformospora indica on photosynthetic pigments of gerbera leaves under drought stress

由圖5可知，在未脅迫情況下，處理組非洲菊幼苗葉片中葉綠素和類胡蘿卜素含量與對(duì)照組均無顯著差異(P>0.05)。在干旱脅迫下，處理組非洲菊幼苗葉片中的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量分別為0.93，0.44和1.36 mg/g，均與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；對(duì)照組與處理組非洲菊幼苗葉片中的類胡蘿卜素含量分別為10.83和12.64 mg/g，差異不顯著(P>0.05)。說明在干旱脅迫下，印度梨形孢可能是通過減緩葉片細(xì)胞中葉綠素降解，減少干旱對(duì)光合作用的損傷。

2.6 干旱脅迫下印度梨形孢對(duì)非洲菊幼苗葉片相對(duì)含水量和含水量的影響

干旱脅迫下印度梨形孢對(duì)非洲菊幼苗相對(duì)含水量和含水量的影響見圖6。

圖6 干旱脅迫下印度梨形孢對(duì)非洲菊幼苗相對(duì)含水量和含水量的影響Fig.6 Effects of Piriformospora indica on relative water content and water content of gerbera seedlings under drought stress

葉片含水量能直接反映植物水分盈虧程度和植物的保水能力，是植物抗旱能力的重要依據(jù)。由圖6可知，在未脅迫情況下，處理組非洲菊幼苗葉片中相對(duì)含水量、含水量與對(duì)照組均無顯著差異(P>0.05)。在干旱脅迫下，處理組和對(duì)照組非洲菊幼苗葉片中相對(duì)含水量分別為33.73%和21.82%，處理組非洲菊幼苗葉片相對(duì)含水量較對(duì)照組顯著增加54.60%(P<0.05)；處理組和對(duì)照組非洲菊幼苗葉片中含水量分別為73.70%和44.40%，二者差異極顯著(P<0.01)。說明在干旱脅迫下印度梨形孢可提高非洲菊幼苗葉片的保水能力。

2.7 干旱脅迫下印度梨形孢對(duì)非洲菊幼苗葉片氣孔的影響

氣孔的調(diào)節(jié)能力是影響植物干旱脅迫防御的重要因素。通過光學(xué)顯微鏡觀察干旱脅迫前后處理組和對(duì)照組非洲菊幼苗葉片氣孔開閉情況，結(jié)果見圖7和圖8。

圖7 干旱脅迫下印度梨形孢對(duì)非洲菊氣孔開閉的影響圖8 干旱脅迫下非洲菊幼苗葉片的氣孔開放度 Fig.7 Effects of Piriformospora indica on stomatal apertures of gerbera seedlings under drought stress Fig.8 Stomatal apertures of gerbera seedlings leaves of Piriformospora indica under drought stress

由圖7和圖8可以看出，在未脅迫情況下，處理組與對(duì)照組非洲菊幼苗葉片氣孔開放度差異不顯著(P>0.05)；在干旱脅迫下，處理組與對(duì)照組非洲菊幼苗葉片氣孔開放度分別為148.03°和147.47°，也無顯著差異(P>0.05)。說明在干旱脅迫下處理組和對(duì)照組非洲菊幼苗葉片氣孔均處于微張狀態(tài)。

2.8 干旱脅迫下印度梨形孢對(duì)非洲菊幼苗抗氧化酶活性和MDA含量的影響

干旱脅迫下植物體內(nèi)的抗氧化酶相互協(xié)同作用，以抵抗活性氧造成的毒害。由表2可知，在未脅迫情況下，處理組非洲菊幼苗葉片中抗氧化酶活性、丙二醛含量與對(duì)照組均無顯著差異(P>0.05)。在干旱脅迫下，處理組非洲菊幼苗葉片中CAT、SOD活性與對(duì)照組均無顯著差異(P>0.05)；處理組非洲菊幼苗葉片中APX活性為對(duì)照組的6.46倍(P<0.01)，而POD活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

MDA是膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，是膜損傷程度的主要指標(biāo)。由表2可見，在干旱脅迫下，處理組非洲菊葉片中MDA含量較對(duì)照組顯著減少33.02%(P<0.05)。說明印度梨形孢可有效降低非洲菊膜脂過氧化程度，增強(qiáng)幼苗對(duì)干旱脅迫的耐受能力。

表2 干旱脅迫下印度梨形孢對(duì)非洲菊幼苗葉片抗氧化酶活性和MDA含量的影響Table 2 Effects of Piriformospora indica on anti-oxidative enzyme activities and MDA content in leaves of gerbera seedlings under drought stress

3 討 論

印度梨形孢對(duì)宿主植物的促生作用已在多種植物中被證實(shí)，如用印度梨形孢定殖甘薯后可以提高甘薯葉片光合色素含量和光合效率，進(jìn)而提高其地上部和地下部的生物量[17]；也有報(bào)道指出，印度梨形孢可定殖于文心蘭根部，促進(jìn)文心蘭生長量及根的形成[26]。本研究中，處理組非洲菊幼苗地上部鮮質(zhì)量、葉片數(shù)、葉柄長以及根部鮮質(zhì)量、根數(shù)、根長均顯著增加，這與前人研究結(jié)果[16]一致，說明印度梨形孢對(duì)非洲菊生長具有促進(jìn)作用。

印度梨形孢對(duì)黑麥草的侵染未顯著改變?nèi)~綠素?zé)晒鈪?shù)NPQ、PSⅡ非調(diào)節(jié)性能量耗散(YNO)、PSⅡ調(diào)節(jié)性能量耗散(YN-PQ)和ETR，但顯著提高了PSⅡ的實(shí)際光合量子產(chǎn)量(Y(Ⅱ))和qP，說明印度梨形孢提高了黑麥草葉片對(duì)光能的轉(zhuǎn)化及利用效率[27]，這與本研究在干旱脅迫下經(jīng)印度梨形孢處理的非洲菊幼苗葉片中的Fv/Fm、qP顯著升高結(jié)果相似，說明在干旱脅迫下印度梨形孢定殖的非洲菊幼苗能更多地將吸收的光能用于光化學(xué)反應(yīng)，從而提高光能利用效率，緩解干旱對(duì)光合機(jī)構(gòu)的損傷。葉綠素反映植物光合能力，類胡蘿卜素具有吸收、傳遞光能及光保護(hù)功能，同時(shí)可反映植物受脅迫情況[28]。本研究中，干旱脅迫下處理組非洲菊幼苗葉片中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量均顯著高于對(duì)照組，說明在干旱脅迫下印度梨形孢能夠緩解非洲菊幼苗葉片葉綠素的降解，在一定程度上保護(hù)光合系統(tǒng)，這與在芝麻[29]、煙草[30]上的研究結(jié)果一致。干旱脅迫下，處理組非洲菊幼苗葉片中含水量、相對(duì)含水量顯著高于對(duì)照組，說明印度梨形孢可以顯著提高非洲菊植株葉片的保水能力，減輕干旱引起的水分脅迫。然而，氣孔觀察結(jié)果顯示，處理組非洲菊幼苗葉片氣孔開放度與對(duì)照組無顯著差異，均處于開放狀態(tài)，因此推測(cè)，印度梨形孢提高非洲菊幼苗抗旱能力可能與氣孔開合調(diào)節(jié)機(jī)制無關(guān)。

本研究中，在干旱脅迫條件下印度梨形孢定殖能極顯著提升非洲菊幼苗葉片的APX活性。研究表明，干旱脅迫下3種百合花APX活性穩(wěn)定增長并在后期依然保持較高活性，說明APX是百合受到干旱脅迫時(shí)的主要抗氧化酶[6]。任婧瑤等[31]發(fā)現(xiàn)，耐旱花生品種中APX活性顯著高于不耐旱花生品種，推測(cè)APX在花生耐旱能力上具有重要作用，是調(diào)節(jié)花生植株活性氧平衡的重要保護(hù)酶。當(dāng)植物受到干旱脅迫時(shí)，膜脂發(fā)生過氧化損傷且MDA含量顯著上升，MDA作為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，被認(rèn)為是干旱引起氧化損傷的重要指標(biāo)[32]。本研究結(jié)果顯示，在干旱脅迫下，印度梨形孢可顯著降低非洲菊幼苗葉片MDA含量，說明印度梨形孢能減輕膜脂過氧化程度，緩解干旱脅迫帶來的負(fù)面影響，在大白菜[33]、油菜[34]中也有相似結(jié)果。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下印度梨形孢可提高非洲菊APX活性, 有效降低干旱脅迫下過氧化物積累，從而提高非洲菊幼苗的抗旱能力。另外，印度梨形孢提高非洲菊抗旱性的作用也可能是通過提高光合系統(tǒng)效率或提高滲透物質(zhì)含量、調(diào)節(jié)離子平衡等[35]實(shí)現(xiàn)的。有關(guān)印度梨形孢提高非洲菊幼苗耐旱性的復(fù)雜機(jī)理仍需要進(jìn)一步深入研究。