劉文煒 龍?zhí)烀?白維薇

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550001；2.貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550002

杞明眼保膠囊由丹參、墨旱蓮、決明子等十五味中藥制成，內(nèi)容物為黃棕色的粉末，味微苦。具有清肝養(yǎng)肝、滋腎明目的功效，能促進(jìn)視網(wǎng)膜的修復(fù)，對(duì)近視[1]、視疲勞、眼底血管病變、眼底視網(wǎng)膜病變有很好的療效[2]。對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提升，使得用藥安全、有效。在中醫(yī)學(xué)理論中，人體是一個(gè)有機(jī)的整體，無(wú)論在結(jié)構(gòu)上還是在功能上，機(jī)體內(nèi)部臟腑與形體官竅之間，都是相互聯(lián)系且不可分割的[3-4]?！吨T病源候論》曰 ： “ 勞傷臟腑，肝氣不足，兼受風(fēng)邪，是精華之氣衰弱，故不能遠(yuǎn)視?！薄秾徱暚幒吩唬?“ 肝經(jīng)不足腎經(jīng)病，光華咫尺視模糊?！?肝腎兩虛，或過用目力，耗氣傷血均可致目中神光不能發(fā)越于遠(yuǎn)處，故見近視。

杞明眼保膠囊中的墨旱蓮屬于補(bǔ)虛藥[5]。臨床用于肝腎陰虛，牙齒松動(dòng)，虛發(fā)早白，眩暈耳鳴[6]。中醫(yī)中辨證論治，近視屬于肝腎兩虧證，可滋補(bǔ)肝腎以治療，墨旱蓮主入肝腎，善能滋補(bǔ)肝腎之陰，可與女貞子同用[7]。女貞子(補(bǔ)虛藥)，甘、苦、涼，歸肝、腎經(jīng)，具補(bǔ)肝腎陰、退虛熱、明目的功效,用于肝腎陰虛證、陰虛內(nèi)熱證、目疾。女貞子中的大量成分屬于三萜類，其中含量最高的是齊墩果酸，市場(chǎng)上齊墩果酸的主要來(lái)源也來(lái)自于女貞子[8]。丹參屬活血化瘀藥，苦、微寒，歸心、肝經(jīng)，有活血祛瘀、涼血消癰、除煩安神、調(diào)經(jīng)止帶[9]的功效,用于瘀血證、瘡瘍癰腫、熱入營(yíng)血心煩不眠。

1 儀器與材料

1.1 儀器 JY20002天平(上海良平儀器儀表有限公司)，2F-2三用紫外分析儀(上海市安亭電子儀器廠)，KQ-500DE超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)，Waters E 2695 高效液相色譜儀(美國(guó)waters公司)，MS105DU十萬(wàn)分之一分析天平(梅特勒托利多儀器上海有限公司)。

1.2 材料 石油醚(60～90 ℃)、乙酸乙酯、甲酸、氯仿、苯、正己烷、丙酮皆為國(guó)產(chǎn)分析純；丹酚酸B對(duì)照品(批號(hào)： 111562-200504)，乙腈(色譜純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 墨旱蓮藥材的TLC鑒別 取3個(gè)批次的杞明眼保寶膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，各取5 g，加甲醇30 mL超聲(功率140 w，頻率42 KHz )處理30 min，放冷，過濾，濾液水浴揮干，殘?jiān)?.1%鹽酸溶液2 mL超聲使溶解完全，轉(zhuǎn)移至具塞試管中，加1 mL乙酸乙酯充分振搖，靜至分層，取乙酸乙酯層為供試品。另取缺墨旱蓮陰性樣品，照供試品制備方法即得缺墨旱蓮陰性樣品。另取墨旱蓮對(duì)照藥材0.3 g于具塞試管，加甲醇1 mL超聲處理30 min，上清液即為對(duì)照藥材溶液。按照2015 年版《中國(guó)藥典》(四部)中 TLC 法[9]，吸取上述溶液 5～8μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 G 薄層板上，以展開劑氯仿∶丙酮∶乙酸乙酯∶甲酸(10∶2∶2∶0.5),展開，取出，晾干，于紫外燈365 nm下檢視，供試品和墨旱蓮對(duì)照藥材相應(yīng)位置處顯相同的熒光斑點(diǎn)，且陰性樣品無(wú)干擾。如圖1所示。

1.缺墨旱蓮陰性；2.杞明眼保膠囊供試品(20181101)；3.杞明眼保膠囊供試品(20181102)；4.杞明眼保膠囊供試品(20181103)；5.墨旱蓮對(duì)照藥材圖1 墨旱蓮TLC圖譜

2.2 丹參藥材的TLC鑒別 取3個(gè)批次的杞明眼保寶膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，各取1 g，加甲醇30 mL超聲(功率140 w，頻率42 KHz )處理30 min，放冷，過濾，濾液水浴揮干，殘?jiān)?.1%鹽酸溶液2 mL超聲使溶解完全，轉(zhuǎn)移至具塞試管中，加1 mL乙酸乙酯充分振搖，靜至分層，取乙酸乙酯層為供試品。另取缺丹參陰性樣品，照供試品制備方法即得缺丹參陰性樣品。另取丹參對(duì)照藥材0.1 g于具塞試管，加甲醇1 mL超聲處理30 min，上清液即為對(duì)照藥材溶液。以展開劑氯仿∶丙酮∶乙酸乙酯∶甲酸(10∶7∶5∶1),展開，取出，晾干，于氨蒸汽缸中顯色5 min，立即紫外燈365 nm檢視，供試品和對(duì)照藥材相應(yīng)位置處顯相同的熒光斑點(diǎn)，且陰性樣品無(wú)干擾。如圖2所示。

注： 1.缺丹參陰性；2.杞明眼保膠囊供試品(20181101)；3.杞明眼保膠囊供試品(20181102)；4.杞明眼保膠囊供試品(20181103)；5.丹參對(duì)照藥材圖2 丹參TLC圖譜

2.3 丹參藥材中丹酚酸B的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱： Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相： 0.03 moL/L磷酸二氫鉀-乙腈(70∶30)；流速： 1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)： 364 nm，柱溫： 20 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 稱取丹酚酸B對(duì)照品適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇-水(8∶2)溶液溶解并定容至刻度，制成748 μg/mL溶液，精密吸取1 mL于5 mL量瓶?jī)?nèi)，加甲醇-水(8∶2)定容至刻度，即得149.6 μg/mL的對(duì)照品溶液。分別制備不同濃度的丹酚酸B對(duì)照品溶液37.4 μg/mL、4.8 μg/mL、149.6 μg/mL、299.2 μg/mL、374.0 μg/mL。

2.3.3 供試品溶液的制備 取杞明眼保膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，置具塞瓶?jī)?nèi)，精密加入甲醇-水(8∶2)溶液20 mL，稱定重量，超聲(功率140 w，頻率42 KHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇-水(8∶2)補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得供試品溶液。

2.3.4 陰性樣品溶液的制備 取處方量的1/10，按照杞明眼保膠囊處方工藝，制備缺丹參藥材的陰性樣品，再按照“ 2.3.3”項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.3.5 專屬性考察 分別取對(duì)照品溶液(149.6 μg/mL)、供試品溶液(批號(hào)： 20181101)和陰性樣品溶液，按照“ 2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，陰性樣品對(duì)丹酚酸B的含量測(cè)定無(wú)干擾，理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)不低于3000。如圖3所示。

圖3 高效液相色譜圖

2.3.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“ 2.3.2”項(xiàng)下的系列對(duì)照品溶液，按照“ 2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。各樣品平行進(jìn)樣2次。以峰面積的平均值為縱坐標(biāo)(y)、進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(x，ng)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為y=4945.8x- 39483。結(jié)果顯示，丹酚酸B檢測(cè)進(jìn)樣量的線性范圍為37.4～374.0 μg/mL，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。

2.3.7 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取質(zhì)量濃度為149.6 μg/mL的對(duì)照品溶液，按照“ 2.3.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)測(cè)定峰面積6次。結(jié)果，峰面積的 RSD為0.55%(n=6)，表明儀器的精密度良好。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取杞明眼保膠囊0.2g(批號(hào)： 20181101)，共 6 份，按照“ 2.3.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按照“ 2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。結(jié)果，丹酚酸B的平均含量為 3.6690mg/g，RSD 為 1.17%(n=6)，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“ 2.3.8”項(xiàng)下的供試品溶液(批號(hào)： 20181101)，分別于室溫下放置 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h時(shí)按照“ 2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，丹酚酸B峰面積的RSD為0.46%(n=5)，表明該溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取杞明眼保膠囊粉末0.2 g(批號(hào)： 20181101)，共6份，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入丹酚酸B對(duì)照品(90.3 μg/mL)25 mL，然后按照“ 2.3.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按照“ 2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.11 含量限度 精密稱取批號(hào)為20181101-20181110的杞明眼保膠囊0.2g，共20份(每個(gè)批次2份)，按照“ 2.3.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按照“ 2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。再按照2015年版藥典丹參藥材項(xiàng)下丹酚酸B的含量測(cè)定方法，測(cè)定丹參藥材的含量，計(jì)算平均轉(zhuǎn)移率為44.73%，得出杞明眼保膠囊中丹酚酸B含量限度為4.3452 mg/g，即每粒(一個(gè)處方量制成1000粒膠囊，0.4 g/粒，)含丹參以丹酚酸B(C36H30O16)計(jì)不得少于1.74 mg。

3 討論

3.1 TLC鑒別條件的選擇 提取方法的選擇： 選用過甲醇、乙醇、乙酸乙酯為溶劑直接進(jìn)行提取，斑點(diǎn)復(fù)雜，無(wú)法分離，最后采用醇提，再用水溶后萃取的方式，斑點(diǎn)清晰，雜質(zhì)較少。

展開劑的選擇： 曾選用苯-正己烷-石油醚(60-90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸=2.5∶2.5∶1∶3.5∶1，苯-正己烷-石油醚(60-90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸=2.5∶2.5∶1∶3.5∶1，氯仿-丙酮-乙酸乙酯-甲酸=10∶2∶2∶0.5等展開劑，最終確定墨旱蓮開展劑為氯仿-丙酮-乙酸乙酯-甲酸=10∶2∶2∶0.5，丹參展開劑為氯仿-丙酮-乙酸乙酯-甲酸=10∶7∶5∶1。

3.2 丹酚酸B的限度確定 丹參中丹酚酸B是水溶性成分[10]，按2015版《中國(guó)藥典》規(guī)定，干燥丹參中丹酚酸B的含量不得少于3.0%。丹酚酸B為一分子咖啡酸與三分子丹參素縮合而成，是丹參中含量最高的酚酸類成分[11]，有抗脂質(zhì)過氧化、消除自由基和抗血栓的作用[12]。本品采用藥典條件進(jìn)行丹酚酸B的含量測(cè)定條件。

分別收集了10個(gè)不同產(chǎn)地和批次的丹參藥材，分別按照工藝方法制備成10個(gè)批次的杞明眼保膠囊，在測(cè)定含量，計(jì)算平均轉(zhuǎn)移率，在初步計(jì)算含量限度，后期會(huì)進(jìn)一步探索研究更多批次樣品的含量測(cè)定，從而保證限度制定的合理性。

本研究成功建立了杞明眼保膠囊中墨旱蓮、丹參藥材的鑒別方法和丹參藥材中丹酚酸B的含量測(cè)定方法。該品含丹參以丹酚酸B(C36H30O16)計(jì)不得少于1.74 mg/粒。

本研究建立了杞明眼保膠囊中丹參、墨旱蓮的TLC鑒別方法，并對(duì)所建方法進(jìn)行了較全面的方法學(xué)考察，同時(shí)也對(duì)杞明眼保膠囊中丹酚酸B的含量測(cè)定進(jìn)行了研究，為本品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供了依據(jù)，有利于本品的質(zhì)量控制。