陳燕濤，趙 坤，祖良鵬，景夢(mèng)娜，張艷紅，郭 鋒

(河南科技學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

隨著現(xiàn)代基因?qū)W技術(shù)的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物基因組RNA中90%以上的RNA為非編碼RNA (non-coding RNA)，按照其長(zhǎng)度不同可分為短鏈非編碼RNA(short non-coding RNA,sncRNA)和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)[1]。lncRNA的長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸，其很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)被視作“轉(zhuǎn)錄噪音”。但近些年，越來(lái)越多的研究表明，lncRNA能從表觀遺傳學(xué)修飾、轉(zhuǎn)錄、前體mRNA可變剪切、mRNA穩(wěn)定性及翻譯等多層面對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[2-3]，在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生及免疫反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

先天性免疫反應(yīng)是機(jī)體抵抗病原微生物感染的第一道防線。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在調(diào)節(jié)先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[4]。如Du等[5]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA Mirt2能顯著抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠外周血巨噬細(xì)胞、氣管上皮細(xì)胞以及肝細(xì)胞中腫瘤壞死因子(TNF-α)、IL-1β、IL-6以及IL-12等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)；通過(guò)尾靜脈注射慢病毒，給予小鼠外源性Mirt2，能有效地緩解LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥。小鼠髓源性巨噬細(xì)胞中表達(dá)的lincRNA-Cox2能對(duì)多種炎癥刺激物如細(xì)菌LPS和脂蛋白(Pam3CSK4)、李斯特菌以及仙臺(tái)病毒等做出反應(yīng)。LincRNA-Cox2能與RNA結(jié)合蛋白互作，抑制抑制趨化因子5 (chemokine 5，Ccl5)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子1(signal transducer and activator of transcription 1，Stat1)及Toll樣受體7 (Toll-like receptor 7，Tlr7) 等免疫相關(guān)基因的表達(dá)[6]。Rapicavoli等[7]在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上的研究也發(fā)現(xiàn)，炎癥刺激物TNF-α和IL-1β能誘導(dǎo)lncRNA Lethe的表達(dá)，Lethe通過(guò)與p65蛋白互作，抑制p65與炎癥相關(guān)基因IL-6、IL-8啟動(dòng)子的結(jié)合，進(jìn)而抑制IL-6及IL-8的表達(dá)。另外，lncRNA也可與其他調(diào)節(jié)RNA如miRNA相互作用調(diào)控炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。如lncRNA SNHG5能競(jìng)爭(zhēng)性抑制miR-132與靶基因的結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控人氣道上皮細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6及TNF-a等基因的表達(dá)[8]。Zhou等[9]發(fā)現(xiàn)，MALAT1可通過(guò)miR-590促進(jìn)STAT3介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-8及TNF-α等的表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。

應(yīng)用測(cè)序技術(shù)，在雞肌肉、脂肪細(xì)胞、卵泡及肝臟中鑒定出大量lncRNA[10-13]。有關(guān)禽類的研究提示，lncRNA在調(diào)節(jié)脂肪代謝[14-15]、肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化[16]、成肌細(xì)胞增殖分化[17]等生物過(guò)程中發(fā)揮著調(diào)控作用。另外，病毒感染也會(huì)引起病雞lncRNA表達(dá)的差異。如禽白血病病毒可引起雞胚成纖維細(xì)胞36個(gè)lncRNA差異表達(dá)，且其表達(dá)與Stat1、Tlr3、IRF1等免疫相關(guān)基因的表達(dá)水平具有相關(guān)性[18]。Han等[19]研究也發(fā)現(xiàn)，馬立克氏病病毒感染雞CD4+T細(xì)胞能夠促進(jìn)lncRNA GALMD3的表達(dá)，應(yīng)用shRNA下調(diào)GALMD3的表達(dá)后，CD4+細(xì)胞中與線粒體結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞周期相關(guān)的大量基因表達(dá)受到影響。另外，禽傳染性支氣管炎病毒及傳染性法氏囊病病毒感染都會(huì)導(dǎo)致病雞相關(guān)組織和細(xì)胞中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜的變化，且差異表達(dá)lncRNA與細(xì)胞內(nèi)的先天性免疫反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過(guò)程相關(guān)[20-21]。上述結(jié)果提示，lncRNA在雞先天性免疫反應(yīng)中可能發(fā)揮了重要調(diào)控功能。

我國(guó)是肉雞養(yǎng)殖大國(guó)，在養(yǎng)殖過(guò)程中，飼養(yǎng)環(huán)境中的細(xì)菌如大腸桿菌、沙門氏菌等，常引起肉雞機(jī)體發(fā)生系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的成分，可以通過(guò)模式識(shí)別受體TLR4誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，而其對(duì)肉雞各組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)的影響尚不清楚。本研究以肉雞為對(duì)象，探討LPS誘導(dǎo)的肉雞系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)中l(wèi)ncRNA在肌肉、肝臟、脾臟中的表達(dá)情況，并分析其與促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-6基因表達(dá)的相關(guān)性，旨在為后續(xù)研究特定lncRNA在肉雞炎癥反應(yīng)中的功能提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

新生Ross肉雞，購(gòu)自河南鶴壁大用牧業(yè)有限公司，自由飲水、采食，按照標(biāo)準(zhǔn)飼喂條件飼養(yǎng)于同一環(huán)境。大腸桿菌026:B6源LPS (L2654)，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；總RNA提取試劑盒(TRIzol Reagent，15596026)，購(gòu)自Invitrogen；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(R211-01)，購(gòu)自Vazyme；SYBR Green Master Mix，購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 LPS誘導(dǎo)炎癥模型的建立

取飼喂至21日齡的Ross肉雞10只，稱質(zhì)量，隨機(jī)平均分成LPS組和對(duì)照組(CK)。LPS組腹腔注射LPS，劑量為0.5 mg/kg(使用生理鹽水配制LPS，質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，依照體質(zhì)量計(jì)算每只雞的注射體積)；對(duì)照組腹腔注射相應(yīng)體積的生理鹽水。注射后2 h采集腿肌、肝臟和脾臟，備檢。

1.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

分別取肌肉、肝臟和脾臟，于液氮中研磨，按照TRIzol試劑盒說(shuō)明書提取總RNA,用DNase Ⅰ處理消除基因組DNA污染；應(yīng)用變性膠分析，確?？俁NA無(wú)降解；使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。取2 μg處理后的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所得cDNA于-20 ℃保存，備用。

1.4 肉雞各組織中IL-1β和IL-6基因mRNA表達(dá)的檢測(cè)

選擇β-actin作為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-time PCR，RT-qPCR) 檢測(cè)IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)變化。根據(jù)GenBank上雞的相關(guān)cDNA序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)IL-1β、IL-63和β-actin的引物(表1)，引物由上海SangonBiotech公司合成。

表1 供試引物序列Table 1 Nucleotide sequences of specific primers

反應(yīng)體系總體積為10 μL：10倍稀釋的樣品cDNA 2 μL、SYBR Green Real-time PCR Master Mix 5 μL、無(wú)菌雙蒸水2 μL、目的基因上下游引物(濃度為1 μmol/L)各0.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)36次。采用2-ΔΔCt法分析結(jié)果。以CK組為基準(zhǔn)，確定LPS組IL-1β、IL-6基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 lncRNA表達(dá)的檢測(cè)

依據(jù)已報(bào)道的數(shù)據(jù)[10-11]，選擇肉雞14個(gè)高表達(dá)lncRNA為備檢RNA，以β-actin為內(nèi)參基因，應(yīng)用RT-qPCR分別檢測(cè)肌肉、肝臟、脾臟中14種lncRNA的表達(dá)變化。根據(jù)GenBank上雞的相關(guān)cDNA序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)14個(gè)lncRNA的引物(表1)，引物由上海SangonBiotech公司合成。RT-qPCR反應(yīng)條件及數(shù)據(jù)分析方法如1.4所述。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 17.0 for Windows軟件進(jìn)行。所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”的形式表示,差異顯著性檢驗(yàn)使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用雙變量Pearson相關(guān)性分析。P<0.05表示有顯著差異，P<0.01表示有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS對(duì)肉雞IL-1β和IL-6基因mRNA表達(dá)的影響

如圖1所示，LPS組肉雞肌肉、肝臟及脾臟中IL-1β和IL-6基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于CK組(P<0.01)。

圖柱上標(biāo)*和**分別表示LPS組與CK組之間有顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)差異。圖2，3，4同 * and ** indicate significant (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01) between LPS group and CK group, respectively.The same forFigures 2,3 and 4

2.2 LPS對(duì)肉雞不同組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)的影響

2.2.1 肌 肉 檢測(cè)了肌肉中14種lncRNA的表達(dá)，其中l(wèi)nc0239、TCO619和TCO924未檢測(cè)到；另外11種lncRNA檢測(cè)結(jié)果(圖2)顯示，與CK組相比，LPS組lnc0035和TCO873的相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，lnc0181的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，lnc0119的相對(duì)表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)，lnc0151的相對(duì)表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，其他lncRNA的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著變化。

2.2.2 肝 臟 檢測(cè)了肝臟中14種lncRNA的表達(dá)，其中l(wèi)nc0239未檢測(cè)到；另外13種lncRNA檢測(cè)結(jié)果(圖3)顯示，與CK組相比，LPS組lnc0035、lnc0181、TCO354和pouBW1的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，lnc0202和TCO873的相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，lnc0151的相對(duì)表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，lnc0119、TCO501和lncDHCR24的相對(duì)表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)，其他lncRNA的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著變化。

2.2.3 脾 臟 檢測(cè)了脾臟中14種lncRNA的表達(dá)，其中TCO924未檢測(cè)到；另外13種lncRNA檢測(cè)結(jié)果(圖4)顯示，與CK組相比，LPS組lnc0181、lnc0202、TCO619和TCO873的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，lnc0035和lncDHCR24的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，lnc0119和lnc0128的相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，其他lncRNA的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著變化。

圖2 LPS對(duì)肉雞肌肉組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)的影響(n=5)Fig.2 Effect of LPS on expression of lncRNAs in broiler muscle tissue (n=5)

圖3 LPS對(duì)肉雞肝臟組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)的影響(n=5)Fig.3 Effect of LPS on expression of lncRNAs in broiler liver tissue (n=5)

圖4 LPS對(duì)肉雞脾臟組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)的影響(n=5)Fig.4 Effect of LPS on expression of lncRNAs in broiler spleen tissue (n=5)

2.3 lncRNA表達(dá)與IL-1β以及IL-6基因表達(dá)的相關(guān)性

2.2節(jié)的結(jié)果顯示，與CK組相比，LPS組lnc0035、lnc0119、lnc0181、TCO873在肌肉、肝臟、脾臟中的表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著差異，故本試驗(yàn)進(jìn)一步分析了其表達(dá)量與IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)量的相關(guān)性。結(jié)果(表2)顯示，在肌肉中，除lnc0035與IL-6 mRNA表達(dá)量無(wú)顯著相關(guān)性外，其他3個(gè)lncRNA均與IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)量顯著相關(guān)，其中l(wèi)nc0119與2個(gè)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)均呈顯著負(fù)相關(guān)，其他lncRNA與2個(gè)促炎細(xì)胞因子基因mRNA表達(dá)量均顯著或極顯著正相關(guān)。在肝臟中，lnc0035與TCO873與IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)量均呈顯著正相關(guān)，其他lncRNA與2個(gè)促炎細(xì)胞因子基因mRNA表達(dá)量均無(wú)顯著相關(guān)性。在脾臟中，lnc0035、lnc0119與IL-6 mRNA表達(dá)量分別呈顯著和極顯著負(fù)相關(guān)，lnc0181與IL-6 mRNA表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，TCO873與IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)量均呈極顯著正相關(guān)。

表2 肉雞肌肉、肝臟以及脾臟中l(wèi)ncRNA與IL-1β、IL-6基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性Table 2 Correlation between relative expression of lncRNA with IL-1β and IL-6 mRNA in muscle,liver,and spleen of broilers

3 討 論

LPS是革蘭氏陰性菌外膜特有的成分，被廣泛用于激活先天免疫，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。LPS可通過(guò)TLR4途徑誘導(dǎo)細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子大量表達(dá)，其中以IL-1β和IL-6最為典型。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS處理2 h后肉雞肌肉、肝臟及脾臟組織中IL-1β和IL-6基因的mRNA表達(dá)水平均極顯著上調(diào)，表明LPS誘導(dǎo)急性系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的成功。促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6主要是由激活的巨噬細(xì)胞以及一些非免疫細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等在受到損傷或病原入侵時(shí)大量表達(dá)[22]。作為局部炎癥反應(yīng)的主要刺激物，這些細(xì)胞因子能夠招募其他免疫細(xì)胞到達(dá)炎癥部位，對(duì)機(jī)體抵抗感染具有保護(hù)作用。但是促炎細(xì)胞因子的過(guò)度表達(dá)則可能導(dǎo)致組織的損傷、延遲受損組織的恢復(fù)，因此其表達(dá)須受到嚴(yán)格調(diào)控。

lncRNA雖不能編碼蛋白，但大量的研究已證實(shí)其可作為調(diào)節(jié)性RNA (regulatory RNA)在基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用，且lncRNA可通過(guò)RNA-RNA、RNA-蛋白以及RNA-DNA互作等多種方式發(fā)揮作用，可正向或反向調(diào)控靶基因的表達(dá)。大量的研究表明，通過(guò)以上機(jī)制lncRNA在機(jī)體先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。如小鼠lincRNA-Cox2能夠促進(jìn)脂蛋白(Pam3CSK4)誘導(dǎo)的Ccl5、IRF7、Stat3等基因表達(dá)，同時(shí)抑制IL-10、IL-1β、IL-12等基因的表達(dá)[6]。應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，禽白血病病毒、傳染性法氏囊病病毒、禽傳染性支氣管炎病毒以及馬立克氏病病毒都能夠引起雞相應(yīng)組織細(xì)胞如T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及法氏囊組織中大量lncRNA表達(dá)的變化[18-21]。本研究利用LPS誘導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)，檢測(cè)肉雞多個(gè)組織中l(wèi)ncRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示LPS組試驗(yàn)雞的lnc0035、lnc0119、lnc0181和TCO873 4種lncRNA在3種組織中的表達(dá)量與CK組存在顯著或極顯著差異，其中l(wèi)nc0181和TCO873在3個(gè)組織中表達(dá)量均顯著或極顯著升高；lnc0119的表達(dá)量均極顯著降低；而lnc0035在肌肉和肝臟中的表達(dá)量分別極顯著和顯著升高，在脾臟中的表達(dá)量顯著降低。另外，LPS組試驗(yàn)雞的lnc0151、lnc0202、lncDHCR24表達(dá)量在2種組織中與CK組存在顯著或極顯著差異。這樣高比例的差異表達(dá)lncRNA的出現(xiàn)提示，lncRNA在雞炎癥反應(yīng)中可能發(fā)揮了重要調(diào)控作用。另外通過(guò)比較同一lncRNA在不同組織中的表達(dá)量可以發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中，lncRNA的表達(dá)具有組織差異性，提示其在不同組織中的功能可能有差異。

聚焦lncRNA在免疫反應(yīng)中的調(diào)控功能的相關(guān)研究證實(shí)，lncRNA能夠通過(guò)多種機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)。如小鼠巨噬細(xì)胞中，lncRNA THRIL能夠與異源核糖核蛋白L(heterogenous nuclear ribonucleoprotein L,hnRNPL)結(jié)合形成RNA-蛋白復(fù)合物，結(jié)合到TNFα啟動(dòng)子上促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄[23]。人肝癌細(xì)胞系中，lncRNA DILC能夠直接結(jié)合到IL-6啟動(dòng)子上促進(jìn)其表達(dá)[24]；而在人成纖維樣滑膜細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞中，DILC能夠抑制IL-6的表達(dá)[25-26]。同樣，lncREN MALAT1也被證實(shí)在不同的細(xì)胞中對(duì)IL-6的調(diào)控作用不同，如MALAT1在小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中能夠促進(jìn)IL-6的表達(dá)，而在小鼠軟骨細(xì)胞中能抑制IL-6的表達(dá)[27]。本研究的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，盡管LPS組試驗(yàn)雞4種lncRNA在肌肉、肝臟及脾臟中的表達(dá)量與CK組存在顯著或極顯著差異，但只有TCO873與IL-1β和IL-6基因mRNA的表達(dá)量在3個(gè)組織中均呈顯著或極顯著正相關(guān)，而其他lncRNA與兩種促炎細(xì)胞因子表達(dá)的相關(guān)性都表現(xiàn)出組織特異性。這些結(jié)果提示，lncRNA的功能在不同的細(xì)胞及組織中具有特異性，這些lncRNA在不同組織細(xì)胞中是否直接或間接調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，還需要進(jìn)一步應(yīng)用多種分子生物學(xué)手段來(lái)探究。